Name: Neutrofili isolamento Protocollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri un metodo affidabile per isolare neutrofili dal sangue umano utilizzando la separazione a gradiente di densità. Questa tecnica standardizzata facilita la ricerca sulle risposte immunitarie e sull'infiammazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finanziamenti dal NIH R01 HL56621.

Neutrofili isolamento Protocollo <ol><li> Portare i reagenti a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere 5,0 ml di terreni di isolamento dei neutrofili in provetta da centrifuga. Con attenzione strato 5,0 ml di sangue sui mezzi di separazione. Effettuare questo passaggio, lentamente e con attenzione, e con la punta della pipetta vicino alla superficie del supporto per evitare di mescolare il sangue e dei media. </li><li> Centrifugare a 500 RCF per 35 minuti a 20-25 ° C. Il sangue deve separare in 6 fasce distinte: al plasma, monociti, terreni di isolamento, i neutrofili, terreni di isolamento di più, e il rosso del sangue pellet cellulare (Figura 1). Se queste bande non sono chiare, il processo di separazione non era pulito e dovrà essere ripetuto. </li><li> Rimuovere con attenzione i primi tre strati (plasma, monociti, e terreni di isolamento) usando una pipetta. Smaltire questi strati. </li><li> Con attenzione pipetta lo strato di neutrofili e di tutti i terreni di isolamento sotto il neutrofili. Mettere la soluzione in una provetta da centrifuga pulita. </li><li> Diluire la soluzione dei neutrofili a 10 ml con HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 +. Invertire il tubo di un paio di volte a sospendere le cellule. </li><li> Centrifugare la soluzione dei neutrofili a 350 RCF per 10 minuti. Una pallina rossa deve essere presente sul fondo della provetta, contenente residui di neutrofili e globuli rossi (RBC). Eliminare il surnatante con una pipetta attenzione in modo che il pellet non è disturbato. </li><li> Per lisare i globuli rossi residuo, aggiungere 2 ml di Lysis Buffer Red Cell per il tubo. Per risospendere il, pellet vortice del flacone in un ambiente di 3-4. Evitare di aumentare l&#39;impostazione vortice superiore a 4, dal momento che questo può causare i neutrofili da attivare. Potrebbe essere necessario vortex per alcuni secondi, o di &quot;impulso&quot; il vortice di sciogliere il pellet. </li><li> Centrifugare la provetta a 250 RCF per 5 min. Togliere il surnatante con la pipetta. Ripetere il processo di lisi, se necessario. </li><li> Aggiungere 500 microlitri HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 + ad ogni provetta. Ancora una volta, vortice per risospendere il pellet in un ambiente di 3-4. Diluire a 10 ml con HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li> Centrifugare le provette a 250 RCF per 5 min. Aspirare il surnatante e gettarlo. </li><li> Risospendere il pellet in 250 microlitri HBSS / Soluzione HSA (2% HSA). Le cellule possono essere contati e regolato concentrazione desiderata. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

Il gradiente di densità metodo di separazione viene utilizzato per isolare neutrofili umani da sangue intero con una miscela di sodio metrizoate e Destrano 500. Questo metodo si basa sul metodo di separazione dei leucociti mononucleari da Boyum (1968), che è stato modificato per la separazione dei neutrofili da Ferrante e Thong (1980). Dopo la raccolta di un donatore, il sangue intero può essere anticoagulato con EDTA, citrato o eparina. Dal momento che sono di breve durata, i neutrofili devono essere utilizzati entro 2-4 ore dalla ...

<table><tbody><tr><td>Linfocita Poly(R)</td><td>Reagente</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM può essere utilizzato come alternativa</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Soluzione salina equilibrata senza cloruro di calcio</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana</td><td>Reagente</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer per la lisi delle cellule rosse</td><td>Reagente</td><td>Gruppo Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur e bulbo</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Reagente</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Reagente alternativo al Lymphocyte-Poly (R)</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Altro</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizzabile</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Soluzione salina equilibrata con cloruro di calcio</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrofili isolamento protocollo

Neutrophil Isolation Protocol

Granulociti neutrofili polimorfonucleati (PMN) sono i leucociti più abbondanti negli esseri umani e tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria. A causa del loro ruolo chiave nel processo infiammatorio, le funzioni dei neutrofili come locomozione, la produzione di citochine, fagocitosi, e combattere cellule tumorali sono ampiamente studiati. Per caratterizzare le funzioni specifiche di neutrofili, un metodo pulito, veloce e affidabile che li separa dai globuli altro è auspicabile che studi in vitro, specialmente da quando i neutrofili sono di breve durata e deve essere utilizzato entro 2-4 ore dalla raccolta. Qui, dimostrare un metodo standard di gradiente di densità di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibile in commercio che è una miscela di sodio metrizoate e Destrano 500. La procedura consiste di sangue intero stratificazione nel medio gradiente di densità, centrifugazione, separazione dello strato dei neutrofili, e lisi degli eritrociti residui. Le cellule vengono poi lavate, contate e risospese in tampone alla concentrazione desiderata. Quando eseguito correttamente, questo metodo ha dimostrato di produrre campioni di&gt; neutrofili 95% con vitalità&gt; 95%.

I neutrofili sono tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria, e le loro funzioni e meccanismi sono stati ampiamente studiata in vitro. Si dimostra uno standard gradiente di densità metodo di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibili in commercio.

Neutrofili isolamento Protocollo

I granulociti polimorfonucleati neutrofili (PMN) sono i leucociti più abbondanti negli esseri umani e tra le prime cellule ad arrivare nel sito di un processo infiammatorio...

Protocollo di isolamento dei neutrofili. Questa procedura estrarrà i globuli bianchi da un campione di sangue intero utilizzando una centrifuga e provette. Vortex sir ago e siringa filtro per siringa.Milli pour brand MX gv 0,22 materiali micrometrici. Per la separazione dei neutrofili, la soluzione salina di Hank richiede due tipi di soluzioni HBSS. L'HBSS con cloruro di calcio verrà utilizzato per preparare una soluzione con albumina sierica umana.HBSS senza cloruro di calcio verrà utilizzato per sospendere e lavare i neutrofili. Si prega di prestare particolare attenzione a utilizzare la soluzione HBSS appropriata in questa procedura. L'albumina sierica umana o HSA è una proteina presente nel plasma sanguigno che mantiene il pH e la pressione oncotic.Non utilizzare il tampone per la lisi dei globuli rossi a base di amalgama di siero bovino. Questo prodotto è fabbricato da Roche Diagnostics, mezzo per l'isolamento dei neutrofili NIM Cedar Line Labs, mezzo di separazione Lymph light Poly, da proteggere dalla luce e conservare in frigorifero per ottenere i migliori risultati. Tutti i reagenti devono essere alla temperatura ambiente al momento dell'uso.Rimuovere i reagenti dal frigor

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra un test in vitro per studiare l'interazione neutrofilo-biofilm. I batteri patogeni incorporati nel biofilm e i neutrofili isolati sono stati marcati utilizzando etichette fluorescenti e la risposta immunitaria dei neutrofili e l'evasione della risposta immunitaria da parte dei batteri sono state valutate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Un test in vitro per studiare l'interazione tra neutrofili e biofilm

Questo video dimostra l'induzione e la visualizzazione di trappole extracellulari neutrofile o NET in neutrofili pre-marcati utilizzando siero paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili. Inoltre, l'utilizzo di un colorante di DNA impermeabile e della microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione dei NET.

Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

Nella seguente protocollo, si descrive un modo molto semplice per isolare trappole neutrofili extracellulari (NET) da sangue umano intero utilizzando reagenti facilmente disponibili. Abbiamo poi mostrato come i NET isolati possono essere utilizzati in un'adesione test in vitro con cellule tumorali.

Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. L'isolamento dei neutrofili dal sangue umano mediante il metodo di separazione del gradiente di densità e la differenziazione delle cellule promielocitiche umane (HL60) lungo la via granulocitaria sono descritti qui; testare il loro ruolo sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Descriviamo qui un metodo per ottenere e identificare una sottopopolazione di recente caratterizzato dei fagociti giganti neutrofili derivato. Queste cellule si sviluppano in cultura da freschi neutrofili sangue umano, e sono caratterizzati da fagocitosi, l'autofagia, immensamente grandi dimensioni, e la durata della vita estesa. Questo metodo è fondamentale per approfondire questo unico sottopopolazione neutrofili-derivati.

Sviluppo e identificazione di una sottopopolazione romanzo di Human neutrofili di derivazione fagociti Giant In Vitro

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero, dai cappotti buffy o dalle membrane di leucaferesi, ottenendo una buona resa, un'elevata purezza e un'attivazione cellulare minima. Utilizziamo la purificazione a gradiente, la sedimentazione dei globuli rossi (RBC) e la lisi dei globuli rossi per ottenere una preparazione neutrofila di alta qualità / purezza.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

In questo caso, forniamo un approccio affidabile per isolare neutrofili a bassa e normale densità dal sangue intero utilizzando l'isolamento magnetico (selezione negativa) e il mezzo a gradiente di densità discontinuo. Garantisce l'isolamento intatto di cellule ad alta purezza (≥93%), facilitando un'analisi accurata a valle delle sottopopolazioni di neutrofili, fondamentale per comprendere il loro ruolo nella salute e nella malattia.

L'isolamento e la caratterizzazione di neutrofili a bassa e normale densità da sangue intero

I neutrofili a bassa densità (LDN) aumentano significativamente in diverse malattie. Le LDN sono solitamente isolate attraverso la selezione cellulare. Presentiamo un metodo pratico per ottenere LDN puro e vitale. Dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico, le cellule vengono incubate con microsfere magnetiche e quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche.

Metodo rapido con microsfere magnetiche per la purificazione efficiente dei neutrofili a bassa densità

Scopri un metodo affidabile per isolare neutrofili dal sangue umano utilizzando la separazione a gradiente di densità. Questa tecnica standardizzata facilita la ricerca sulle risposte immunitarie e sull'infiammazione.

Neutrofili isolamento Protocollo

Esplora altri video