Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da

L'obiettivo generale di questo procedimento è illustrare i passaggi coinvolti nella costruzione e produzione di proteine artificiali di matrice extracellulare o A ECM contenenti ripetizioni simili all'elastina. Questo viene realizzato innanzitutto costruendo geni ricombinanti che codificano per le proteine A ECM. Successivamente, i geni ricombinanti vengono inseriti in ospiti batterici.

A questo punto, le proteine ricombinanti vengono espresse negli ospiti batterici e successivamente raccolte a seguito dell'estrazione proteica mediante lisi cellulare. L'ultimo passaggio consiste nella purificazione delle proteine utilizzando il ciclo di transizione inversa, o ITC, che sfrutta il comportamento unico di transizione di fase dell'elastina, simile a quello dei polipeptidi.

I cicli di centrifugazione vengono eseguiti a quattro gradi Celsius e a 37 gradi Celsius. Infine, vengono utilizzate tecniche di elettroforesi su gel e di western blot per identificare le proteine ricombinanti e determinarne le purezze. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colonne ad affinità, è che possiamo estrarre una grande quantità di proteine in modo relativamente economico.

Avviare questa procedura con tutti i progetti dei ligami descritti nel protocollo testuale. Una volta ottenuti gli oligomeri, assemblare gli oligomeri di DNA per ottenere la sequenza genica desiderata. Sciogliere innanzitutto gli oligonucleotidi di DNA nel tampone per oligo di DNA fino a una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro.

Aggiungere quattro microlitri di ogni ligame a 32 microlitri di DNA e tampone di rinascita per ottenere una miscela finale di 40 microlitri. Successivamente, far bollire un becher d'acqua utilizzando un piastrino riscaldante ed immergere la miscela per cinque minuti. A 95 gradi Celsius, rimuovere il becher e raffreddare gradualmente l'intero apparato in una scatola di polistirolo per tutta la notte; gli oligomeri sono ora stati rinascitati e sono pronti per la digestione.

Aggiungere i corrispondenti enzimi di restrizione per digerire separatamente gli oligomeri al e i vettori ospiti, come descritto nel protocollo Digest, per tre o quattro ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver eseguito i prodotti di digestione su un gel di agarosio e aver purificato il DNA, assemblare il gene di interesse in modo sequenziale, legando l'inserto di DNA digerito nel vettore plasmidico con la ligasi T4. Utilizzando la ricetta riportata nel protocollo testuale, incubare la miscela di legazione a temperatura ambiente per due ore.

Successivamente, trasformare le cellule mediante shock termico secondo Ali. Aliquotare 50 microlitri di cellule competenti in provette da microcentrifuga pulite e preraffreddate. Pipettare cinque microlitri della miscela di ligazione nelle cellule, aspirando e dispensando delicatamente su e giù per omogeneizzare.

Lasciare la miscela sul ghiaccio per 20 minuti. Successivamente immergere il tubo da microcentrifuga contenente la miscela cellulare in un bagno termico a 42 gradi Celsius per due minuti e quindi riportare sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere 500 microlitri di terreno SOC nel tubo da microcentrifuga e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione per un'ora.

Dopo l'incubazione, distribuire da 50 a 500 microlitri della miscela di legatura cellulare su una piastra di agar YT 2x contenente ampicillina, precedentemente riscaldata a temperatura ambiente. Incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, selezionare le colonie di DNA dalla piastra di agar utilizzando punte di pipetta pulite.

Crescere le colonie in cinque millilitri di mezzo YT due volte contenente ampicillina, agitando durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, utilizzare un kit di isolamento di plasmidi seguendo il protocollo del produttore per estrarre i plasmidi di DNA da ciascuna colonia.

Eluisci il DNA con 50 microlitri di acqua dopo la trasformazione del plasmide ricombinante nell'ospite batterico di espressione come descritto nel protocollo testuale. Scegli una colonie dalla piastra di trasformazione con la punta di una pipetta e inocularla in 10 millilitri di terreno terrific broth (TB) sterile contenente entrambi gli antibiotici, ampicillina e cloramfenicolo, in un tubo da prova.

Incubare questa coltura iniziale a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 225 giri al minuto. Successivamente, trasferire 10 millilitri della coltura iniziale in un litro di terreno TB fresco e sterile, supplementato con gli stessi antibiotici, in un matraccio Erlenmeyer da tre litri.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 225 RRP M per due o tre ore. Osservare la densità ottica della coltura a 600 nanometri (OD 600) per verificare che abbia raggiunto un valore compreso tra 0,6 e 0,8, pipettando un millilitro di coltura in un Q vet vuoto per la lettura. Successivamente, indurre la coltura con IPTG fino a una concentrazione finale di un millimolare e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 225 RPM per altre quattro ore.

Raccogliere le cellule trasferendo la coltura in bottiglie da un litro per centrifuga e centrifugando a 12.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato il soprannatante, pesare i pellet cellulari e risospendere nel tampone 10 a 0,5 grammi per millilitro. Congelare la coltura cellulare risospesa a meno 80 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo scongelare la coltura cellulare congelata in un bagno d'acqua a temperatura ambiente o su ghiaccio. Aggiungere alle cellule L deossiribonucleasi, ribonucleasi A e fluoruro di fenilmetile. Durante lo scongelamento della soluzione, omogeneizzare la soluzione con un'agitazione lenta.

Dopo che tutte le cellule risospese sono state scongelate, regolare il pH della soluzione a 9,0 per aumentare la solubilità della proteina in acqua, facendo molta attenzione. Aggiungere goccia a goccia sei N di idrossido di sodio sotto costante agitazione e in ghiaccio per ottenere una consistenza omogenea. Quindi lisare le cellule mediante rottura ultrasonica per 20 minuti in ghiaccio, utilizzando una sonda con punta piatta di due millimetri di diametro e un impulso di cinque secondi.

Centrifugare la soluzione cellulare a 12.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in un flacone pulito e vuoto e conservare a quattro gradi Celsius per la successiva purificazione. Nel frattempo, risospendere nuovamente il pellet cellulare con 10 buffer e conservare 20 microlitri del lisato cellulare.

Per la caratterizzazione tramite elettroforesi SDS-PAGE, ricongelare il pellet cellulare risospeso a meno 80 gradi Celsius per completare la lisi cellulare. Ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento e la sonicazione fino a tre volte. Raccogliere il lisato cellulare ottenuto in precedenza e procedere alla purificazione delle proteine A ECM utilizzando la ITC, in cui i cicli di centrifugazione vengono eseguiti a diverse temperature in condizioni di alta salinità.

Dividere il lisato cellulare in bottiglie da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare a 40.000 G per due ore a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante mediante pipettaggio per ottenere una separazione netta dal pellet. Raccogliere il soprannatante in bottiglie da centrifuga pulite e aggiungere cloruro di sodio fino a una concentrazione finale di un molare.

Riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius per due ore con agitazione a 225 giri al minuto. Successivamente, centrifugare. Il soprannatante a 40.000 G per due ore a 37 gradi Celsius.

Dopo la decantazione, frantumare il precipitato con una spatola metallica e risospendere i frammenti del pellet nel ghiaccio. Autoclavare l'acqua distillata fredda con agitazione vigorosa per tutta la notte a quattro gradi Celsius utilizzando una barretta magnetica e una piastra agitatrice, fino a quando il pellet si sarà completamente disciolto. Ripetere questi cicli fino a quando il pellet, a 37 gradi Celsius, risulti bianco; a questo punto, può essere disciolto in acqua per tutta la notte e centrifugato.

Per ottenere la soluzione proteica, desalare la soluzione proteica dializzandola contro acqua distillata a quattro gradi Celsius, cambiando l'acqua ogni quattro o otto ore durante la notte per due o tre giorni, dopo aver conservato 20 microlitri della proteina purificata per la corsa SDS-PAGE. Liofilizzare il resto della proteina purificata come mostrato qui. Una banda proteica intensa si trova al peso molecolare previsto nel campione indotto. È inoltre mostrato il gel SDS-PAGE contenente un campione di proteina purificata con un peso molecolare di 22 kilodalton corrispondente alla laminina cinque A ECM.

La purezza stimata delle proteine A ECM è di circa il 90-95%. Questo valore è stato ottenuto confrontando i rapporti tra le intensità delle bande della proteina bersaglio e delle altre bande proteiche presenti nel gel SDS. Infine, per determinare se la proteina purificata fosse effettivamente costituita dalle proteine A ECM, è stata eseguita una analisi mediante Western blot. La purezza proteica delle tre proteine A ECM è mostrata tramite un gel SDS-PAGE e confrontata con un'immagine della membrana di nitrocellulosa utilizzata per il Western blot.

L'analisi rivela la presenza delle proteine bersaglio collageno quattro A ECM e laminina cinque A ECM, marcate utilizzando anticorpi anti-tag esaimidistidinico coniugati con perossidasi del rafano. I rendimenti finali delle proteine A ECM sono compresi tra 60 milligrammi per litro e 120 milligrammi per litro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre e purificare proteine contenenti domini elastinici per la propria specifica applicazione.