Neutrofili isolamento Protocollo
23 luglio 2008
I neutrofili sono tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria, e le loro funzioni e meccanismi sono stati ampiamente studiata in vitro. Si dimostra uno standard gradiente di densità metodo di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibili in commercio.
Protocollo di isolamento dei neutrofili. Questa procedura estrarrà i globuli bianchi da un'apparecchiatura per il campionamento di sangue intero, da una centrifuga e da fiale. Vortex sir ago e siringa siringa filtro.
Milli pour marca MX gv 0,22 materiali micrometrici. L'incantesimo di Hank e la separazione dei neutrofili in soluzione salina richiedono due tipi di soluzioni HBSS. L'HBSS con cloruro di calcio sarà utilizzato per produrre una soluzione con albumina sierica umana.
HBSS senza cloruro di calcio verrà utilizzato per sospendere e lavare i neutrofili. Si prega di prestare particolare attenzione all'uso della soluzione HBSS appropriata in questa procedura. L'albumina sierica umana o HSA è una proteina nel plasma sanguigno che mantiene il pH e la pressione SMO.
Non utilizzare tampone di lisi dei globuli rossi amalgamato di siero bovino. Questo è prodotto da Roche Diagnostics, terreni di isolamento dei neutrofili NIM Cedar Line Labs Lymph light Mezzi di separazione in polietilene protetti dalla luce e conservati in frigorifero per ottenere i migliori risultati. Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente al momento dell'uso.
Togliere i reagenti dal frigorifero un'ora prima dell'esperimento. Preparare la soluzione H-B-S-S-H-S-A per la separazione dei neutrofili. Pipettare l'HBSS con cloruro di calcio nel flaconcino.
Aspirare l'HSA nella siringa. Evitare di intrappolare bolle d'aria. Rimuovere l'ago della siringa e sostituirlo con il filtro.
Iniettare HSA attraverso il filtro nel vortice della fiala HBSS due miscele quando si hanno gli altri materiali pronti ea temperatura ambiente, acquisire circa 15 millilitri di sangue intero. Questo produrrà da 10 a 15 millilitri di neutrofili da 10 all'ottavo. Il donatore non deve aver consumato alcol o farmaci da banco per 24 ore prima di donare il campione di sangue.
Questi possono interrompere il processo di separazione. Il sangue intero può essere anticoagulato con EDTA citrato o eparina aggiungendo nove parti di sangue a una parte di K, tre EDTA citrato di sodio o eparina seguendo le istruzioni del produttore. I passaggi seguenti verranno descritti in questa procedura.
Separare e rimuovere plasma e monociti. Separare e acquisire uno strato di neutrofili che lisa i globuli rossi liberi sospende la prima separazione dei neutrofili. Acquisire neutrofili nello strato NIM.
Raccogliere cinque millilitri di terreno isolante nella provetta da centrifuga. Posizionando il mezzo isolante più in basso nella provetta gli consente di fungere da filtro, poiché la centrifuga spingerà il sangue verso il basso attraverso di esso con attenzione. Sovrapporre cinque millilitri di sangue sul NIM per una separazione pulita.
Fare molta attenzione a evitare di mescolare le soluzioni. Eseguire questo passaggio lentamente e con attenzione e con la punta della pipetta vicino alla superficie del mezzo di risoluzione per evitare che la centrifuga si mescoli. La soluzione a 500 RCF per 35 minuti.
A 20-25 gradi Celsius, il sangue dovrebbe separarsi in sei bande distinte. Le sei bande sono i monociti plasmatici, i mezzi di isolamento, i neutrofili, altri mezzi di isolamento e il pellet dei globuli rossi nella parte inferiore. Se queste sei bande non sono chiare e distinte, il processo di separazione non è stato pulito e dovrebbe essere ripetuto.
Le cause comuni di una cattiva separazione includono il vecchio donatore di terreni di isolamento che ha consumato alcol nelle ultime 72 ore o il donatore che ha consumato altri farmaci come il Tylenol o l'aspirina. Rimuovere ed eliminare con cura i monociti plasmatici e i mezzi di isolamento. Collocare questi strati in una provetta sigillabile e scartarli, pipettare con cura lo strato di neutrofili e tutti i mezzi di isolamento sotto i neutrofili in un file di centrifuga pulito per recuperare il maggior numero possibile di neutrofili.
Spesso è più semplice includere anche alcuni dei supporti di isolamento dal livello sottostante. Non disturbare il pallet sul fondo. Seconda dichiarazione, raffinare lo strato di neutrofili.
Diluire la soluzione di neutrofili a 10 millilitri con HBSS senza calcio. Capovolgere la provetta alcune volte per sospendere la centrifuga delle cellule. La soluzione di neutrofili.
350 RCF per 10 minuti. A 20-25 gradi Celsius, sul fondo della provetta dovrebbe essere presente un pellet rosso contenente neutrofili e globuli rossi residui. Rimuovere il supra natin con la pipetta.
Attenzione. per disturbare il pellet sul fondo. Lisi dei globuli rossi.
I globuli rossi nel campione devono ora essere distrutti dalla lisi. Per liare i globuli rossi residui, aggiungere due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi alla provetta per risuss. Sospendi il vortice di pellet la fiala a un'impostazione da tre a quattro.
Evitare di aumentare l'impostazione del vortice oltre i quattro poiché ciò potrebbe causare l'attivazione dei neutrofili. Potrebbe essere necessario vorticare per diversi secondi o pulsare il vortice per sciogliere il palato. Centrifugare la soluzione di lisi a 250 RCF per cinque minuti.
Utilizzare l'opzione di avvio graduale per ridurre al minimo i danni al campione. Rimuovere il supra natin con la pipetta. Ripetere il processo di lisi.
Se necessario, rilasciare la sospensione di neutrofili, aggiungere 500 microlitri di HBSS senza calcio a ciascuna provetta. Agitare il pellet a una temperatura da tre a quattro, diluire a 10 millilitri con HPSS senza centrifuga di calcio. I neutrofili a 250 RCF per cinque minuti aspirano la trappola e la scartano.
Risospendere il pellet in 250 microlitri di HBSS con soluzione HSA, due volte 10 per sei. I neutrofili per millilitro vengono tipicamente raccolti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per isolare i neutrofili umani dal sangue intero utilizzando una tecnica standard di separazione a gradiente di densità. I neutrofili svolgono un ruolo cruciale nella risposta immunitaria infiammatoria, e comprendere il loro isolamento è vitale per ulteriori ricerche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
Sfondo
- I neutrofili sono tra i primi a rispondere nelle risposte infiammatorie.
- Le loro funzioni e meccanismi sono stati ampiamente studiati in vitro.
- Le tecniche di isolamento sono essenziali per studiare il comportamento e le funzioni dei neutrofili.
- I metodi standardizzati migliorano la riproducibilità nella ricerca.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per isolare i neutrofili dal sangue umano.
- Facilitare ulteriori ricerche sulle funzioni dei neutrofili nell'infiammazione.
- Fornire un protocollo che possa essere facilmente adottato nei laboratori.
Metodi utilizzati
- Metodo di separazione a gradiente di densità.
- Uso di mezzi di separazione disponibili in commercio.
- L'attrezzatura include centrifuga e fiale.
- Preparazione di soluzioni utilizzando HBSS con cloruro di calcio e albumina del siero umano.
Risultati principali
- Isolamento di successo dei neutrofili da campioni di sangue intero.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo di separazione.
- Fornitura di un chiaro protocollo per i ricercatori.
- Possibili applicazioni nello studio del comportamento dei neutrofili in varie condizioni.
Conclusioni
- Il metodo presentato è efficace per l'isolamento dei neutrofili.
- Questo protocollo può migliorare la ricerca sulle risposte immunitarie.
- Ulteriori studi possono basarsi su questa tecnica di isolamento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
