Name: Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri un metodo rapido per rilevare patogeni delle api come Lotmaria passim e Nosema ceranae usando RPA e CRISPR/Cas12a. Questa tecnica isotermica migliora la sensibilità diagnostica sul campo.

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<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
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<li>Zattara, E. E., Aizen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+occurrence+records+suggest+a+global+decline+in+bee+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22One+Earth%22%5BJournal%5D)">Worldwide occurrence records suggest a global decline in bee species richness.</a> One Earth. 4 (1), 114-123 (2021).</li>
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<li>Requier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+large-scale+study+reveals+important+losses+of+managed+honeybee+and+stingless+bee+colonies+inLatin+America%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">First large-scale study reveals important losses of managed honeybee and stingless bee colonies inLatin America.</a> Sci Rep. 14 (1), 10079(2024).</li>
<li>Babin, A., Schurr, F., Rivière, M. P., Chauzat, M. P., Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+and+quantification+of+three+microsporidia+infecting+bees%2C+Nosema+apis%2C+Nosema+ceranae%2C+and+Nosema+bombi%2C+using+probe-based+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Protistol%22%5BJournal%5D)">Specific detection and quantification of three microsporidia infecting bees, Nosema apis, Nosema ceranae, and Nosema bombi, using probe-based real-time PCR.</a> Eur J Protistol. 86, 125935(2022).</li>
<li>Cameron, T. C., Wiles, D., Beddoe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+loop-mediated+isothermal+amplification+technologies+for+the+detection+of+honeybee+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of loop-mediated isothermal amplification technologies for the detection of honeybee pathogens.</a> Front Vet Sci. 8, 659683(2021).</li>
<li>Schurr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+of+six+honeybee+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative real-time RT-PCR assays for the detection of six honeybee viruses.</a> J Virol Methods. 270, 70-78 (2019).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+real-time+PCR+for+detection+of+Crithidia+mellificae+and+Lotmaria+passim+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Triplex real-time PCR for detection of Crithidia mellificae and Lotmaria passim in honeybees.</a> Parasitol Res. 117 (2), 623-628 (2018).</li>
<li>D'Alvise, P., Seeburger, V., Gihring, K., Kieboom, M., Hasselmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+dynamics+and+co-occurrence+patterns+of+honeybee+pathogens+revealed+by+high-throughput+RT-qPCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Seasonal dynamics and co-occurrence patterns of honeybee pathogens revealed by high-throughput RT-qPCR analysis.</a> Ecol Evol. 9 (18), 10241-10252 (2019).</li>
<li>Shao, G., Zhu, X., Hua, R., Chen, Y., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+copro-RPA-CRISPR%2FCas12a+assay+to+detect+Echinococcus+granulosus+nucleic+acids+isolated+from+canine+feces+using+NaOH-based+DNA+extraction+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a copro-RPA-CRISPR/Cas12a assay to detect Echinococcus granulosus nucleic acids isolated from canine feces using NaOH-based DNA extraction method.</a> PLoS Negl Trop Dis. 18 (12), e0012753(2024).</li>
<li>Xiao, Y., Fei, D., Li, M., Ma, Y., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+application+of+CRISPR-Cas12a-based+recombinase+polymerase+amplification+and+a+lateral+flow+dipstick+and+fluorescence+for+the+detection+and+distinction+of+deformed+wing+virus+types+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Establishment and application of CRISPR-Cas12a-based recombinase polymerase amplification and a lateral flow dipstick and fluorescence for the detection and distinction of deformed wing virus types A and B.</a> Viruses. 15 (10), 2041(2023).</li>
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<li>Klintschar, M., Neuhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alkaline+lysis+method+for+the+extraction+of+DNA+from+whole+blood+and+forensic+stains+for+STR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alkaline lysis method for the extraction of DNA from whole blood and forensic stains for STR analysis.</a> J Forensic Sci. 45 (3), 669-673 (2000).</li>
<li>Galanis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+foraging+preferences%2C+microbiota+and+pathogens+revealed+by+direct+shotgun+metagenomics+of+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Bee foraging preferences, microbiota and pathogens revealed by direct shotgun metagenomics of honey.</a> Mol Ecol Resour. 22 (7), 2506-2523 (2022).</li>
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<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+SARS-CoV-2+detection+platform+based+on+RT-RPA+and+CRISPR%2FCas12a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a.</a> J Transl Med. 19 (1), 74(2021).</li>
<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+RPA-CRISPR+Cas12a%2FCas13a+rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">One-tube RPA-CRISPR Cas12a/Cas13a rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Anal Chim Acta. 1278, 341757(2023).</li>
<li>Nguyen, L. T., Smith, B. M., Jain, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+trans-cleavage+activity+of+Cas12a+with+engineered+crRNA+enables+amplified+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection.</a> Biochemistry. 59 (17), 1474-1481 (2020).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>Provette Eppendorf da 0,2 mL prive di DNAsi e RNAsi</td><td>Axygen</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 mL prive di DNAsi e RNAsi</td><td>Axygen</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntali filtrati a bassa ritenzione</td><td>LabCliniche</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L puntali filtrati a bassa ritenzione</td><td>LabCliniche</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L puntali filtrati a bassa ritenzione</td><td>LabCliniche</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocco secco Stuart serie BH-200</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Ambicon</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td><td>Biolaboratori del New England</td><td>Codice: M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Pestelli a microprovette</td><td>Fisherbrand</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Milenia</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA kit TwistAmp Liquid Basic</td><td>TwistAmp</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Swann-Morton</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Singola Chanel Pipete PIPETMAN P1000L Micropipetta Espulsione del metallo</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Singola Chanel Pipete PIPETMAN P100L Micropipetta Espulsione del metallo</td><td>Gilson</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>Singola Chanel Pipete PIPETMAN P10L Micropipetta Espulsione del metallo</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento PCR in tempo reale touch</td><td>BioRad</td><td>Pannello CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Liquido di base</td><td>Curva</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento del dna in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema rpa/crispr/cas12a

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

Qui abbiamo descritto un metodo rapido in loco che utilizza la lisi alcalina degli addomi delle api operaie accoppiata all'amplificazione RPA e al rilevamento basato su CRISPR/Cas12a mediante approcci a fluorescenza e/o flusso laterale. Lo schema dell'intero flusso di lavoro è rappresentato nella Figura 3 e lo schema della lisi alcalina HotSHOT dell'adduscolo delle api operaie è nella Figura 4. I risultati rappresentativi del test RPA/CRISPR/Cas12a sono mostrati nella Figura 5. Per rilevare L. passim e N. ceranae, è stato utilizzato un termociclatore per quantificare le unità di fluorescenza relative (RFU) utilizzando una sonda marcata con FAM (Figura 4A). Le reazioni RPA sono state eseguite utilizzando 10 ng di DNA e i dati di fluorescenza sono stati tracciati in un grafico (Figura 4B). Nella fase finale del saggio, i campioni in provette coniche sono stati fotografati utilizzando un sistema di imaging su gel (Figura 4C). Per il rilevamento con una sonda marcata con biotina, i campioni sono stati incubati in un termoblocco (Figura 4A); la soluzione di rivelazione è stata preparata secondo le istruzioni del produttore e applicata su una striscia di flusso laterale (Figura 4B, C). Il metodo ha portato a un rilevamento di successo di entrambi i patogeni delle api.
Per determinare l'efficienza delle reazioni RPA, abbiamo confrontato questo metodo con la qPCR standard utilizzando il DNA purificato dalle api mellifere utilizzando il kit di riferimento (vedere la Tabella dei materiali). Un totale di 32 campioni di api sono stati testati con primer mirati al gene della β-tubulina di L. passim per entrambi i metodi e poi rilevati mediante trans-scissione CRISPR/Cas12a di sonde fluorescenti. In particolare, di conseguenza, 12 campioni sono risultati positivi mediante qPCR, mentre RPA/CRISPR/Cas12a ha rilevato L. passim in 16 campioni (Figura 5A). Ciò indica che le prestazioni della reazione RPA sono più sensibili della PCR, come metodo di amplificazione del DNA gold standard.
Allo stesso modo, abbiamo determinato il limite di rilevamento (LOD) per qPCR e RPA accoppiato al rilevamento CRISPR/Cas12a per il DNA di L. passim come modello patogeno utilizzando diluizioni seriali di DNA di L. passim che vanno da 66 ng a 6 fg. La qPCR ha rilevato un minimo di 6 pg, corrispondenti a circa 96 parassiti (Figura 5B). In confronto, il LOD per l'RPA corrispondeva a 96 parassiti (Figura 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro generale della lisi alcalina HotSHOT accoppiata con l'amplificazione RPA e i metodi di rilevamento Cas12 nelle api. Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
Figura 2: Elaborazione di lisi cellulare pronta per l'amplificazione con tampone HotSHOT. (A) Tagliare l'addome dell'ape con un bisturi e metterlo in una provetta da centrifuga; (B) con un pestello, effettuare una macerazione con 400 μL di HotShot; C) incubare su un termoblocco a 95 °C per 10 minuti; e (D) neutralizzare con 400 μL di Tris-HCl da 40 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
Figura 3: Flusso di lavoro generale per la preparazione dell'enzima Cas12a e delle soluzioni di sonde reporter marcate con FAM e Biotina. Abbreviazioni: DEPC-acqua = acqua trattata con dietil pirocarbonato; crRNA= RNA CRISPR; Cas12 = tipo di proteina associata a CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
Figura 4: Rilevamento di Lotmaria passim e Nosema ceranae. con il metodo CRISPR/Cas12a con sonde FAM e biotina. Per la rilevazione di FAM, (A) i campioni vengono incubati in un termociclatore; (B) le unità di fluorescenza relative (RFU) di L. passim e N. ceranae; (C) visualizzazione degli stessi campioni in un sistema di fotodocumentazione. Nelle prove della biotina, a) un campione in incubazione in un blocco termico; b) i campioni sono stati aggiunti in una striscia immunologica del kit (cfr. la tabella dei materiali); c) i risultati dopo l'incubazione. Abbreviazioni: LP= Lotmaria passim; NC= Nosema ceranae; NTC= nessun controllo modello; RFU: unità di fluorescenza relative <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
Figura 5: Confronto tra qPCR e RPA e limite di rilevamento di Lotmaria passim. (A) Rilevamento di L. passim in campioni di api mellifere utilizzando qPCR e RPA convenzionali. (B) limite di rilevamento qPCR di L. passim utilizzando SsoFast EvaGreen. (C) Limite di rilevamento di L. passim utilizzando CRISPR/Cas12a con una sonda marcata FAM; (D) visualizzazione dello stesso rilevamento CRISPR/Cas12a (da C) sotto un sistema di imaging su gel (riga superiore) e risultati corrispondenti del flusso laterale utilizzando CRISPR/Cas12a con una sonda marcata con biotina (riga inferiore). Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; qPCR= reazione quantitativa della polimerasi a catena. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x tampone di reazione</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (10 mM)</td>
			<td>1,8 mM</td>
			<td>1,8 μl</td>
			<td>9 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x E-Mix di base</td>
			<td>1x</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer in avanti (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer inverso (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Miscela di reazione del nucleo</td>
			<td>1x</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Acqua</td>
			<td>--</td>
			<td>0,7 μl</td>
			<td>3,7 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Componenti Mastermix per RPA con volumi finali di 10 μl e 50 μl e corrispondenti concentrazioni di lavoro:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Reazione da 10 μl</td>
			<td>Reazione da 50 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM di MgOAc</td>
			<td>1,8 mM</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>10-0,1 ng</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Volume di reagenti da aggiungere per campione in una reazione di RPA
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>[Stock]</td>
			<td>[finale]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzima Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda FAM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampone NEB 10x</td>
			<td>10 volte</td>
			<td>1x</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicone RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Concentrazioni di reagenti per ottenere una miscela di rilevazione FAM con il metodo CRISPR/Cas 12a. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>[Stock]</td>
			<td>[finale]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzima Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda per biotina</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampone NEB 10x</td>
			<td>10 volte</td>
			<td>1X</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicone RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 4: Concentrazioni di reagenti per ottenere una miscela di biotina per la rilevazione con il metodo CRISPR/Cas 12a.

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Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a (Video) | JoVE Journal

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

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