Purificazione efficiente dei polipeptidi simili all'elastina (ELP) da E. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico

L'ambito di questa ricerca si chiede se la precipitazione estrattiva da solvente possa purificare rapidamente le proteine di fusione ELP mantenendo la funzione di attività di fusione. Gli sviluppi recenti includono la rapida purificazione ELP a base di solvente con un migliorato controllo delle endotossine, che consente nanoparticelle autoassemblanti attive per la somministrazione mirata di acidi nucleici. Per cominciare, pesa un grammo del pellet delle cellule di E. coli.

Aggiungi quattro millilitri di tampone per la lisi appena preparato per risospendere il pellet cellulare. Vortice delicatamente finché il pellet non è completamente disperso e mescolato con il tampon. Aggiungere circa cinque milligrammi di lisozima alle cellule risospese per aiutare nella digestione della parete cellulare.

Poi metti il tubo sul ghiaccio e incuba per un'ora. Dopo l'incubazione, sonicare il campione utilizzando un sonatore a micro-punta a intervalli di cinque secondi. Mantenere il campione sul ghiaccio e continuare la sonicazione fino a ottenere un lisato uniforme privo di particelle visibili, tipicamente per cinque o otto minuti.

Centrifuga il lisato sonico a 10.000 G per 10 minuti a 20 gradi Celsius per chiarirlo. Successivamente, si separa con cura il sovrantantante contenente la frazione solubile dalla pellet che contiene la frazione insolubile. Pipetta da 10 a 20 microlitri del sovrantantante e risospensa una massa equivalente del pellet nel tampone di lisi.

Mescola entrambe le frazioni con 4x tampone di Laemmli fino a una concentrazione finale di 1x. Poi riscalda la sospensione a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Se l'ELP è prevalentemente solubile, procedere con l'estrazione con solvente organico utilizzando il soprandanante chiarifiato.

Per effettuare l'estrazione con solvente, aggiungere quattro millilitri di solvente organico o miscela di solvente al pellet essiccato all'aria o al surnadante. Per miscele di solventi binari, si utilizzano rapporti volumetrici esatti, come due millilitri di ciascuna per una combinazione uno-a-uno. Vortiza vigorosamente la sospensione per un minuto per garantire una corretta penetrazione del solvente nel pellet.

Ora, incubare la miscela a 20 gradi Celsius per cinque minuti per consentire l'aggregazione delle proteine extracellulari e la solubilizzazione dell'ELP nella fase organica. Centrifugare il campione a 13.000 g per 10 minuti a 20 gradi Celsius per separare le proteine solubilizzate dai detriti insolubili. Raccogli con cura il surnatante senza disturbare il pellet, poiché contiene l'ELP solubilizzato.

Misurare il volume del sovrantante raccolto con precisione per prepararsi alle precipitazioni. Successivamente, aggiungere acetone o acetonitrile al soprantantante a 2,33 volte il suo volume per la precipitazione proteica. Incubare la miscela a 20 gradi Celsius per cinque-sette minuti.

Centrifuga il campione a 10.000 G per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Poi getta il soprantantante e fai asciugare all'aria il pellet sotto un flusso di azoto delicato per 10-15 minuti oppure mettendo tubi centrifughe senza tappi capovolti su salviette senza pelucchi in una cappa per un'ora a 20 gradi Celsius. Risospensa il pellet proteico essiccato in 50 microlitri di PBS.

Poi pipetta delicatamente su e giù per assicurare la completa dissoluzione. Conservare la proteina in sospensione a meno 20 gradi Celsius per un uso a breve e medio termine. Per effettuare la validazione usando SDS-PAGE, prima miscela la proteina purificata con un buffer di caricamento SDS-PAGE 4x.

Vortice la soluzione per ottenere brevemente omogeneità. Carica il campione su un gel SDS-PAGE al 10% per ELP e TEEN fusi per corismare la mutasi. Fai funzionare il gel a 100-120 volt finché l'immersione di tracciamento non raggiunge il fondo.

Ora, tingi il gel usando la tintura InstantBlue Coomassie o un'alternativa adatta per due ore a 20 gradi Celsius. Risciacquare con acqua deionizzata finché non si ottiene uno sfondo limpido. Una prominente banda ELP e TEEN fusa per corismare mutasi è apparsa a 100 kilodalton dopo una fase di lisi prima dell'estrazione organica.

Diverse combinazioni di solventi organici hanno portato a diverse efficienze di estrazione e purezza di ELP e TEEN fusi per corismare la mutasi. Le miscele uno-a-uno di AG e BG hanno prodotto il maggior recupero proteico. L'ELP e il TEEN estratti da solvente AG fusi per corismare la mutasi ha mantenuto circa l'80% della sua attività enzimatica rispetto alla proteina purificata da ITC, mentre la glucosa ha mantenuto circa il 50% di attività, e il controllo V40 ha mostrato quasi nessuna attività.

Tra i risultati significativi vi è la dimostrazione che la precipitazione di estrazione con solvente organico purifica rapidamente le fusioni ELP con basso contenuto di endotossina, preservando al contempo l'attività delle proteine di fusione. Questo protocollo affronta la mancanza di metodi rapidi senza detersivo per purificare le fusioni ELP da E.Coli con o senza corpi di inclusione senza ITC multi-fasa. Questo protocollo offre una purificazione rapida in un solo passaggio direttamente da pellet di E. coli, ottenendo fusioni ELP altamente pure e a basso contenuto di endotossine, preservando al contempo la funzione delle proteine di fusione.