Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

I nostri principali interessi di ricerca si concentrano sulla comprensione del meccanismo dei cicli di vita di trasmissione, nonché sul miglioramento dei metodi diagnostici dei principali patogeni delle api, compresi i parassiti tripanosomatidi. L'avvento di nuove tecniche idrotermali di acidi nucleici, che consentono l'amplificazione esponenziale degli acidi nucleici a temperature costanti, sta rendendo possibile l'individuazione di agenti patogeni senza la necessità di complesse infrastrutture o attrezzature di laboratorio. Nel nostro campo dell'identificazione e selezione di bersagli molecolari per il rilevamento di agenti patogeni, utilizziamo l'RPA isotermico combinato con CRISPR-Cas12a per una diagnostica molecolare rapida, sensibile e portatile.

Le sfide attuali includono l'ottimizzazione della sensibilità e della specificità di un sito, la riduzione al minimo dei falsi positivi, la semplificazione della preparazione dei campioni e lo sviluppo di ruoli, dispiegabili, diagnostici, adattabili a diversi agenti patogeni e condizioni. Abbiamo affrontato la necessità di un metodo rapido, semplice e adattabile sul campo per rilevare i patogeni delle api, superando i limiti della diagnostica molecolare tradizionale. Per iniziare, procurati un'ape anestetizzata.

Con un bisturi sterile, sezionare l'addome dell'ape. Trasferire il tessuto sezionato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 400 microlitri di tampone HotSHOT al tubo, quindi utilizzare un pestello usa e getta per macerare accuratamente il tessuto.

Agitare il tubo per omogeneizzare ulteriormente il tessuto. Quindi, incubare la provetta in un blocco riscaldante impostato a 95 gradi Celsius per 10 minuti per lisare le cellule. Dopo l'incubazione, trasferire immediatamente la provetta sul ghiaccio per raffreddarla.

Neutralizzare la reazione con 400 microlitri di tris-HCL da 40 millimolari, ottenendo una concentrazione finale di 20 millimolari di tris-HCL nella soluzione. Per l'amplificazione isotermica mediante RPA, preparare prima la miscela master in base al numero di reazioni richieste. Utilizzare acqua trattata con dietil pirocarbonato invece della lisi cellulare pronta per l'amplificazione per il controllo negativo e del DNA patogeno per il controllo positivo.

Trasferire 46,5 microlitri della miscela master in provette PCR da 0,2 millilitri. Aggiungere l'acetato di magnesio e il DNA stampo ai tappi di ciascuna provetta PCR in base ai volumi specificati. Centrifugare brevemente le provette per miscelare e avviare la reazione RPA.

Quindi incubare le provette in un termociclatore a 39 gradi Celsius per 40 minuti per eseguire la reazione di amplificazione RPA. In alternativa, incubare i campioni utilizzando provette Eppendorf prive di DNA in un blocco termico. Innanzitutto, preparare una soluzione madre di RNA CRISPR da 100 micromolari.

Ricostituire 10 nanomoli di RNA CRISPR liofilizzato in 100 microlitri di acqua trattata con dietil pirocarbonato. Per preparare una soluzione di lavoro monomolare, mescolare un microlitro del materiale da 100 micromolari con 99 microlitri di acqua trattata con dietil pirocarbonato in un tubo da 0,2 millilitri. Per preparare la soluzione enzimatica Cas12a, diluire la soluzione da 100 micromolari in una soluzione di lavoro monomolare mescolando un microlitro dell'enzima con 99 microlitri del diluente fornito nel kit.

Ora, preparare una soluzione madre da 100 micromolari della sonda FAM risospendendola in un microlitro di acqua trattata con pirocarbonato di dietil per una nanomole di sonda. Per la soluzione di lavoro da 10 micromolari, miscelare 90 microlitri di acqua trattata con DEPC con 10 microlitri di pasta da 100 micromolari. Successivamente, preparare la miscela di reazione CRISPR, escludendo gli ampliconi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Agitare la sospensione per mescolarla bene, quindi distribuirla in provette per PCR. Ora, pipettare quattro microlitri di amplicone RPA in ciascuna provetta. Posizionare le provette in un termociclatore impostato a 37 gradi Celsius e incubare per 120 minuti con fluorescenza registrata ogni minuto.

In alternativa, incubare i campioni utilizzando provette Eppendorf prive di DNA in un blocco termico. Al termine dell'incubazione, trasferire le reazioni in provette da 0,2 millilitri per la visualizzazione utilizzando un sistema di documentazione su gel. Per rilevare la sonda di biotina in un test a flusso laterale, preparare i componenti del test a flusso in una provetta da 1,5 millilitri.

Dopo aver agitato la soluzione, distribuirla in una piastra PCR. Quindi aggiungere quattro microlitri di amplicone nei rispettivi pozzetti. Incubare le provette per PCR a 37 gradi Celsius per 120 minuti utilizzando un termociclatore o un blocco termico senza lettura della fluorescenza.

Quindi trasferire i campioni in provette da 0,2 millilitri. Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di corsa e 10 microlitri della miscela di reazione a ciascuna provetta. Inserire le ImmunoStrips e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Leggi i risultati dopo 10 minuti di immersione. L'amplificazione della ricombinasi polimerasi ha rilevato Lotmaria passim in 16 dei 32 campioni di api, mentre la reazione a catena quantitativa della polimerasi ha identificato solo 12 positivi, dimostrando una maggiore sensibilità del metodo RPA. Il limite di rilevazione della reazione a catena quantitativa della polimerasi era di circa 9,6 parassiti, come mostrato dalla curva di amplificazione con il segnale visibile più basso.

Il limite di rilevamento dell'amplificazione della polimerasi ricombinasi accoppiata a CRISPR-Cas12a corrispondeva a quello del QPCR, rilevando fino a sei picogrammi corrispondenti a 96 parassiti.