Name: Flusso di lavoro completo per lanalisi dellistone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione allanalisi dei dati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Impara a caratterizzare le modificazioni post-traduzionali degli istoni mediante spettrometria di massa bottom-up. Questo protocollo completo include purificazione, derivatizzazione e analisi per studiare la biologia della cromatina.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo qui descritto è ottimizzato considerare i costi, il tempo e le prestazioni. Altre preparazioni sono possibili, ma hanno limitazioni, soprattutto nel caso di accoppiamento con analisi MS. Per esempio, il protocollo di estrazione ad alta sale può essere usato per purificare istoni 26 invece di TCA precipitazioni (punto 3). protocollo di alto sale è intrinsecamente più lieve, in quanto non utilizza acido forte. Questo conserva PTM acido-labili e aumenta il rendimento degli istoni estratti, come TCA precipitazioni co-precipitati molte altre proteine ​​di legame della cromatina. Tuttavia, l&#39;estrazione alto contenuto di sale porta a campioni contenenti il ​​sale troppo concentrato per HPLC-MS / MS. In una preparazione alternativa, istone digestione può essere eseguita senza propionylation (sezione 6 - 8), ad esempio riducendo il tempo tripsina incubazione e il rapporto enzima / substrato 27 o usando ARGC la digestione enzimatica 28-30. Tuttavia, si raccomanda derivatizzazione con anidride propionica, come hot porta alla generazione di peptidi più idrofobi, che sono meglio mantenuti durante cromatografia liquida. Per derivatizzazione chimica, una varietà di anidridi di acidi organici sono stati valutati e loro meriti ampiamente discusso 18. Tuttavia, anidride propionica dimostrò il miglior compromesso tra efficienza, prodotti laterali attenuate e migliore idrofobicità peptide. Potenzialmente, anidride propionica può essere acquistato in forma marcati con isotopi; ciò consente un&#39;analisi multiplexing a causa della possibilità di miscelazione più campioni e discriminare al livello MS sulla base delle differenti masse impartiti dall&#39;etichetta pesante. Tuttavia, tale analisi porta ad una maggiore complessità del cromatogramma LC-MS e riduce la quantità di campione che può essere iniettato per ogni singola condizione. A questo proposito, alcuni aspetti critici del protocollo devono essere evidenziati. Il seguente dovrebbe essere utilizzato come checklist per trovare errori nello svolgimento della procedura nel caso in cui si ottengono risultati negativi. In primo luogo, dopo precipitazione nuclei il pellet deve essere accuratamente lavato con NIB senza NP-40 Alternative (sezione 2.10) fino alla rimozione completa del detergente (evidente dalla mancanza di bolle durante la miscelazione). Non riuscendo a farlo comprometterebbe l&#39;estrazione istone con acidi. In secondo luogo, dopo l&#39;istone precipitazione con TCA (punto 3.9) lavaggi del pellet con acetone è cruciale. La presenza di acido concentrato avrebbe danneggiato il passo successivo, se propionylation e la digestione (paragrafo 6.1) vengono eseguite direttamente. Sarebbe non problematico in caso di frazionamento istone (sezione 5) viene eseguita. In terzo luogo, è essenziale che la reazione propionylation viene eseguita rapidamente (paragrafo 6.3 - 6.7). Per fare ciò, evitare di utilizzare lo stesso mix propionylation (propionico anidride + acetonitrile) per più di 3 - 4 campioni consecutivi. Inoltre, il pH è l&#39;aspetto più importante della tripsina digestione (sezione 7). Altrimentiintorno a 8,0 (7,5-8,5) la digestione sarà inefficace. Questo può accadere, come il campione sarà ricco di acido propionico in questa fase. NH 4 OH può essere aggiunto finché non è necessario. Inoltre, per i ricercatori che hanno familiarità con i flussi di lavoro di proteomica si sentirà normale per acidificare il campione di interrompere tripsina digestione. Questo non dovrebbe essere fatto, in quanto metterà a repentaglio la seguente reazione, vale a dire, propionylation di peptide N-Termini (paragrafo 8.1). Infine, nello stesso numero, è importante da ricordare per l&#39;analisi dei dati che i peptidi non modificati, non sono in realtà non modificato; Tutti i residui liberi di lisina e N-termini saranno occupati da propionylation (56,026 Da). Così, eseguendo l&#39;estrazione cromatografia ionica della massa corrispondente univoco alla sequenza peptidica porterebbe ad alcun risultato. I limiti del metodo sono per lo più legati alla incapacità di rilevare PTM combinatorie, a causa delle brevi sequenze peptidiche, ei pregiudizi per raggiungere il vero Abundanza di una modifica, dovuta al fatto che i peptidi in diverse forme modificate possono ionizzare con diversa efficienza. Il primo problema può essere risolto mediante la combinazione di questa tecnica con una media verso il basso o approccio top-down (rivisto in 16). Questo tipo di analisi, anche se tecnicamente più impegnativo, è ideale per studiare le frequenze di coesistenza di modifiche. Inoltre, esso consente una migliore discriminazione di varianti istoni, che non sempre possono essere conseguiti con bottom-up poiché alcuni peptidi hanno la stessa sequenza in diverse varianti istoni. Il secondo problema, legato alla efficienza di ionizzazione, può essere risolto utilizzando una libreria di peptidi sintetici 31. Questo approccio garantisce una stima più accurata della relativa abbondanza di PTM istoni. Tuttavia, nella maggior parte degli esperimenti, il risultato desiderato è le variazioni relative dei trovati modifiche tra condizioni analizzati. In questo caso, tale correzione non è necessaria, dovuta al fatto che tutti i campioni hanno gli stessi biaS. In conclusione, questo protocollo permette l&#39;analisi di PTM istoni che può essere completato in 3 giorni utilizzando nLC accoppiato a tandem MS. I confronti con tecniche diverse da MS, cioè, utilizzando strategie di anticorpi base come discusso nell&#39;Introduzione, non sono adatti, in quanto non possono ottenere ancora quasi questo livello di produttività. Inoltre, le tecniche di anticorpi base non consentono la scoperta di nuovi modifiche, ma si basano esclusivamente su conferma e quantificazione contrassegni previsti. Abbiamo quindi ipotizzare che la proteomica bottom-up su peptidi istoni si guadagnare popolarità in laboratori proteomica grazie ai vantaggi intuitivi a conoscere la regolamentazione dei marchi istoni, che sono protagonisti di espressione genica messa a punto e quindi influenzare la regolazione del proteoma. Inoltre, il protocollo descritto include i recenti miglioramenti nella preparazione dei campioni e software per l&#39;analisi dei dati, che rendono l&#39;analisi istone più banale anche per laboraTories che mai sperimentato caratterizzazione di questo tipo di peptidi hypermodified.

Epigenetica è definita come lo studio delle variazioni ereditarie nella espressione genica che sorgono da meccanismi diversi da alterare la sequenza sottostante 1. regolazione epigenetica è un fattore critico durante lo sviluppo come l&#39;organismo subisce drammatico fenotipica cambia anche se il suo contenuto di DNA non cambia. Ci sono diversi componenti critici necessari per una corretta manutenzione epigenetica, tra cui istone modificazioni post-traduzionali (PTM), le varianti istone, RNA non codificanti, la metilazione del DNA e fattori di legame al DNA, ognuno dei quali influenzano l&#39;espressione genica attraverso diversi meccanismi 2. Per esempio, mentre la metilazione del DNA è una modificazione altamente stabile che reprime traduzione gene 3, varianti istoni e PTMs istoni sono molto più dinamico e può influenzare cromatina in una varietà di modi 4. PTM istoni sono prevalentemente localizzati sulle code N-terminale, in quanto sono la regione più esposta e flessibiledella proteina. Tuttavia, il nucleo nucleosoma è anche fortemente modificata rispetto alle proteine ​​medi 5. Anche se i marchi istoni sono stati ampiamente caratterizzato negli ultimi dieci anni, molti collegamenti tra marchi istoni noti e la loro funzione non sono ancora chiare. Ciò è dovuto al fatto che la maggior parte PTMs istone non operano da soli, ma funzioni in tandem con altri PTM ( &quot;cross-talk&quot;) alterare un processo specifico come trascrizione 6,7. Ad esempio, il contrassegno H3S10K14ac combinatoria sul gene p21 attiva la trascrizione, che non si verificherebbe con uno solo dei due PTM 8. I patti proteina HP1 cromatina riconoscendo H3K9me2 / ME3 e diffondere la modifica nucleosomi vicini. Tuttavia, HP1 non può legare H3K9me2 / 3 quando l&#39;adiacente S10 è fosforilata 9. Acetilazione di H3K4 inibisce il legame della proteina spChp1 a H3K9me2 / ME3 in SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE 10. Inoltre, l&#39;istone lisina demethylase PHF8 ha la più alta efficienza di legame nucleosoma quando tre PTM H3K4me3, K9ac e K14ac sono presenti 11. Questi esempi mettono in evidenza l&#39;importanza di raggiungere una visione globale dei cambiamenti PTM istone piuttosto che concentrarsi su singole modifiche. La presenza della sequenza di varianti aumenta anche la complessità dell&#39;analisi istoni, come isotipi istoni hanno generalmente sequenze altamente simili, ma spesso hanno ruoli diversi nella cromatina. Ad esempio, H2A.x ha una sequenza C-terminale che viene più facilmente fosforilata sul danno al DNA rispetto al H2A canonica 12, ed è necessario per l&#39;inattivazione dei cromosomi sessuali in meiosi maschile del mouse 13; Allo stesso modo, CENP-A sostituisce canonica H3 istone in centromeri 14. Nonostante le loro diverse funzioni, queste varianti condividono una grande parte della loro sequenza aminoacidica con la rispettiva istone canonica, rendendo difficile identificare e quantificare separatamente. </p&gt; tecniche a base di anticorpi, come western blotting sono stati ampiamente adottati per caratterizzare istoni. Tuttavia, approcci basati su anticorpi sono limitati per i seguenti motivi: (i) possono confermare la presenza di una modifica e non possono identificare PTMs sconosciuti; (Ii) sono polarizzati a causa della presenza di segni coesistenti, che può influenzare affinità di legame; (iii) non possono identificare segni combinatori, come solo pochissimi anticorpi sono disponibili per tale scopo e (iv) attraversare-reagiscono tra le varianti istoni altamente simili o PTM simili (ad esempio, di- e trimethylation di residui di lisina). Egelhofer et al. ha descritto che più del 25% degli anticorpi commerciali non superano i test di specificità di Dot Blot o Western Blot, e tra gli anticorpi specifici oltre il 20% non in esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina 15. La spettrometria di massa (MS) è convertita in uno analitico più adatto per studiare nuovi e / o combinatori PTM,ed è stato ampiamente implementato per istoni (recensiti 16). Ciò è dovuto principalmente alla elevata sensibilità ed accuratezza di massa di MS, e la possibilità di eseguire analisi su larga scala. La strategia bottom-up è il più comunemente usato strategia proteomica MS-based per la caratterizzazione degli istoni e loro PTM, in cui la proteina intatta è enzimaticamente digerito in peptidi brevi (5-20 aa). Questo facilita sia la digestione separazione LC e la rilevazione MS. Masse nell&#39;intervallo 600 - 2.000 Da sono comunemente più facilmente ionizzati e identificati con maggiore precisione massa e risoluzione di grandi masse. MS / MS frammentazione è anche migliorata, come peptidi sono generalmente ben adatti per la dissociazione di collisione indotta (CID). Tuttavia, istoni rappresentano una sfida per la bottom-up MS in quanto sono altamente arricchito nei residui di aminoacidi essenziali, vale a dire lisina ed arginina. Pertanto, la digestione tripsina porta alla generazione di peptidi che sono troppo smtutto per la conservazione e la localizzazione LC inequivocabile del PTM. Per aggirare questo problema, il nostro protocollo comprende lisina e peptide chimico N-terminale derivatizzazione 17. L&#39;uso di anidride propionica è raccomandato efficiente derivatizzazione chimica rispetto ad altri reagenti 18. Tali blocchi derivatizzazione dei gruppi Ɛ-amino di residui di lisina non modificate e monometilici, permettendo tripsina eseguire proteolisi solo al C-terminale di residui di arginina. ammine derivatizzato non possono scambiarsi protoni con la soluzione e quindi i peptidi sono generalmente solo doppiamente o triplamente carica, facilitando MS e rilevazione MS / MS. Inoltre, derivatizzazione N-terminale aumenta peptide idrofobia e la ritenzione cromatografica quindi in fase inversa. Qui, descriviamo il flusso di lavoro per purificare istoni e li prepara per l&#39;analisi PTM tramite proteomica bottom-up (Figura 1). Questa strategia realizza quantificazione dei marchi istoni singole e marchi combinatori Fo PTMs istoni che sono relativamente vicini nella sequenza aminoacidica.

<table><tbody><tr><td>Tripsina 0,25% EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>Per la raccolta di cellule</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio, anidro</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>Microcistina</td><td>Sigma</td><td>M4194</td><td></td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi Halt, senza EDTA (100x)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Acido</td> solforico <td>alternativo CALBIOCHEM</td><td>492016</td><td></td></tr>, <tr><td>grado ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Biorad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>30% acrilammide/bis 29:1 &#8212; 500 ml</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie</td><td>Fisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonna (5 &#181; m) 2,1&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>Grace</td><td>218TP52</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonna (5 &#181; m) 4,6&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>Grace</td><td>218TP54</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>idrossido di ammonio</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>propionico anidride</td><td>Sigma</td><td>240311</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificata di grado sequenziale</td><td>Promega</td><td>PRV5113</td><td>Per digerire gli istoni per MS</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>C18 disco di estrazione</td><td>Empore</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr></tbody></table>

flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali utilizzando bottom-up spettrometria di massa: da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomi sono la più piccola unità strutturale della cromatina, composto da 147 coppie di basi di DNA avvolte attorno ad un ottamero di proteine ​​istoni. funzione Histone è mediata da una vasta modificazione post-traduzionale da una miriade di proteine ​​nucleari. Queste modifiche sono fondamentali per l&#39;integrità nucleare come regolano cromatina struttura e reclutare enzimi coinvolti nella regolazione genica, la riparazione del DNA e cromosomi condensa. Anche se una gran parte della comunità scientifica adotta tecniche a base di anticorpi per caratterizzare istone PTM abbondanza, questi approcci sono bassi throughput e prevenuto contro le proteine ​​hypermodified, come l&#39;epitopo potrebbe essere ostacolato da modifiche nelle vicinanze. Questo protocollo descrive l&#39;uso della cromatografia liquida nano (nLC) e spettrometria di massa (MS) per un&#39;accurata quantificazione modificazioni degli istoni. Questo metodo è stato progettato per caratterizzare una grande varietà di PTM istone e la relativa abbondanza di diversi istone varianti all&#39;interno di sanalisi ingle. In questo protocollo, gli istoni sono derivatizzati con anidride propionica seguita da digestione con tripsina per generare peptidi di 5-20 aa di lunghezza. Dopo la digestione, il che viene mostrata N-terminali dei peptidi istone sono derivatizzato per migliorare la ritenzione cromatografica durante NLC-MS. Questo metodo consente la quantificazione relativa dei PTM istone abbracciano quattro ordini di grandezza.

A titolo di esempio, abbiamo analizzato gli istoni estratti da cellule staminali embrionali umane (hESC) con e senza acido retinoico (RA) stimolazione, a partire da 200 microlitri pellet cellulari. La presenza di RA in coltura cellulare porta alla differenziazione ESC. Dal pellet cellulare, circa 50 - 100 mg di istoni sono stati estratti, che è più che sufficiente per eseguire iniezioni multiple LC-MS di peptidi istoni. Dopo derivatizzazione, la digestione, e dissalazione, i campioni sono stati caricati su un 75 micron x 15 centimetri C 18 colonna (diametro delle particelle 3 micron, dimensioni dei pori 300 A) in modalità seriale con un sistema di liquido nano cromatografia ad alte prestazioni con i chip microfluidica accoppiate a un ibrido lineare trappola quadrupolo - spettrometro di massa Orbitrap. acquisizione MS è stata effettuata utilizzando DIA. In parallelo, i campioni sono stati anche analizzati con un metodo DDA utilizzando un UHPLC nano-flusso accoppiato ad uno spettrometro di massa trap-Orbitrap ione ibrido (dati non mostrati). Inogni ciclo, una rilevazione completa MS Orbitrap è stata effettuata con la gamma di scansione di 290 a 1.400 m / z, una risoluzione di 60.000 (a 200 m / z) e AGC di 10 6. Poi, i dati modalità di acquisizione dipendente è stato applicato con una dinamica esclusione di 30 sec. scansioni MS / MS sono stati seguiti in ioni genitore da quelle più intense. Gli ioni con stato di carica di uno sono stati esclusi da MS / MS. È stato utilizzato un window isolamento di 2 m / z. Gli ioni erano frammentati utilizzando collisione indotta dissociazione (CID) con l&#39;energia di collisione del 35%. Rilevamento trappola ionica è stato utilizzato con modalità normale intervallo di scansione e velocità di scansione normale con AGC di 10 4. I dati grezzi MS sono stati analizzati adottando il software per l&#39;estrazione di precursori e di ioni frammento cromatogrammi, vale a dire Skyline 23 e 22 EpiProfile. EpiProfile è stato ottimizzato per i peptidi istoni, in quanto integra intelligente estrazione area del picco a causa di una precedente conoscenza di Peptempo di ritenzione marea. D&#39;altra parte, Skyline è ottimizzato per le analisi DIA, e quindi le figure DIA visualizzati (Figure 4 e 5A) sono schermate da questo software. Dal cromatogramma ionico estratta, l&#39;area sotto la curva viene recuperato, e questo viene utilizzato per stimare l&#39;abbondanza di ciascun peptide. L&#39;area del picco cromatografico è stato calcolato per il [M + H] + [M + 2H] 2+, e [M + 3H] 3+ ioni dello stesso peptide, sebbene nella maggior parte dei casi la [M + 2H] 2+ era la forma prevalente. Questo fornisce l&#39;abbondanza grezzo di una data forma modificata di un peptide. Al fine di raggiungere la relativa abbondanza di PTM, la somma di tutte le diverse forme modificate di un peptide istone stato considerato come 100%, e la zona della particolare peptide è stato diviso per l&#39;area totale di tale peptide istone in tutte le sue forme modificate . peptidi istoni sono presenti in un VArie di forme isobariche (Figura 5). Peptidi isobariche, ad esempio, K18ac e K23ac, possono essere quantificati solo a livello MS / MS, in cui vengono utilizzati i loro frammenti di ioni uniche per determinare il rapporto della specie isobariche (Figura 5A e 5B). Questo rapporto è utilizzato per dividere l&#39;area del picco cromatografico tra le due specie. Quando si utilizzano DDA, queste forme isobariche sono stati inclusi in un elenco di masse mirati, perché questi peptidi hanno bisogno di essere selezionati per la frammentazione attraverso tutta la loro eluizione, che non si verificherebbe in un esperimento di serie DDA. La discriminazione di abbondanza relativa delle specie isobariche viene eseguita controllando il profilo di eluizione dei frammenti di ioni. D&#39;altra parte, DIA tipo di acquisizione non richiede alcuna elenco di inclusione. Tuttavia, questo tipo di metodo di acquisizione non è compatibile con la ricerca di database tradizionali, e quindi potrebbe impedire la scoperta di peptidi modificati sconosciuti. <p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; lisina acetilazione (+ 42,011 Da) è stata discriminata dalla trimethylation quasi isobarica (+ 42,047 Da) utilizzando alta risoluzione di acquisizione MS (&gt; 30.000). Inoltre, acetilazione è più idrofobico di trimethylation, portando a eluizione di peptidi acetilati entro tale quelli Trimethylated. La forma non modificata dello stesso peptide eluisce anche in seguito, a causa del fatto che la lisina propionylated. In sintesi, l&#39;ordine delle idrofobicità per un peptide con un sito modificabile è di- e Trimethylated &lt;acetilata &lt;non modificato (propionylated) &lt;monometilato (propionylated). hESC hanno mostrato una netta riduzione dei peptidi acetilati quando stimolato per la differenziazione (Figura 6A e 6B). Questo non è sorprendente, come i risultati precedenti riportati superiore acetilazione in CES rispetto a quelli di differenziazione 25,che riflette la natura in generale permissivo della cromatina pluripotenti. Focalizzando l&#39;attenzione su istone H3, 35 diverse forme modificate sono stati quantificati (Figura 6C). Tuttavia, tutti proteoforms istoni che possono essere studiati con questo approccio sono più di 200, comprese tutte le varianti e modifiche istoni abbondanza basse (dati non mostrati). Inoltre, la nostra analisi ha mostrato che un&#39;alta riproducibilità può essere ottenuta tra le repliche tecniche, come dimostra la piccola dimensione delle barre di errore rappresentano (± deviazione standard). Nel loro insieme, questa sezione descrive come estrarre la relativa abbondanza di istoni modificati peptidi utilizzando i dati NLC-MS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" /> Figura 1:. Flusso di lavoro per MS / MS istoni analisi bottom-up I dieci passi per l&#39;analisi degli istoni sono mostrati, tra cui una stima del tempo necessario a ogni passo.<html> Il numero di sezione è dato tra parentesi come presente nel manoscritto. Sezione 5, descrivendo campione frazionamento di isolare le diverse varianti degli istoni, può essere omesso se non vi è la necessità di analisi ad alta sensibilità di un dato variante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" /> Figura 2: in fase inversa ad alto flusso LC per istone Variante Frazionamento e Coomassie Gel (A) cromatogramma LC-UV che rappresenta intatta la separazione degli istoni.. varianti dell&#39;istone H3 possono essere discriminati gli uni dagli altri in base al loro tempo di eluizione. Le frazioni possono essere raccolti manualmente o utilizzando un raccoglitore di frazioni automatizzato. (B) Coomassie del gel di tre repliche di purificazione istoni.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" /> Figura 3:. Making of Stage-ribaltamento spina con un puntale P1000, pugno un disco fatto di C 18 materiale da un disco di estrazione in fase solida (secondo pannello). Il minidisk si attacchi nella punta (pannello centrale), in modo che possa essere spinto fuori in un più piccolo P100 / 200 puntale utilizzando qualsiasi tipo di piccole capillare. In questo esempio, abbiamo usato un diametro esterno tubo di silice fusa 700 micron. Il minidisk deve essere spinto verso il fondo del P100 / 200 punta della pipetta finché non può andare oltre (ultimo pannello). La punta palcoscenico è pronto per l&#39;istone dissalazione, in quanto ha una capacità sufficiente per mantenere il campione di materiale sufficiente per numerose repliche. In particolare, uno minidisk è sufficiente per 15 - 20 mg di sample. Se è necessario più del campione, più dischi possono essere imballati gli uni sugli altri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" /> Figura 4:. Rappresentazione schematica della DDA e DIA metodi quando utilizza DDA, il ciclo di scansione SM è caratterizzata dalla selezione sequenziale di ioni precursori per MS / MS frammentazione base alla loro intensità e stato di carica. Una volta che uno ione precursore è stato frammentato è ubicato all&#39;interno di un elenco di esclusione per evitare selezione ripetitiva dello stesso peptide, in modo che la MS può &quot;scavare&quot; in segnali meno abbondanti. Questo metodo di acquisizione è la tecnica di scelta nella proteomica per la modalità di scoperta. La quantificazione è ottenuta integrando il segnale di scansione completa di un determinato ione accanto alle MS identificati /spettro MS. In DIA, l&#39;intera gamma di m / z è frammentato ad ogni ciclo di scansione. Questo approccio è meno adatto per la modalità di scoperta, ma produce un profilo cromatografico di tutte ioni, precursori e prodotti. Questo porta ad una quantificazione più sicuri e la discriminazione delle forme isobariche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" /> Figura 5: Quantificazione di isobariche peptidi (A) Esempio di due peptidi isobariche comunemente abbondanti nell&#39;analisi istone.. Il cromatogramma ionico estratto (XIC) della loro massa e relativi precursori isotopi (sopra) è identico. Tuttavia, la XIC degli ioni prodotto (sotto) consente la discriminazione delle due forme isobariche. In particolare, gli ioni frammento solo unico deve essere noiEd per stimare l&#39;abbondanza relativa delle due specie. (B) Rappresentazione degli ioni frammento uniche per i due peptidi descritti (evidenziato in rosso). (C) Lista dei peptidi comunemente analizzati in Homo sapiens che hanno almeno un equivalente isobarica. Sequenza varianti tra i peptidi istone elencati sono indicati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" /> Figura 6: Risultati rappresentativi di cellule staminali embrionali umane con e senza retinoico trattamento acido (A) quantificazione relativa della istone H3 peptide KQLATKAAR (aa 18 - 26), in tutte le sue proteoforms modificati.. La relativa abbondanza è stato stimato utilizzando tutti proteoforms come 100% (relpercentuale ativo del peptide non modificato non è mostrato) (B) quantificazione relativa della istone H3 peptide KSTGGKAPR (aa 9 -.. 17) (C) abbondanza relativa dei peptidi identificati per canonica H3 istone con e senza trattamento delle cellule con acido retinoico. La figura indica in quale delle due trattamenti le date modifiche sono più abbondanti (&gt; 50%). Nel complesso, abbiamo dimostrato che l&#39;acetilazione dell&#39;istone H3 diminuisce nella maggior parte dei residui di lisina su induzione della differenziazione cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> soluzione # </td><td colspan="7"> Composizione </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="7"> Isolamento nucleare Buffer (NIB) stock è composto come segue e conservato congelato a 100 ml aliquote a -20 ° C; scongelatiNIB può essere conservato a 4 ° C per alcune settimane: 15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, e 250 mM di saccarosio. Il pH del tampone viene regolato a 7,5 con HCl. </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="7"> Inibitori della proteasi (aggiungere fresco di buffer prima dell&#39;uso): 1 M ditiotreitolo (DTT) in DDH 2 O (1,000x); 200 mm AEBSF in DDH 2 O (400x) </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="7"> inibitore fosfatasi (aggiungere fresco di buffer prima dell&#39;uso): 2,5 micron microcistina in 100% di etanolo (500x) </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="7"> inibitori HDAC (aggiungere fresco di buffer prima dell&#39;uso): 5 M di sodio butirrato, realizzati da una titolazione di acido butirrico 5 M con NaOH a pH 7.0 (500x) </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="7"> NP-40 Alternativa: 10% v / v in DDH 2 O </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="7"> 0.2 MH 2 SO 4 in DDH 2 O </td></tr><tr><td> 7</td><td colspan="7"> Acido tricloroacetico (TCA): 100% w / v in DDH 2 O </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="7"> Acetone + 0,1% di acido cloridrico (HCl): 0,1% v / v HCl in acetone </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Solutions.

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completamente integrato per la caratterizzazione di istone modificazioni post-traslazionali utilizzando la spettrometria di massa (MS). Il flusso di lavoro prevede la purificazione istone da colture di cellule o tessuti, istone derivatizzazione e la digestione, analisi MS utilizzando nano-flusso cromatografia liquida e le istruzioni per l&#39;analisi dei dati. Il protocollo è stato progettato per il completamento entro 2 - 3 giorni.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una procedura semplice per valutare l'abbondanza relativa delle modifiche post-traduzionali degli istoni, che svolgono ruoli essenziali nella biologia della cromatina, come la regolazione dell'espressione genica e la condensazione dei cromosomi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della cromatina, ad esempio quali modifiche degli istoni cambiano la loro abbondanza relativa in seguito a stimolazione o trattamento di specifiche cellule o tessuti.Il principale vantaggio di questa tecnica è che, utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, possiamo quantificare contemporaneamente la maggior parte delle PTM note su proteine note in un'unica analisi. L'analisi delle modifiche istoniche ha numerose applicazioni, tra cui la stima dei cambiamenti epigenetici e del funzionamento della cromatina in individui o sistemi modello dopo trattamento con farmaci o stress. Oltre a Simone, altri due membri del mio laboratorio dimostreranno le procedure di questo protocollo.Natarajan Bhanu, specialista della ricerca, e Kelly Karch, studentessa laureanda. Come mostrato in questo flusso di lavoro, si tratta di un protocollo in 10 passaggi che include la purificazione delle istoni da colture cellulari o tessuti, la derivatizzazione delle istoni, la digestione e la desalinizzazione, e l'analisi mediante spettrometria di massa utilizzando cromatografia liquida a flusso nanometrico. Nel presente video verranno dimostrate solo alcune procedure selezionate.Per iniziare la procedura di isolamento dei nuclei da cellule intatte, scongelare sul ghiaccio le cellule precedentemente raccolte e conservate a meno 80 gradi Celsius. Preparare quindi il buffer per l'isolamento nucleare, o NIB, come descritto nel testo del protocollo. Rimuovere un quinto del volume di NIB e aggiungere NP-40 Alternative fino a una concentrazione finale dello 0,2%. Il volume rimanente, pari ai quattro quinti, verrà utilizzato per i lavaggi.Lavare il pellet cellulare con NIB senza NP-40 Alternative, utilizzando un rapporto 1:10 tra volume del pellet cellulare e volume del buffer. Centrifugare a 700 RCF per cinque minuti ed eliminare il soprannatante. Lisiare il pellet cellulare ponendolo sul ghiaccio e aggiungendo NIB con NP-40 Alternative 0,2% in rapporto 1:10 tra volume del pellet cellulare e volume del buffer.Omogeneizzare le cellule mediante pipettaggio delicato. Incubare le cellule omogeneizzate sul ghiaccio per cinque-dieci minuti affinché le cellule lisino e rilascino i nuclei. Centrifugare a 1000 RCF per cinque-dieci minuti a quattro gradi Celsius.Il pellet conterrà principalmente nuclei cellulari, mentre il soprannatante conterrà soprattutto componenti citoplasmatici. Conservare la frazione citoplasmatica se desiderato. Lavare il pellet di nuclei risospendendolo delicatamente in NIB senza NP-40 Alternative, utilizzando un rapporto 1:10 tra volume del pellet e volume del buffer.Centrifugare a 1000 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il soprannatante. Dopo che l'NP-40 Alternative &egrave; stato completamente rimosso dal pellet di nuclei, aggiungere acido solforico 0,2 molare freddo a ghiaccio in un rapporto di 1:5 tra il volume dei nuclei e il volume dell'acido solforico. Ri-sospendere i nuclei nell'acido solforico mediante pipettaggio delicato.Incubare il campione con rotazione costante o agitazione delicata per due-quattro ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il campione a 3400 RCF a quattro gradi Celsius per cinque minuti e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Centrifugare nuovamente e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo per rimuovere qualsiasi materiale insolubile.Per precipitare le istoni, aggiungere acido tricloroacetico (TCA) freddo al 100% al sopranatante raccolto in un rapporto volumetrico di 1:3. La presenza di istoni è indicata dall'aspetto torbido del campione. Mescolare capovolgendo il tubo alcune volte.Incubare la miscela su ghiaccio per almeno un'ora. Centrifugare a 3400 RCF per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, le istoni rivestiranno i lati del tubo e si depositeranno anche sul fondo.Un pellet bianco e insolubile si formerà anche nella parte più bassa del tubo, che contiene principalmente proteine non istoniche e altre biomolecole. Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione, senza raschiare le pareti del tubo né il pellet sul fondo. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, risciacquare il tubo con acetone al 100% freddo di ghiaccio contenente lo 0,1% di acido cloridrico, in modo da ricoprire le proteine precipitate che rivestono le pareti e il fondo.Centrifugare a 3400 RCF per due minuti. Aspirare con attenzione il soprannatante, senza raschiare le pareti o il pellet. Risciacquare il tubo con acetone al 100% ghiacciato, centrifugare nuovamente ed eliminare il soprannatante senza raschiare le pareti o il pellet.In seguito, viene eseguita la quantificazione degli istoni e l'analisi della purezza come descritto nel testo del protocollo. Una frazionamento opzionale delle varianti degli istoni mediante HPLC in fase inversa può essere effettuato anche prima della derivatizzazione degli istoni. Iniziare questa procedura sciogliendo i campioni di istoni in 40 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare, pH 8,0.Verificare il pH inserendo la punta di una pipetta P10 nel campione senza aspirare, e toccando la punta della pipetta con una striscia indicatrice di pH. Utilizzare idrossido di ammonio e acido formico per regolare il pH a 8,0. Da questo punto in poi, tutti i passaggi che prevedono l'uso di anidride propionica devono essere eseguiti in cappa aspirante.Elaborare un massimo di tre o quattro campioni alla volta, al fine di mantenere reattivo l'anidride propionica. Preparare un reagente di propionilazione fresco mescolando l'anidride propionica con acetonitrile in un rapporto volumetrico di 1:3. Aggiungere il reagente di propionilazione a ciascun campione in un rapporto volumetrico di 1:4.Aggiungere rapidamente idrossido di ammonio per ripristinare il pH 8,0 nella soluzione. Di solito, è appropriato aggiungere idrossido di ammonio al campione in un rapporto volumetrico di 1:5 per ripristinare il pH 8,0. Mescolare immediatamente mediante vortex. Verificare il pH. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo che tutti i campioni hanno subito la propionilazione, essiccare i campioni fino a un volume di 10-20 microlitri in un concentratore sotto vuoto.Risospendere o diluire i campioni con ddH2O fino a raggiungere un volume finale di 40 microlitri. Poiché i sali interferiscono con la cromatografia liquida e la spettrometria di massa, i campioni devono essere desalati prima dell'analisi. Ai fini di questo video, verrà dimostrata soltanto la costruzione delle stage-tip.Utilizzare una punta per pipetta P1000 per prelevare un disco di materiale C18 da un disco per estrazione in fase solida. Usare una capillare in silice fusa per spingere il minidisco fuori dalla punta P1000 e sul fondo di una punta per pipetta P100 o P200. Assicurarsi che il disco sia saldamente incastrato sul fondo della punta.Se si desalinizza un campione superiore a 25 microgrammi, utilizzare due dischetti mini C18 nella stessa punta P100 o P200. Utilizzare un adattatore per centrifuga per mantenere le punte al loro posto all'interno di provette microcentrifuga da 1,5 o due millilitri. Lavare la resina centrifugando con 50 microlitri di acetonitrile al 100% per attivare il materiale C18 e rimuovere eventuali contaminanti.La desalazione del campione viene successivamente eseguita come descritto nel testo del protocollo. I peptidi istonici sono presenti in una varietà di forme isobariche. Vengono mostrati due esempi comunemente abbondanti nell'analisi degli istoni.Il cromatogramma degli ioni estratti della loro massa precursore e degli isotopi relativi, mostrato sopra, è identico. Tuttavia, il cromatogramma degli ioni prodotto, mostrato sotto, consente di discriminare le due forme isobariche. Solo gli ioni frammento unici, evidenziati in rosso, devono essere utilizzati per stimare l'abbondanza relativa delle due specie.Le istone estratte da cellule staminali embrionali umane, con e senza stimolazione da acido retinoico, sono state analizzate. La quantificazione relativa di due peptidi dell'istone H3 ha rivelato una chiara riduzione dell'acetilazione nelle cellule staminali embrionali umane stimolate a differenziarsi. Questo risultato è in accordo con precedenti studi che riportano un livello maggiore di acetilazione nelle cellule staminali embrionali rispetto alle cellule in differenziamento.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se svolta correttamente: un giorno per l'estrazione delle istoni, il secondo giorno per la derivatizzazione e la digestione delle proteine e il terzo giorno per la derivatizzazione dei peptidi, il caricamento in colonna e l'analisi mediante LC-MS. La purificazione degli istoni può essere sfruttata per scopi diversi dall'analisi dei peptidi, inclusi la proteomica middle-down e top-down, nelle quali è possibile caratterizzare modifiche combinatorie degli istoni.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare e quantificare le modifiche post-traduzionali degli istoni mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.

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Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una guida completa, sistematica per la purificazione efficiente degli istoni H3 e H4 e la quantificazione dei residui degli istoni acetilati.

Purificazione di H3 e H4 proteine istoniche e la quantificazione degli istoni acetilati marchi nelle cellule e tessuto cerebrale

Il protocollo è stato sviluppato per estrarre efficacemente istoni intatti dai materiali fogliari di sorgo per la profilazione di modifiche post-tras trasunzionali istone che possono servire come potenziali marcatori epigenetici per aiutare le colture resistenti alla siccità ingegneristica.

Isolamento dell'istono dal tessuto fogliare di sorgo per la profilazione della spettrometria di massa dall'alto verso il basso dei potenziali marcatori epigenetici

Questo protocollo delinea come un sistema di coltura cellulare tridimensionale può essere utilizzato per modellare, trattare e analizzare le modifiche della cromatina in uno stato quasi fisiologico.

Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico

Un flusso di lavoro analitico basato sulla cromatografia liquida, sulla spettrometria di mobilità ionica intrappolata e sulla spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-TOF MS/MS) per un'analisi "bottom-up" ad alta affidabilità e altamente riproducibile delle modificazioni istoniche e l'identificazione in base ai parametri principali (tempo di ritenzione [RT], sezione d'urto di collisione [CCS] e rapporto massa-carica [m/z] accurato).

Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo

Questo protocollo consente un'estrazione efficiente degli istoni da vari campioni clinici per una successiva analisi di modifiche post-traduzionali tramite LC-MS/MS. Facilitando una rilevazione robusta delle principali modifiche agli istoni, rappresenta uno strumento prezioso per un profiling epigenetico completo in grandi coorti cliniche.

Estrazione degli istoni da campioni clinici per profilazione epigenetica tramite spettrometria di massa

Qui presentiamo un protocollo per automatizzare l'analisi post-traduzionale delle modifiche degli istoni a singola cellula utilizzando una strategia di marcatura isotopica a due plex e la digestione ArgC. Questo flusso di lavoro consente un profiling quantitativo, riproducibile e ad alta sensibilità dell'eterogeneità della cromatina e delle risposte epigenetiche a risoluzione di singola cellula.

Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

Nucleosoma ELISA (NU-ELISA) è un metodo sensibile e quantitativa per rilevare modelli globali di modificazioni post-traduzionali nelle preparazioni dei nativi, nucleosomi intatto. Queste modifiche includono methylations, acetylations e fosforilazioni a specifici residui di aminoacidi degli istoni, e quindi NU-ELISA fornisce un test globale proteomica della complessivo stati modificazione della cromatina di tipi cellulari specifici.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

Un approccio affidabile e utile per rilevare modificazioni degli istoni sui geni impianto specifico è descritto. L'approccio combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e real-time PCR quantitativa. Esso consente il rilevamento di modifiche degli istoni su specifici geni con un ruolo in diversi processi fisiologici.

Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Descriviamo una serie di saggi per analizzare i livelli di espressione di istoni linker H1. mRNA di geni H1 individuali sono quantitativamente misurato casuale trascrizione inversa primer a base seguita da PCR in tempo reale, mentre la quantificazione della proteina istoni H1 è ottenuta mediante analisi HPLC.

Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi

Impara a caratterizzare le modificazioni post-traduzionali degli istoni mediante spettrometria di massa bottom-up. Questo protocollo completo include purificazione, derivatizzazione e analisi per studiare la biologia della cromatina.

Flusso di lavoro completo per lanalisi dellistone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione allanalisi dei dati (Video) | JoVE Journal

Flusso di lavoro completo per l'analisi dell'istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all'analisi dei dati

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