Flusso di lavoro completo per l'analisi dell'istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all'analisi dei dati

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una procedura semplice per valutare l'abbondanza relativa delle modificazioni post-traduzionali degli istoni, che svolgono ruoli essenziali nella biologia della cromatina, come la regolazione dell'espressione genica e la condensazione cromosomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia della cromatina. Ad esempio, quali modifiche istoniche cambiano la loro abbondanza relativa durante la stimolazione o il trattamento di determinate cellule o tessuti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che, utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, possiamo quantificare simultaneamente la maggior parte dei PTM noti su proteine note in un'unica analisi. L'analisi delle modificazioni istoniche ha numerose applicazioni, tra cui la stima dei cambiamenti epigenetici e il funzionamento della cromatina di individui o sistemi modello in seguito a trattamento farmacologico o stress. Oltre a Simone, altri due membri del mio laboratorio dimostreranno le procedure di questo protocollo.

Natarajan Bhanu, uno specialista di ricerca, e Kelly Karch, uno studente laureato. Come mostrato in questo flusso di lavoro, si tratta di un protocollo in 10 fasi che include la purificazione degli istoni da colture cellulari o tessuti, la derivatizzazione degli istoni, la digestione e la desalinizzazione e l'analisi della spettrometria di massa mediante cromatografia liquida a nanoflusso. In questo video verranno illustrate solo le procedure selezionate.

Per iniziare la procedura di isolamento dei nuclei dalle cellule intatte, scongelare con ghiaccio le cellule precedentemente raccolte e conservate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. E preparare il tampone di isolamento nucleare, o NIB, come descritto nel testo del protocollo. Rimuovere un quinto del volume di NIB e aggiungere NP-40 Alternative a una concentrazione finale dello 0,2%I restanti quattro quinti del volume verranno utilizzati per i lavaggi.

Lavare il pellet della cella con NIB senza l'alternativa NP-40, utilizzando un rapporto 1:10 tra il volume del pellet della cella e il volume del tampone. Centrifugare a 700 RCF per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Liare il pellet di cella mettendolo su ghiaccio e aggiungendo NIB con l'alternativa 0,2% NP-40 con un rapporto di 1:10 tra il volume del pellet di cella e il volume del tampone.

Omogeneizzare le cellule mediante pipettaggio delicato. Incubare le cellule omogeneizzate su ghiaccio per cinque-10 minuti affinché le cellule si lisino e rilascino i nuclei. Centrifugare a 1000 RCF per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius.

Il pellet conterrà principalmente nuclei cellulari, mentre il surnatante conterrà principalmente componenti citoplasmatici. Se lo si desidera, conservare la frazione citoplasmatica. Lavare il pellet di nuclei rimettendolo delicatamente in sospensione NIB senza l'alternativa NP-40, utilizzando un rapporto 1:10 tra il volume del pellet e il volume del tampone.

Centrifugare a 1000 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il supernatente. Dopo che NP-40 Alternative è stato completamente rimosso dal pellet di nuclei, aggiungere acido solforico molare 0,2 molare ghiacciato con un rapporto 1:5 tra il volume dei nuclei e il volume dell'acido solforico. Risospendere i nuclei nell'acido solforico mediante pipettaggio delicato.

Incubare il campione con una rotazione costante o agitando delicatamente per due o quattro ore a quattro gradi Celsius. Quindi, centrifugare il campione a 3400 RCF a quattro gradi Celsius per cinque minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Centrifugare nuovamente e trasferire il surnatante in una nuova provetta per rimuovere il materiale insolubile.

Per precipitare gli istoni, aggiungere acido tricloroacetico raffreddato al 100%, o TCA, al surnatante raccolto in un rapporto di volume 1:3. La presenza di istoni è indicata dal campione che diventa torbido. Mescolare capovolgendo il tubo alcune volte.

Incubare la miscela su ghiaccio per almeno un'ora. Centrifugare a 3400 RCF per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, gli istoni ricopriranno i lati del tubo e si depositeranno anche sul fondo.

Sul fondo del tubo si formerà anche un pellet bianco insolubile, che contiene principalmente proteine non istoniche e altre biomolecole. Rimuovere con cautela il surnatante per aspirazione, senza raschiare i lati del tubo, o il pellet sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, sciacquare il tubo con acetone ghiacciato al 100% più acido cloridrico allo 0,1%, in modo da coprire le proteine precipitate che ricoprono i lati e il fondo.

Centrifugare a 3400 RCF per due minuti. Aspirare il surnatante con cura, senza raschiare i lati o il pellet. Sciacquare la provetta con acetone ghiacciato al 100%, centrifugare nuovamente e rimuovere il surnatante senza raschiare i lati o il pellet.

Successivamente, viene eseguita la quantificazione degli istoni e l'analisi della purezza come descritto nel testo del protocollo. Prima della derivatizzazione degli istoni può essere eseguito anche un frazionamento opzionale delle varianti istoniche mediante HPLC in fase inversa. Iniziare questa procedura sciogliendo i campioni istonici in 40 microlitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari, pH 8,0.

Controllare il pH inserendo un puntale per pipetta P10 nel campione senza aspirazione e toccando il puntale della pipetta con una striscia indicatrice di pH. Utilizzare idrossido di ammonio e acido formico per regolare il pH a 8,0. Da qui in poi, tutte le fasi che prevedono l'uso dell'anidride propionica devono essere eseguite in cappa aspirante.

Processare un massimo di tre o quattro campioni alla volta, al fine di mantenere reattiva l'anidride propionica. Preparare un nuovo reagente di propionilazione mescolando anidride propionica con acetonitrile in un rapporto di volume di 1:3. Aggiungere il reagente di propionilazione a ciascun campione in un rapporto di volume di 1:4.

Aggiungere rapidamente idrossido di ammonio per ristabilire il pH 8,0 nella soluzione. Di solito, l'aggiunta di idrossido di ammonio al campione con un rapporto in volume di 1:5 è appropriata per ristabilire il pH 8,0. Mescolare immediatamente a vortice.

Controllare il pH. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo che tutti i campioni sono stati sottoposti a propionilazione, essiccare i campioni fino a 10-20 microlitri in un concentratore sottovuoto.

Risospendere o diluire i campioni con ddH20 fino a raggiungere 40 microlitri di volume finale. Poiché i sali ostacolano la cromatografia liquida e la spettrometria di massa, i campioni devono essere dissalati prima dell'analisi. Ai fini di questo video, verrà dimostrata solo la costruzione delle punte di tappa.

Utilizzare una punta per pipetta P1000 per perforare un disco di materiale C18 da un disco di estrazione in fase solida. Utilizzare un capillare in silice fusa per spingere il mini-disco fuori dal puntale P1000 e nella parte inferiore di un puntale per pipette P100 o P200. Assicurarsi che il disco sia saldamente incastrato nella parte inferiore della punta.

Se si desalinizzano più di 25 microgrammi di campione, utilizzare due mini-dischi C18 nella stessa punta P100 o P200. Utilizzare un adattatore per centrifuga per tenere in posizione le punte dello stadio in provette per microcentrifuga da 1,5 o due millilitri. Lavare la resina centrifugando con 50 microlitri di acetonitrile al 100% per attivare il materiale C18 e rimuovere potenziali contaminanti.

Successivamente viene eseguita la desalinizzazione a campione come descritto nel testo del protocollo. I peptidi istonici sono presenti in una varietà di forme isobariche. Vengono mostrati due esempi comunemente abbondanti nell'analisi degli istoni.

Il cromatogramma ionico estratto della loro massa precursore e degli isotopi relativi, mostrato sopra, è identico. Tuttavia, il cromatogramma ionico estratto degli ioni prodotto, mostrato di seguito, consente la discriminazione delle due forme isobariche. Solo gli ioni frammento unico, evidenziati in rosso, dovrebbero essere utilizzati per stimare l'abbondanza relativa delle due specie.

Sono stati analizzati gli istoni estratti da cellule staminali embrionali umane, con e senza stimolazione con acido retinoico. La quantificazione relativa di due peptidi istonici H3 ha rivelato una chiara riduzione dell'acetilazione nelle cellule staminali embrionali umane, stimolate per il differenziamento. Ciò è coerente con precedenti rapporti di acetilazione più elevata nelle cellule staminali embrionali, rispetto alle cellule differenzianti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente. Un giorno per l'estrazione degli istoni, il secondo giorno per la derivatizzazione e la digestione delle proteine e il terzo giorno per la derivatizzazione dei peptidi, lo stage-tipping e l'analisi LC-MS. La purificazione degli istoni può essere sfruttata per altri scopi diversi dall'analisi dei peptidi, tra cui la proteomica middle-down e top-down, dove è possibile caratterizzare le modificazioni istone combinatorie.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come identificare e quantificare la modificazione post-traduzionale degli istoni utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa.