Rilevamento rapido e specifico delle infezioni da Acinetobacter baumannii utilizzando un sistema basato su amplificazione della polimerasi ricombinasi/Cas12a

La mia ricerca si concentra sulle malattie respiratorie e sulle infezioni. Affronterò le attuali tecnologie che avanzano in questo campo e le lacune di ricerca dell'intero campo del progetto. Le tecnologie chiave di cui stiamo parlando qui includono il sequenziamento di nuova generazione, CRISPR, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e i modelli di analisi degli organi. Hanno una figura dura per quanto riguarda la diagnostica sulle malattie cardiache standard e trovano un trattamento migliore. Il mio protocollo risponde alla necessità di una rilevazione rapida e specifica dell'Acinetobacter baumannii, superando i limiti delle attuali questioni diagnostiche, come le tecniche lunghe e basate sulla coltura.

[Narratore] Per iniziare, progetta 12 coppie di primer utilizzando strumenti di progettazione di primer basati su principi di progettazione standard. Procurarsi quattro primer in avanti e tre primer in avanti per comporre 12 coppie di primer. Valutare la specificità e l'efficacia di ogni coppia di primer utilizzando lo strumento Primer-BLAST del National Center for Biotechnology Information. Quindi progetta l'RNA CRISPR o l'RNA guida o il gRNA utilizzando la sequenza di scaffold dell'RNA CRISPR LbaCas12a come sequenza fissa. Incorporare un segmento specifico per il bersaglio, assicurandosi che il motivo adiacente al protospaziatore o PAM si trovi all'estremità dei cinque numeri primi del filamento non complementare. Per la costruzione del plasmide ricombinante positivo, amplificare prima il segmento di rDNA 16S di Acinetobacter baumannii utilizzando i set di primer diretti e inversi. Preparare la miscela di reazione PCR da 50 microlitri come indicato sullo schermo. Impostare le condizioni del ciclo PCR sulla macchina PCR. Dopo aver purificato il prodotto positivo alla PCR, clonarlo in un vettore PUC57 che è stato digerito con gli enzimi BamHI e SalI. Diluire il plasmide ricombinante positivo in serie con incrementi di dieci volte con acqua sterilizzata a doppia distillazione. Conservare il plasmide diluito a meno 20 gradi Celsius per ulteriori esperimenti. Successivamente, mescolare insieme il tampone reidratante senza primer, i primer avanti e indietro di A. baumannii e l'acqua bidistillata fino a un volume finale di 465 microlitri. Agitare e far girare brevemente la miscela prima di trasferirla nelle provette di reazione enzimatica dal kit RPA. Mescolare accuratamente e aggiungere 25 microlitri di acetato di magnesio da 280 millimolari. Quindi, pipettare un microlitro del plasmide ricombinante positivo, contenente 10⁷ copie per microlitro, nella soluzione A con diverse coppie di primer. Incubare la soluzione a 39 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi purificare i prodotti amplificati utilizzando un kit di purificazione RPA. Far scorrere il prodotto purificato su un gel di agarosio all'1% a 120 volt per 10 minuti per identificare la coppia di primer con la banda più luminosa e più ampia. Per ottimizzare il sistema di amplificazione RPA, mantenere costanti le concentrazioni di tutti gli altri componenti di reazione regolando il volume finale della soluzione A a 465 microlitri. Quindi aggiungere volumi appropriati di acqua a doppia distillazione priva di RNA per ottenere le concentrazioni finali del primer come indicato e incubare. Dopo aver purificato ed elettroforestato il prodotto RPA, identificare la concentrazione ottimale del primer e il tempo di incubazione analizzando l'intensità e la distribuzione della banda. Per preparare la soluzione B, mescolare insieme il reporter di DNA a filamento singolo, il tampone di reazione CAST12a, l'RNA CRISPR CAST12a e l'acqua distillata doppia fino a un volume finale di 15 microlitri. Aggiungere cinque microlitri di amplificazione della polimerasi ricombinasi o prodotto RPA nella soluzione B. Mescolare accuratamente fino a ottenere un composto omogeneo. Inserire i campioni in uno strumento di PCR quantitativa a fluorescenza. Per i test di specificità, è possibile ottenere modelli di DNA da varie specie utilizzando un kit di estrazione del DNA di riferimento o facendo bollire i batteri in acqua. Usa l'acqua come controllo negativo. Trasferire 10 nanogrammi, o un microlitro, dei modelli di DNA nella soluzione A contenente primer diretti e inversi. Quindi pipettare 25 microlitri di acetato di magnesio da 280 millimolari. Mescolare accuratamente e incubare a 39 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque microlitri del prodotto di reazione alla soluzione B e mescolare. Collocare i campioni in uno strumento di PCR quantitativa a fluorescenza. Imposta il canale su FAM e leggi il segnale fluorescente ogni minuto a 39 gradi Celsius per un totale di 60 minuti. Per la valutazione della sensibilità della piattaforma di rilevamento basata su RPA-CRISPR CAST12a, utilizzare un plasmide ricombinante positivo diluito a concentrazioni comprese tra 1 e 10⁷ copie per microlitro come modello per la reazione. Usa l'acqua come controllo negativo. Trasferire il plasmide nella soluzione A, aggiungere acetato di magnesio e incubare come dimostrato in precedenza. Dopo l'incubazione e il trasferimento nella soluzione B, leggere il segno fluorescenteale. La coppia di primer F3-R3 è stata identificata come la più efficace per l'amplificazione della polimerasi ricombinasi, mostrando le bande più luminose e dense sull'elettroforesi su gel di agarosio. La concentrazione ottimale del primer per l'amplificazione è stata determinata essere 0,44 micromolare e il tempo di reazione ottimale è stato di 20 minuti. L'intensità della fluorescenza di CRISPR RNA1 è aumentata nel tempo, mentre CRISPR RNA2 non lo ha fatto, portando alla selezione di CRISPR RNA1 per la rilevazione di A. baumannii. L'analisi della specificità ha confermato che il sistema di rivelatori di A. baumannii ha rilevato esclusivamente il DNA di A. baumannii, senza alcuna fluorescenza osservata per altri campioni di DNA batterico. Il sistema è in grado di rilevare fino a una copia per microlitro di DNA, il che lo rende altamente sensibile. Il test a striscia di flusso laterale ha confermato l'elevata specificità del metodo di rilevamento, non mostrando alcuna reattività crociata con altre specie batteriche. Il test di A. baumannii ha rilevato con successo il DNA attraverso diluizioni da 10⁷ copie per microlitro fino a una singola copia per microlitro, confermando la sua robustezza alla luce UV.