Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da Escherichia coli Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare i passaggi coinvolti nella costruzione e produzione di proteine ECM artificiali o ripetizioni simili all'elastina contenenti ECM. Ciò si ottiene costruendo prima geni ricombinanti che codificano le proteine A della MEC. Successivamente, i geni ricombinanti vengono inseriti negli ospiti batterici.

A questo punto, le proteine ricombinanti vengono espresse negli ospiti batterici e quindi raccolte in seguito all'estrazione delle proteine attraverso la lisi cellulare. Il passaggio finale consiste nel purificare le proteine utilizzando il ciclo di transizione inversa o ITC, che sfrutta il comportamento unico di transizione di fase dell'elastina. Come i polipeptidi.

I cicli di centrifugazione vengono eseguiti a quattro gradi Celsius e 37 gradi Celsius. In definitiva, l'elettroforesi su gel e le tecniche di western blot vengono utilizzate per identificare le proteine ricombinanti e determinarne la purezza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le colonne di affinità, è che possiamo estrarre grandi quantità di proteine in modo relativamente economico.

Inizia questa procedura con tutti i design dei legamenti come descritto nel protocollo di testo. Una volta ottenuti gli oligomeri, aninare gli oligomeri del DNA per ottenere la sequenza genica desiderata. Per prima cosa sciogliere gli oligonucleotidi del DNA in un tampone oligo del DNA fino a una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro.

Aggiungi quattro microlitri di ciascun legamento a 32 microlitri di DNA e tampone inginocchiato per ottenere una miscela totale di 40 microlitri. Quindi far bollire un bicchiere d'acqua utilizzando una piastra calda e immergere il composto per cinque minuti. A 95 gradi Celsius, rimuovere il becher e raffreddare gradualmente l'intero allestimento in una scatola di polistirolo durante la notte, gli oligomeri sono stati ora in ginocchio e sono pronti per la digestione.

Aggiungere gli enzimi di restrizione corrispondenti per digerire separatamente gli oligomeri e i vettori dell'ospite, come descritto nel testo Protocollo Digest, per tre o quattro ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver eseguito i prodotti della digestione su un gel di agarosio e aver purificato il DNA, combinare il gene di interesse in sequenza legando l'inserto di DNA digerito nel vettore plasmidico con T quattro ligasi. Utilizzando la ricetta che si trova nel protocollo di testo, incubare la miscela di legatura a temperatura ambiente per due ore.

Quindi, trasforma le celle usando lo shock termico di Ali. Quotazione di 50 microlitri di cellule competenti in provette da microcentrifuga pulite e pre-raffreddate. Pipettare cinque microlitri della miscela di legatura nelle cellule, pipettando delicatamente su e giù per mescolare.

Lasciare il composto in ghiaccio per 20 minuti. Quindi immergere la provetta da microcentrifuga contenente la miscela cellulare in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per due minuti e tornare in ghiaccio per due minuti. Aggiungere 500 microlitri di terreno SOC nella provetta per microcentrifuga e incubare a 37 gradi Celsius agitando per un'ora.

Dopo l'incubazione, distribuire da 50 a 500 microlitri della miscela di legatura cellulare su una coclea YT due volte contenente ampicillina che è stata preriscaldata a temperatura ambiente. Incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, prelevare le colonie di DNA dalla coclea utilizzando puntali per pipette puliti.

Fai crescere le colonie in cinque millilitri di due volte. Terreno YT contenente ampicillina durante la notte a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione il giorno successivo. Utilizzare un kit di isolamento dei plasmidi secondo il protocollo del produttore per estrarre i plasmidi di DNA per ogni colonia.

Eluito raccolto, il DNA con 50 microlitri di acqua dopo la trasformazione del plasmide ricombinante nell'ospite di espressione batterica come descritto nel protocollo di testo. Prelevare una colonia dalla coclea trasformata con un inoculo di punta per pipetta. 10 millilitri di brodo sterile e formidabile o terreno di coltura per la tubercolosi contenenti antibiotici sia ampicillina che cloramfenicolo in una provetta.

Incubare questa coltura starter a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 225 giri/min. Quindi trasferire 10 millilitri di coltura starter in un litro di terreno fresco e sterile per la tubercolosi. Integrato con gli stessi antibiotici in una fiaschetta Meyer erlin da tre litri.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 225 RRP M per due o tre ore. Osservare la densità ottica della coltura a 600 nanometri o OD 600 per confermare che ha raggiunto da 0,6 a 0,8 pipettando un millilitro di coltura in un veterinario Q vuoto per la lettura. Successivamente, indurre la coltura con IPTG a una concentrazione finale di un millimolare e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 225 giri/min per altre quattro ore.

Raccogliere le cellule trasferendo la coltura in una centrifuga da un litro, in bottiglie e centrifugando a 12.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, pesare i pellet cellulari e risospendere in 10 tampone a 0,5 grammi per millilitro. Congelare la coltura cellulare risospesa a meno 80 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo scongelare la coltura cellulare congelata in un bagno d'acqua a temperatura ambiente o su ghiaccio. A L le cellule aggiungono desossi ribonucleasi, una ribonucleasi a e fenil metilsuen fluoruro. Durante lo scongelamento della soluzione, omogeneizzare la soluzione mescolando lentamente.

Dopo che tutte le cellule risospese sono state scongelate, regolare la soluzione a pH 9,0 per aumentare la solubilità delle proteine in acqua con molta attenzione. Aggiungendo sei N di idrossido di sodio goccia a goccia mescolando con ghiaccio per ottenere una consistenza omogenea. Quindi pidocchiare le cellule mediante disgregazione ultrasonica per 20 minuti su ghiaccio, utilizzando una punta piatta di due millimetri di diametro e un impulso di cinque secondi.

Centrifugare la soluzione cellulare a 12.000 Gs per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferisci il supernat in una bottiglia vuota e pulita e conservalo a quattro gradi Celsius per purificarlo in seguito. Nel frattempo, risospendere nuovamente il pellet cellulare con 10 tampone e conservare 20 microlitri di lisato cellulare.

Per la caratterizzazione della pagina SDS, ricongelare il pellet di cella risospesa a meno 80 gradi Celsius per completare la lisi cellulare. Ripetere il processo di congelamento, disgelo e sonicazione fino a tre volte. Raccogliere il lisato cellulare da prima e procedere alla purificazione delle proteine A ECM utilizzando l'ITC in cui i cicli di centrifugazione vengono eseguiti a diverse temperature in condizioni di alto sale.

Dividere il lisato cellulare in centrifuga da 50 millilitri, bottiglie e centrifugare a 40.000 g per due ore a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio per ottenere una separazione netta dal pellet. Raccogliere il surnatante in flaconi da centrifuga puliti e aggiungere cloruro di sodio a una concentrazione finale di un molare.

Riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius per due ore agitando a 225 giri/min. Prossima centrifuga. Il surnatante a 40.000 g per due ore a 37 gradi Celsius.

Dopo la decantazione, il surnatante frantuma il pellet con una spatola metallica e risospende i pezzi di pellet nel ghiaccio. Acqua distillata in autoclave fredda con agitazione vigorosa durante la notte a quattro gradi Celsius utilizzando un'ancoretta magnetica e una piastra fino a quando il pellet non è completamente sciolto. Ripetere questi cicli fino a quando il pellet a 37 gradi Celsius è bianco, a quel punto può essere sciolto in acqua per una notte e centrifugato.

Per ottenere la soluzione proteica, dissalare la soluzione proteica dializzandola con acqua distillata a quattro gradi Celsius, cambiando l'acqua ogni quattro ore o otto ore per una notte per due o tre giorni dopo aver risparmiato 20 microlitri di proteina purificata per la SDS pagina Liofilizzare il resto della proteina purificata come mostrato qui. Una banda proteica intensa si trova al peso molecolare previsto nel campione indotto. Viene mostrato anche il gel della pagina SDS contenente un campione di proteina purificata con un peso molecolare di 22 kilodalton corrispondente alla laminina cinque A ECM.

La purezza stimata delle proteine A ECM è di circa il 90-95% Questo valore è stato derivato confrontando i rapporti tra le intensità di banda della proteina bersaglio e altre bande proteiche presenti sul gel SDS. Infine, per determinare se la proteina purificata fosse effettivamente la proteina A della ECM, è stato eseguito il Western blotting. La purezza delle tre proteine A ECM viene mostrata con un gel SDS e confrontata con un'immagine della membrana di nitrocellulosa per il western blotting.

L'analisi rivela la presenza delle proteine bersaglio collagene quattro A ECM e laminato cinque A ECM marcate utilizzando anticorpi anti istidina tag coniugati con perossidasi di rafano. Le rese finali delle proteine A ECM variavano tra 60 milligrammi per litro e 120 milligrammi per litro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come contrarre e purificare le proteine contenenti domini leggeri di elastina per la tua applicazione specifica.