Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

Capture Hi-C consente di decifrare l'organizzazione della cromatina 3D della regione genomica di interesse megabase ad alta risoluzione. Con Capture Hi-C, si ottengono una risoluzione più elevata e la specificità dell'allelico, migliorando al contempo l'efficacia temporale e la convenienza della tecnica. L'applicazione di Capture IC a diversi sistemi modello, tipi di cellule e paesaggi cromatici regolati dallo sviluppo in condizioni di salute e patologiche faciliterà probabilmente la nostra comprensione dell'interazione tra topologia del genoma e regolazione genica.

Per iniziare, triftonizzare e contare le celle dalla piastra di controllo preparata appositamente per il conteggio delle cellule utilizzando un contatore automatico delle celle. Includere la colorazione di vitalità per determinare la percentuale di cellule vitali. Da questo conteggio delle cellule, stimare il numero totale di cellule nella piastra preparata per la reticolazione.

Rimuovere il terreno di coltura dalle piastre preparate per la reticolazione e sostituirlo con la soluzione di fissaggio. Fissare per 10 minuti a temperatura ambiente sotto delicata miscelazione su uno shaker. Estinguere la reazione fissa aggiungendo 2,5 molari di glicina PBS a una concentrazione finale di 0,125 molari.

Aggiungere 530 microlitri di 2,5 molari glicina PBS a 10 millilitri in una piastra di 10 centimetri. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, mescolando delicatamente su uno shaker. Trasferire le piastre sul ghiaccio e incubare per altri 15 minuti sul ghiaccio mescolando delicatamente su uno shaker.

Rimuovere la soluzione di fissaggio dalle celle versandola in un becher per garantire una manipolazione rapida. Risciacquare rapidamente la piastra da 10 centimetri due volte con cinque millilitri di glicina fredda 0,125 molare PBS per lavare via i detriti e le cellule morte. Rimuovere il liquido dalla piastra versandolo in un becher per garantire una rapida manipolazione.

Aggiungere cinque millilitri di PBS di glicina molare fredda 0,125 alla piastra da 10 centimetri. E raschiare rapidamente le celle dalla piastra usando un raschietto per celle di plastica. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da centrifuga da 50 millilitri pre-raffreddata utilizzando una pipetta sierologica.

Risciacquare la piastra due volte con cinque millilitri di glicina molare fredda 0,125 PBS e aggiungere la sospensione cellulare al tubo conico della centrifuga. Girare a 480 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante aspirando con un sistema di aspirazione da banco.

Risospendere le celle e aliquote 500 microlitri della sospensione cellulare nel numero calcolato di micro provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Girare a 480 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il pellet a cellule secche a 80 gradi Celsius. Per la lisi cellulare, scongelare i pellet congelati sul ghiaccio.

Preparare 1,5 millilitri di tampone di lisi in acqua. Aggiungere 600 microlitri del tampone di lisi fredda e risospendere bene sul ghiaccio. Ruotare verso il basso a 2.655 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante utilizzando un sistema di aspirazione da banco.

Risospendere in 100 microlitri di SDS allo 0,5%. Dopo l'incubazione a 62 gradi Celsius vorticando a 1400 RPM per 10 minuti, aggiungere 290 microlitri di acqua più 50 microlitri di 10% Triton X 100 e mescolare bene, evitando bolle d'aria. Incubare a 37 gradi Celsius con vortice a 1400 RPM per 10 minuti prima di aggiungere 50 microlitri di tampone per tubo 10 X DPN e capovolgere il tubo per mescolare.

Prendi 50 microlitri di DNA non digerito per il controllo di qualità in una provetta separata. Non dimenticare di prendere il campione di controllo non digerito. Per la digestione di DPN2, aggiungere 10 microlitri di DPN2 ad alta concentrazione e mescolare invertendo.

Incubare i campioni e il controllo non digerito in un miscelatore termico a 37 gradi Celsius, roteando a 1400 rotazioni al minuto per più di quattro ore. Per la legatura e l'inversione della reticolazione, prendere 50 microlitri di DNA digerito legato per il controllo di qualità in una provetta separata. Conservare i controlli non digeriti e non ligati a 20 gradi Celsius.

Aggiungere 800 microlitri di cocktail di legatura. Incubare a 16 gradi Celsius, turbinando a 1000 rotazioni al minuto durante la notte. Per la purificazione del DNA, trasferire i campioni su ghiaccio in provette coniche da centrifuga da 15 millilitri pre-raffreddate e aggiungere due millilitri di acqua, 10,5 millilitri di etanolo ghiacciato e 583 microlitri di acetato di sodio a tre molari.

Aggiungere 200 microlitri di etanolo ghiacciato, 10,8 microlitri di acetato di sodio e un microlitro di coprecipitante ai controlli di qualità non digeriti e legati. Incubare a meno 80 gradi Celsius per almeno quattro ore fino a tutta la notte. Girare i tubi da 15 millilitri a 2200 G a quattro gradi Celsius per 45 minuti.

Rimuovere con cura l'etanolo e asciugare all'aria i campioni e i controlli a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Non asciugare troppo. Risospendere i campioni e i controlli rispettivamente in 100 microlitri e 20 microlitri di acqua.

Per il controllo di qualità della preparazione del modello 3C, caricare da 100 a 200 nanogrammi di ciascun campione e ciascun controllo su un gel agros 1XTBE all'1%. Quindi, per eseguire l'arricchimento del target per il sequenziamento multiplex pared end, prendere quattro microgrammi di modello 3C, risospenderlo in 130 microlitri di acqua per ogni reazione di cattura. Sonicare il campione e continuare la preparazione con tre microgrammi di DNA tranciato.

Per ibridare i campioni di DNA preparati alle sonde di RNA specifiche del bersaglio, utilizzare 750 nanogrammi di campioni di DNA in un volume finale di 3,4 microlitri, con una concentrazione iniziale di 221 nanogrammi per microlitro. Utilizzare la concentrazione del vuoto di velocità se necessario per raggiungere il volume finale di 3,4 microlitri. Per i campioni risospesi in 10 microlitri, sono sufficienti da 15 a 20 minuti di concentrazione.

Incubare la miscela di ibridazione per 16-18 ore a 65 gradi Celsius con un coperchio riscaldato a 105 gradi Celsius, secondo le istruzioni del produttore. Per catturare i frammenti di legatura mirati, aggiungere streptivide in perline accoppiate al campione ibridato della sonda. Infine, per preparare i campioni per il sequenziamento multiplex, continuare il protocollo secondo il sistema di arricchimento target utilizzato in questo studio per il sequenziamento accoppiato e multiplexato.

La risoluzione della mappa di interazione Capture Hi-C consente l'identificazione di due domini più piccoli nel Tsix-tad che contiene il promotore del locus Tsix. Questo non è stato precedentemente raggiunto con 5C. Inoltre, altre strutture sub-tad, come i loop di contatto, sono chiaramente visibili dai dati di Capture Hi-C, come il loop tra Xist e FTX, precedentemente identificato con Capture C e il loop tra Xist e Xert recentemente identificato utilizzando un protocollo simile per Capture Hi-C.

Altri contatti possono anche essere mappati in modo più preciso grazie alla maggiore risoluzione dei profili Capture Hi-C, come quelli che formano gli hotspot di contatto noti all'interno del Tsix-tad tra i loci Linx, Chic1 e Xite. Rispetto ai dati Hi-C mostrati, Capture Hi-C ha permesso un aumento di quattro volte della risoluzione, ma ha richiesto solo un quarto della profondità di sequenziamento. È molto importante non dimenticare di prelevare 50 microlitri di campioni di DNA non digerito e non ligato come controllo di qualità per la preparazione del modello 3C.