Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala
26 gennaio 2024
Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.
Il cervello umano è un organo complesso che abbraccia diverse abilità. Per comprenderne la funzionalità, è essenziale costruire un sensore cellulare dettagliato in tutto il cervello. Il nostro protocollo di routine ad alto rendimento consente l'analisi della citoarchitettura 3D di aree volumetriche del cervello umano con risoluzione micrometrica, consentendone la caratterizzazione strutturale.
La ricostruzione volumetrica di vaste aree del cervello umano presenta diverse sfide sperimentali legate alle dimensioni massicce dei campioni cerebrali, alla complessa composizione biologica, alle condizioni variabili di fissazione e conservazione post-mortem e ai segnali di autofluorescenza provenienti da pigmenti di tipo lipofuscina. Tutto ciò può compromettere l'efficienza di pulizia ottica e la dimostrazione della qualità. Rispetto ad altre tecniche di clearing, il metodo di trasformazione dei tessuti corti combinato con l'imaging al microscopio a foglio di luce può essere utilizzato per l'elaborazione rapida e simultanea di più sezioni del cervello umano.
Questi si traducono in una ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo ad alto rendimento per la chiarificazione ottica simultanea, l'etichettatura multiplo, e la ricostruzione volumetrica tridimensionale di sezioni cerebrali umane post mortem. Integrando la tecnica S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol (TDE) SHORT con la microscopia a foglio luminoso a fluorescenza, la metodologia consente una caratterizzazione strutturale dettagliata con risoluzione micrometrica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Istologia
- Immunoeistochemia
Sfondo
- Il cervello umano è un organo complesso che richiede un'esame intricato su diverse scale.
- Le sfide includono la gestione di campioni cerebrali di grandi dimensioni e segnali autofluorescenti provenienti da pigmenti.
- Il protocollo presentato affronta le carenze delle tecniche di chiarificazione esistenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplificato per l'analisi della struttura del cervello umano.
- Migliorare l'efficienza della chiarificazione ottica e la qualità dell'immagine di sezioni di tessuto cerebrale.
- Permettere la ricostruzione 3D con elevata dettaglio e affidabilità.
Metodi Utilizzati
- Lo studio impiega la microscopia a foglio luminoso con fluorescenza.
- Il tessuto cerebrale umano viene utilizzato come modello biologico, con indicazioni dettagliate per la sezionatura e le fasi di elaborazione.
- I passaggi chiave includono l'inclusione dei campioni in agarosio, l'elaborazione con TDE e l'immunomarcatura multiplo per diversi marcatori neuronali.
- I tempi e le temperature di incubazione sono definiti con precisione per garantire condizioni ottimali di chiarificazione e acquisizione delle immagini.
Risultati principali
- Il protocollo consente una chiarificazione ottica efficace e un'acquisizione di immagini di alta qualità della sostanza grigia e bianca.
- La colorazione multiplo consente la visualizzazione di popolazioni neuronali distinte in sezioni cerebrali umane.
- Il metodo dimostra la capacità di catturare dettagli subcellulari in ricostruzioni tridimensionali.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un metodo per l'analisi completa della struttura cerebrale a risoluzione micrometrica.
- L'approccio evidenzia il potenziale per approfondire la comprensione dell'architettura cerebrale e delle sue implicazioni per gli studi neuronali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'acquisizione tridimensionale su larga scala e ad alta risoluzione di tessuto cerebrale umano è fondamentale per promuovere la validazione di bersagli e la comprensione meccanicistica in ambito neurofarmacologico&D. Il protocollo SHORT, combinato con la microscopia a foglio luminoso a fluorescenza, consente un'analisi strutturale rapida e multicanale di sottopopolazioni neuronali sia nella sostanza grigia che in quella bianca. Questa capacità supporta la previsione dell'affidabilità e la riduzione dei rischi in fasi precoci di scoperta e di transizione traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi dettagliata dell'architettura neuronale e il mappaggio delle sottopopolazioni per la validazione degli obiettivi.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico rivelando il contesto citotessiturale nel tessuto cerebrale umano.
- Facilita la selezione del portafoglio fornendo dati strutturali quantitativi ad alto contenuto informativo.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sezioni di tessuto otticamente trasparenti e multietichettate, adatte per flussi di lavoro di imaging quantitativo successivi.
- Standardizza l'elaborazione dei campioni per un imaging e un'analisi riproducibili e ad alto rendimento.
- Consente il rilevamento multiplex di marcatori neuronali, supportando lo sviluppo di saggi robusti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli output di imaging strutturale con l'architettura del cervello umano rilevante per la malattia.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo un'analisi diretta dei tessuti umani.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate ai rischi grazie a dati completi di citotettura tridimensionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un'analisi mediante imaging ad alto rendimento e quantitativa di sezioni cerebrali umane per la validazione di bersagli e studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi attraverso un'analisi dettagliata del mapping neuronale.
- Screening: Fornisce campioni riproducibili e multiplex pronti per l'analisi mediante imaging, destinati all'analisi quantitativa.
- Analisi: Offre dati multicanale con risoluzione subcellulare per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta al lavoro preclinico, sfruttando la diretta rilevanza dei tessuti umani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro scalabile e standardizzato per un uso ripetuto in diversi programmi di neurobiologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli neurobiologici.
- Valore operativo: Fornisce un trattamento dei tessuti e un'acquisizione di immagini standardizzati, scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene la priorizzazione e lo sviluppo di asset neurofarmaceutici con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel processamento dei tessuti, nell'immunomarcatura e nella microscopia avanzata.
- Richiede l'accesso a microscopia a foglio luminoso con fluorescenza e a infrastrutture per l'acquisizione di immagini multicanale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dei campioni e di acquisizione delle immagini.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse regioni cerebrali o condizioni dei tessuti.
- I parametri di manipolazione e incubazione dei campioni devono essere rigorosamente controllati per ottenere risultati ottimali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
