Flusso di lavoro completo per l'analisi dell'istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all'analisi dei dati

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una procedura semplice per valutare l'abbondanza relativa delle modifiche post-traduzionali degli istoni, che svolgono ruoli essenziali nella biologia della cromatina, come la regolazione dell'espressione genica e la condensazione dei cromosomi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della cromatina, ad esempio quali modifiche degli istoni cambiano la loro abbondanza relativa in seguito a stimolazione o trattamento di specifiche cellule o tessuti.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che, utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, possiamo quantificare contemporaneamente la maggior parte delle PTM note su proteine note in un'unica analisi. L'analisi delle modifiche istoniche ha numerose applicazioni, tra cui la stima dei cambiamenti epigenetici e del funzionamento della cromatina in individui o sistemi modello dopo trattamento con farmaci o stress. Oltre a Simone, altri due membri del mio laboratorio dimostreranno le procedure di questo protocollo.

Natarajan Bhanu, specialista della ricerca, e Kelly Karch, studentessa laureanda. Come mostrato in questo flusso di lavoro, si tratta di un protocollo in 10 passaggi che include la purificazione delle istoni da colture cellulari o tessuti, la derivatizzazione delle istoni, la digestione e la desalinizzazione, e l'analisi mediante spettrometria di massa utilizzando cromatografia liquida a flusso nanometrico. Nel presente video verranno dimostrate solo alcune procedure selezionate.

Per iniziare la procedura di isolamento dei nuclei da cellule intatte, scongelare sul ghiaccio le cellule precedentemente raccolte e conservate a meno 80 gradi Celsius. Preparare quindi il buffer per l'isolamento nucleare, o NIB, come descritto nel testo del protocollo. Rimuovere un quinto del volume di NIB e aggiungere NP-40 Alternative fino a una concentrazione finale dello 0,2%. Il volume rimanente, pari ai quattro quinti, verrà utilizzato per i lavaggi.

Lavare il pellet cellulare con NIB senza NP-40 Alternative, utilizzando un rapporto 1:10 tra volume del pellet cellulare e volume del buffer. Centrifugare a 700 RCF per cinque minuti ed eliminare il soprannatante. Lisiare il pellet cellulare ponendolo sul ghiaccio e aggiungendo NIB con NP-40 Alternative 0,2% in rapporto 1:10 tra volume del pellet cellulare e volume del buffer.

Omogeneizzare le cellule mediante pipettaggio delicato. Incubare le cellule omogeneizzate sul ghiaccio per cinque-dieci minuti affinché le cellule lisino e rilascino i nuclei. Centrifugare a 1000 RCF per cinque-dieci minuti a quattro gradi Celsius.

Il pellet conterrà principalmente nuclei cellulari, mentre il soprannatante conterrà soprattutto componenti citoplasmatici. Conservare la frazione citoplasmatica se desiderato. Lavare il pellet di nuclei risospendendolo delicatamente in NIB senza NP-40 Alternative, utilizzando un rapporto 1:10 tra volume del pellet e volume del buffer.

Centrifugare a 1000 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il soprannatante. Dopo che l'NP-40 Alternative è stato completamente rimosso dal pellet di nuclei, aggiungere acido solforico 0,2 molare freddo a ghiaccio in un rapporto di 1:5 tra il volume dei nuclei e il volume dell'acido solforico. Ri-sospendere i nuclei nell'acido solforico mediante pipettaggio delicato.

Incubare il campione con rotazione costante o agitazione delicata per due-quattro ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il campione a 3400 RCF a quattro gradi Celsius per cinque minuti e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Centrifugare nuovamente e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo per rimuovere qualsiasi materiale insolubile.

Per precipitare le istoni, aggiungere acido tricloroacetico (TCA) freddo al 100% al sopranatante raccolto in un rapporto volumetrico di 1:3. La presenza di istoni è indicata dall'aspetto torbido del campione. Mescolare capovolgendo il tubo alcune volte.

Incubare la miscela su ghiaccio per almeno un'ora. Centrifugare a 3400 RCF per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, le istoni rivestiranno i lati del tubo e si depositeranno anche sul fondo.

Un pellet bianco e insolubile si formerà anche nella parte più bassa del tubo, che contiene principalmente proteine non istoniche e altre biomolecole. Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione, senza raschiare le pareti del tubo né il pellet sul fondo. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, risciacquare il tubo con acetone al 100% freddo di ghiaccio contenente lo 0,1% di acido cloridrico, in modo da ricoprire le proteine precipitate che rivestono le pareti e il fondo.

Centrifugare a 3400 RCF per due minuti. Aspirare con attenzione il soprannatante, senza raschiare le pareti o il pellet. Risciacquare il tubo con acetone al 100% ghiacciato, centrifugare nuovamente ed eliminare il soprannatante senza raschiare le pareti o il pellet.

In seguito, viene eseguita la quantificazione degli istoni e l'analisi della purezza come descritto nel testo del protocollo. Una frazionamento opzionale delle varianti degli istoni mediante HPLC in fase inversa può essere effettuato anche prima della derivatizzazione degli istoni. Iniziare questa procedura sciogliendo i campioni di istoni in 40 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare, pH 8,0.

Verificare il pH inserendo la punta di una pipetta P10 nel campione senza aspirare, e toccando la punta della pipetta con una striscia indicatrice di pH. Utilizzare idrossido di ammonio e acido formico per regolare il pH a 8,0. Da questo punto in poi, tutti i passaggi che prevedono l'uso di anidride propionica devono essere eseguiti in cappa aspirante.

Elaborare un massimo di tre o quattro campioni alla volta, al fine di mantenere reattivo l'anidride propionica. Preparare un reagente di propionilazione fresco mescolando l'anidride propionica con acetonitrile in un rapporto volumetrico di 1:3. Aggiungere il reagente di propionilazione a ciascun campione in un rapporto volumetrico di 1:4.

Aggiungere rapidamente idrossido di ammonio per ripristinare il pH 8,0 nella soluzione. Di solito, è appropriato aggiungere idrossido di ammonio al campione in un rapporto volumetrico di 1:5 per ripristinare il pH 8,0. Mescolare immediatamente mediante vortex.

Verificare il pH. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo che tutti i campioni hanno subito la propionilazione, essiccare i campioni fino a un volume di 10-20 microlitri in un concentratore sotto vuoto.

Risospendere o diluire i campioni con ddH2O fino a raggiungere un volume finale di 40 microlitri. Poiché i sali interferiscono con la cromatografia liquida e la spettrometria di massa, i campioni devono essere desalati prima dell'analisi. Ai fini di questo video, verrà dimostrata soltanto la costruzione delle stage-tip.

Utilizzare una punta per pipetta P1000 per prelevare un disco di materiale C18 da un disco per estrazione in fase solida. Usare una capillare in silice fusa per spingere il minidisco fuori dalla punta P1000 e sul fondo di una punta per pipetta P100 o P200. Assicurarsi che il disco sia saldamente incastrato sul fondo della punta.

Se si desalinizza un campione superiore a 25 microgrammi, utilizzare due dischetti mini C18 nella stessa punta P100 o P200. Utilizzare un adattatore per centrifuga per mantenere le punte al loro posto all'interno di provette microcentrifuga da 1,5 o due millilitri. Lavare la resina centrifugando con 50 microlitri di acetonitrile al 100% per attivare il materiale C18 e rimuovere eventuali contaminanti.

La desalazione del campione viene successivamente eseguita come descritto nel testo del protocollo. I peptidi istonici sono presenti in una varietà di forme isobariche. Vengono mostrati due esempi comunemente abbondanti nell'analisi degli istoni.

Il cromatogramma degli ioni estratti della loro massa precursore e degli isotopi relativi, mostrato sopra, è identico. Tuttavia, il cromatogramma degli ioni prodotto, mostrato sotto, consente di discriminare le due forme isobariche. Solo gli ioni frammento unici, evidenziati in rosso, devono essere utilizzati per stimare l'abbondanza relativa delle due specie.

Le istone estratte da cellule staminali embrionali umane, con e senza stimolazione da acido retinoico, sono state analizzate. La quantificazione relativa di due peptidi dell'istone H3 ha rivelato una chiara riduzione dell'acetilazione nelle cellule staminali embrionali umane stimolate a differenziarsi. Questo risultato è in accordo con precedenti studi che riportano un livello maggiore di acetilazione nelle cellule staminali embrionali rispetto alle cellule in differenziamento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se svolta correttamente: un giorno per l'estrazione delle istoni, il secondo giorno per la derivatizzazione e la digestione delle proteine e il terzo giorno per la derivatizzazione dei peptidi, il caricamento in colonna e l'analisi mediante LC-MS. La purificazione degli istoni può essere sfruttata per scopi diversi dall'analisi dei peptidi, inclusi la proteomica middle-down e top-down, nelle quali è possibile caratterizzare modifiche combinatorie degli istoni.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare e quantificare le modifiche post-traduzionali degli istoni mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.