Neutrofili isolamento Protocollo

Protocollo di isolamento dei neutrofili. Questa procedura estrarrà i globuli bianchi da un'apparecchiatura per il campionamento di sangue intero, da una centrifuga e da fiale. Vortex sir ago e siringa siringa filtro.

Milli pour marca MX gv 0,22 materiali micrometrici. L'incantesimo di Hank e la separazione dei neutrofili in soluzione salina richiedono due tipi di soluzioni HBSS. L'HBSS con cloruro di calcio sarà utilizzato per produrre una soluzione con albumina sierica umana.

HBSS senza cloruro di calcio verrà utilizzato per sospendere e lavare i neutrofili. Si prega di prestare particolare attenzione all'uso della soluzione HBSS appropriata in questa procedura. L'albumina sierica umana o HSA è una proteina nel plasma sanguigno che mantiene il pH e la pressione SMO.

Non utilizzare tampone di lisi dei globuli rossi amalgamato di siero bovino. Questo è prodotto da Roche Diagnostics, terreni di isolamento dei neutrofili NIM Cedar Line Labs Lymph light Mezzi di separazione in polietilene protetti dalla luce e conservati in frigorifero per ottenere i migliori risultati. Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente al momento dell'uso.

Togliere i reagenti dal frigorifero un'ora prima dell'esperimento. Preparare la soluzione H-B-S-S-H-S-A per la separazione dei neutrofili. Pipettare l'HBSS con cloruro di calcio nel flaconcino.

Aspirare l'HSA nella siringa. Evitare di intrappolare bolle d'aria. Rimuovere l'ago della siringa e sostituirlo con il filtro.

Iniettare HSA attraverso il filtro nel vortice della fiala HBSS due miscele quando si hanno gli altri materiali pronti ea temperatura ambiente, acquisire circa 15 millilitri di sangue intero. Questo produrrà da 10 a 15 millilitri di neutrofili da 10 all'ottavo. Il donatore non deve aver consumato alcol o farmaci da banco per 24 ore prima di donare il campione di sangue.

Questi possono interrompere il processo di separazione. Il sangue intero può essere anticoagulato con EDTA citrato o eparina aggiungendo nove parti di sangue a una parte di K, tre EDTA citrato di sodio o eparina seguendo le istruzioni del produttore. I passaggi seguenti verranno descritti in questa procedura.

Separare e rimuovere plasma e monociti. Separare e acquisire uno strato di neutrofili che lisa i globuli rossi liberi sospende la prima separazione dei neutrofili. Acquisire neutrofili nello strato NIM.

Raccogliere cinque millilitri di terreno isolante nella provetta da centrifuga. Posizionando il mezzo isolante più in basso nella provetta gli consente di fungere da filtro, poiché la centrifuga spingerà il sangue verso il basso attraverso di esso con attenzione. Sovrapporre cinque millilitri di sangue sul NIM per una separazione pulita.

Fare molta attenzione a evitare di mescolare le soluzioni. Eseguire questo passaggio lentamente e con attenzione e con la punta della pipetta vicino alla superficie del mezzo di risoluzione per evitare che la centrifuga si mescoli. La soluzione a 500 RCF per 35 minuti.

A 20-25 gradi Celsius, il sangue dovrebbe separarsi in sei bande distinte. Le sei bande sono i monociti plasmatici, i mezzi di isolamento, i neutrofili, altri mezzi di isolamento e il pellet dei globuli rossi nella parte inferiore. Se queste sei bande non sono chiare e distinte, il processo di separazione non è stato pulito e dovrebbe essere ripetuto.

Le cause comuni di una cattiva separazione includono il vecchio donatore di terreni di isolamento che ha consumato alcol nelle ultime 72 ore o il donatore che ha consumato altri farmaci come il Tylenol o l'aspirina. Rimuovere ed eliminare con cura i monociti plasmatici e i mezzi di isolamento. Collocare questi strati in una provetta sigillabile e scartarli, pipettare con cura lo strato di neutrofili e tutti i mezzi di isolamento sotto i neutrofili in un file di centrifuga pulito per recuperare il maggior numero possibile di neutrofili.

Spesso è più semplice includere anche alcuni dei supporti di isolamento dal livello sottostante. Non disturbare il pallet sul fondo. Seconda dichiarazione, raffinare lo strato di neutrofili.

Diluire la soluzione di neutrofili a 10 millilitri con HBSS senza calcio. Capovolgere la provetta alcune volte per sospendere la centrifuga delle cellule. La soluzione di neutrofili.

350 RCF per 10 minuti. A 20-25 gradi Celsius, sul fondo della provetta dovrebbe essere presente un pellet rosso contenente neutrofili e globuli rossi residui. Rimuovere il supra natin con la pipetta.

Attenzione. per disturbare il pellet sul fondo. Lisi dei globuli rossi.

I globuli rossi nel campione devono ora essere distrutti dalla lisi. Per liare i globuli rossi residui, aggiungere due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi alla provetta per risuss. Sospendi il vortice di pellet la fiala a un'impostazione da tre a quattro.

Evitare di aumentare l'impostazione del vortice oltre i quattro poiché ciò potrebbe causare l'attivazione dei neutrofili. Potrebbe essere necessario vorticare per diversi secondi o pulsare il vortice per sciogliere il palato. Centrifugare la soluzione di lisi a 250 RCF per cinque minuti.

Utilizzare l'opzione di avvio graduale per ridurre al minimo i danni al campione. Rimuovere il supra natin con la pipetta. Ripetere il processo di lisi.

Se necessario, rilasciare la sospensione di neutrofili, aggiungere 500 microlitri di HBSS senza calcio a ciascuna provetta. Agitare il pellet a una temperatura da tre a quattro, diluire a 10 millilitri con HPSS senza centrifuga di calcio. I neutrofili a 250 RCF per cinque minuti aspirano la trappola e la scartano.

Risospendere il pellet in 250 microlitri di HBSS con soluzione HSA, due volte 10 per sei. I neutrofili per millilitro vengono tipicamente raccolti.