Sviluppo di linee organoidi derivate da topi da cellule epiteliali delle tube di Falloppio per la modellazione del carcinoma ovarico sieroso di alto grado

Quindi sì, attualmente stiamo lavorando allo sviluppo di nuovi modelli di carcinoma sieroso dell'ovarico di alto grado, modelli che sono sintegici nel senso che il protocollo descrive. Prendiamo le tube di Falloppio sane da topi sani e poi le deriviamo come organoidi nella piastra di Petri e poi attribuiamo loro tutti i diversi errori o modifiche genetiche che normalmente troveremmo in una versione umana normale della malattia. Ora, questo è molto interessante perché da un lato puoi studiare tutti i tipi di fattori intrinseci di questi tumori all'interno della piastra di Petri come organoidi, che sono più realistici rispetto alle colture tradizionali 2D.

Ma il fatto è che, dato che ci sono modelli sintetici, puoi prendere questi organoidi e poi rimetterli in un topo, e poi vedere come il tumore si sviluppa e interagisce con l'ospite. Questo ci permette di avere una visione molto più olistica di come avviene effettivamente un tumore e la tumorigenesi, sperando che ci dia strumenti molto migliori e una comprensione molto più approfondita di come funziona questa malattia e come combatterla meglio. Per cominciare, ottenete femmine di topi 6J neri C57 soppressi.

Rimuovere ovaio e tuba di Falloppio e trasferirli in una piastra di Petri sterile contenente DMEM, integrata con penicillina streptomicina a quattro gradi Celsius. Usa un microscopio dissezionale, pinze fini e forbici per rimuovere il grasso residuo dall'ovaio. Isolare la tuba di Falloppio, inclusi l'infundibolo e parte dell'ampolla distale, dall'ovaio e dall'utero.

Ora trasferisci il tessuto pulito in un tubo contenente l'intera miscela digerente. Con un paio di forbici fine, trita la tuba di Falloppio in pezzi più piccoli di 0,5 millimetri. Poi incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 40-50 minuti prima di eseguire la coltivazione dell'organoide.

Per sviluppare il modello del tumore del muro, è stato impostato cinque iniezioni, ciascuna contenente quattro milioni di cellule risospese in Opti-MEM I non integrato, una matrice di membrana basale gelida. Per preparare le iniezioni, si espellono prima le bolle d'aria dal volume morto di una siringa di insulina U-100 dotata di ago calibro 28 utilizzando PBS freddo. Poi carichi lentamente la siringa con 40 microlitri di cellule e tieni le siringhe cariche sul ghiaccio finché i topi non saranno anestetizzati.

Una volta pronte per l'iniezione, posizionare le siringhe accanto a una lampada riscaldante per permettere alla matrice della membrana del basamento di riscaldarsi e aumentare la viscosità, facilitando l'iniezione e l'ingerto. Successivamente, metti un topo in una gabbia preriscaldata sotto una lampada riscaldante per prepararti all'intervento. Fai un'incisione a meno di un centimetro lungo il fianco, sopra la coscia di un topo anestetizzato.

Taglia l'epidermide e l'ipoterma per raggiungere la zona della borsa. Estrai delicatamente l'ovaio trovando il cuscinetto adiposo attaccato. Poi, utilizzando una siringa pronta, iniettare cellule attraverso il cuscinetto adiposo e l'ovaio nel sacco ovidotto.

Riporta con cura l'ovaio nella borsa. Chiudi lo strato muscolare usando suture non intrecciate. Successivamente, chiudi l'incisione cutanea usando graffette chirurgiche.

Rimetti il topo nella gabbia riscaldata e mantieni la temperatura corporea con una lampada riscaldante fino a diventare semi-cosciente, di solito per più di 15 minuti. Gli organoidi derivati dall'epitelio della tuba di Falloppio murino hanno una forma sferica ben definita e trasparente dopo circa cinque giorni e richiedono l'imballaggio intorno al giorno 10-12. Gli organoidi di tipo selvatico vengono trasformati in tumoroidi precancerosi utilizzando tecniche di ingegneria genetica, come la sovraespressione genica lentivirale o retrovirale.

Le singole linee cellulari clonate derivate dagli organoidi geneticamente modificati possono essere ulteriormente studiate in vivo tramite iniezione nella bursa ovarica. I tumori raggiungono tipicamente una dimensione di due o tre centimetri intorno ai 60 giorni dall'iniezione. Beh, diciamo davvero, come ho già detto, che il vantaggio più grande che, sai, il modo in cui funziona questo protocollo, ovviamente, è generare questi modelli singeneici, giusto?

E quindi, dato che sono sintetiche, come ho detto prima, puoi davvero apprezzare tutta l'interazione tra, sai, un animale completo, un topo completo, sai, e il tumore che stai sviluppando mentre hai, sai, il controllo totale sulla genetica del tumore. Quindi, ovviamente, rispetto ad altri modelli dove forse si cerca di capire il sistema immunitario all'interno della piastra di Petri, sarà molto difficile replicare il sistema immunitario nella piastra di Petri. Oppure, se si prendono dei PDX, cioè campioni di tumori di pazienti che poi si inseriscono nei topi, affinché funzioni, i topi non possono avere un sistema immunitario, altrimenti rifiuteranno questo tumore, giusto?

Ma poiché questo modello è singeneico, si può davvero apprezzare l'intera interazione dell'intero ospite con il tumore e in particolare con il sistema immunitario, che al momento è uno degli ambiti di ricerca più caldi nel settore. Quindi penso davvero che questo sia il vantaggio più importante di questo protocollo rispetto ad altri protocolli che si trovano altrove. In realtà, abbiamo già usato questi modelli per indagare alcuni fenomeni molto interessanti.

Direi che quello che mi interessa di più in questo momento è come il sistema immunitario adattativo, da quello che abbiamo visto, sembri essere un contributore importante nella modellazione delle proprietà genomiche, in particolare le variazioni del numero di copie dei carcinomi serosi dell'ovarico di alto grado, nel senso che, se il sistema immunitario non è presente, sembra che in realtà questi tumori non sviluppino riarrangiamenti così massici e complessi del DNA. Quindi stiamo cercando di capire come ciò accade e come, si spera, di invertire la situazione per potenziare qualsiasi tipo di terapia immunitaria contro di esso.