Metodo di Interazione DNA-DNA con Cromatina Associata a RNA

Abbiamo sviluppato il metodo di interazione DNA-DNA con cromatina associata a RNA, o metodo RDD, per mappare il contatto con la cromatina organizzato da specifiche molecole di RNA. RDD mappa in modo robusto il banding specifico dell'RNA per la cromatina e l'interazione a lungo raggio tra RNA endogeni ed esogeni. Per cominciare, risospendere il pellet dei nuclei permeabilizzati derivato da cellule doppie reticolate di Drosophila S2 in 15 millilitri di buffer di lisi allo 0,1% FA contenente Triton X-100.

Aliquota 1,5 millilitri della sospensione nucleare in una provetta da 14 millilitri a fondo rotondo evitando la formazione di bolle. Sonica la sospensione a un'ampiezza del 38% per 4,5 minuti usando cicli di 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento. Raccogli la cromatina sonicata in un tubo da 15 millilitri e centrifuga a 3, 200g per 20 minuti a temperatura ambiente.

Trasferire circa 13 millilitri del sovrantagente in un nuovo tubo da 15 millilitri. Ora, aggiungi 100 microlitri di sfere preparate di strreptavidina C1 nel tubo contenente cromatina sonicata e ruota per 20 minuti a temperatura ambiente. Poi, posiziona il tubo su un rack magnetico per un minuto e trasferisci il sovrantantante contenente la cromatina pre-cleared in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Conserva un'aliquota da 10 microlitri a meno 20 gradi Celsius per l'analisi. Incubare 26 millilitri di tampone di ibridazione appena preparato con 13 millilitri di cromatina pre-cleared su un rotatore per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, si tratta di aliquota della miscela di ibridazione in tre tubi da 15 millilitri e si aggiungono sei microlitri di sonde biotinilate da 100 micromolari a ciascun campione.

Dopo aver sigillato i tappi dei tubi con la pellicola, ruota i tubi a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver bloccato le sfere di stretavidina C1, rimuovere il tampone bloccante e risospendere le sfere in 400 microlitri di tampone di ibridazione. Ora, aggiungere le sfere di stretavidina C1 trattate con tampone bloccanti alla cromatina ibrida corrispondente preparata in precedenza.

Ruota la miscela per 2,5 ore a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il sovrantato e trasferito le sfere in un tubo da 1,5 millilitri, lavare le sfere cinque volte con 800 microlitri di tampone di lavaggio e poi due volte con tampone TE. Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere le sfere in 1.000 microlitri di tampone TE contenente 1X inibitore della proteasi a temperatura ambiente.

Per bloccare i siti non occupati sulle sfere di sreptavidina C1 legate al complesso sonda-cromatina, aggiungere 220 microlitri di IPB denaturato alle sfere e ruotare il tubo a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le perle di Streptavidina C1 cinque volte usando il tampone TE. Successivamente, aggiungi 693 microlitri di miscela di riparazione alla cromatina sulle perle di streptavidina C1 e mescola bene.

Poi, aggiungi sette microlitri di DNA polimerasi T4. Incubare la miscela su un termomiscelatore a 800 giri al minuto e 12 gradi Celsius per 30 minuti. Poi incubare il campione su un mixer a 16 gradi Celsius per 15 minuti.

Lava le palline tre volte con 800 microlitri di buffer ChIA-PET ghiacciato e poi una volta con il tampone TE. Poi, aggiungi 693 microlitri di miscela A-tailing alla cromatina sulle perle di Streptavidina C1 e mescola bene. Successivamente, aggiungere sette microlitri di esonucleasi prima da tre primi a cinque primi minori.

Incubare il tubo su un mixer a 12 giri al minuto e a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Lava le perline tre volte con 800 microlitri di tampone ChIA-PET ghiacciato e poi una volta con tampone per eluzione pipettando delicatamente. Ora, aggiungi 1.390 microlitri di miscela di ligatura di prossimità alla cromatina sulle sfere di streptavidina C1 e incuba su un mixer a temperatura ambiente per cinque minuti.

Aggiungi 10 microlitri di legasi di DNA T4 alla miscela e incuba con rotazione a 20 giri al minuto a temperatura ambiente per cinque minuti, poi passa a 12 rivoluzioni al minuto a temperatura ambiente per 50 minuti e prosegue l'incubazione a 16 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, lava le perne tre volte con 800 microlitri di tampone ChIA-PET gelato e poi due volte con tampone TE. Per il rilascio della cromatina, aggiungi 480 microlitri di LC ChIP elution buffer alla cromatina sulle perle di streptavidina C1 e mescola bene.

Aggiungi 20 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K per la de-reticolazione. Incubare il tubo su un termomiscelatore a 950 giri al minuto e 65 gradi Celsius durante la notte, poi purificare il DNA legato in prossimità usando un reagente fenolico:cloroformio:isoamil alcol. Aggiungi tutti i componenti necessari per il test di etichettatura Tn5 in un volume di reazione totale di 50 microlitri in un tubo PCR su ghiaccio.

Incubare la reazione di marcatura a 55 gradi Celsius per 10 minuti in un termociclatore con il coperchio impostato a 70 gradi Celsius, poi mantenerla a quattro gradi Celsius. Aggiungi 50 microlitri di tampone di eluzione ChIP e un microlitro di proteinasi K al DNA marcato. Mescola la soluzione e incuba su un termomiscelatore a 65 gradi Celsius e 900 giri al minuto per 30 minuti.

Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA e quantificare il DNA utilizzando un sistema automatico di elettroforesi capillare. Aggiungi tutto il DNA frammentato e ligato a sfere M280 prebloccate con buffer bloccante e DNA genomico e mescola la sospensione. Ruota il tubo di un mixer a temperatura ambiente per 45 minuti.

Dopo una breve rotazione, posiziona il tubo su un rack magnetico e scarta il surnadante. Seguendo i passaggi di lavaggio, aggiungi 30 microlitri di tampone di eluzione alle perle senza mescolarle. Prepara la miscela PCR secondo il kit di preparazione della biblioteca del DNA.

Trasferisci le valvole PCR a una macchina PCR e imposta il programma di amplificazione. Infine, dopo aver purificato il prodotto PCR usando sfere magnetiche, misurare da 10 a 30 nanogrammi di DNA biblioteca utilizzando un quantificatore di acidi nucleici per preparare il campione al sequenziamento. I frammenti di cromatina sonicata variavano da circa 1.000 a 3.000 coppie di base, indicando una frammentazione riuscita e ricavata.

La cromatina associata all'RNA mostrava un intervallo di dimensioni dei frammenti che va da circa 1.000 a 3.000 coppie di basi. La cromatina marcata con Tn5 ha mostrato una distribuzione dei frammenti indicativa dell'efficienza della marcatura della cromatina. La libreria di sequenziamento dopo amplificazione mostrava una distribuzione della dimensione dei frammenti che variava da circa 180 a 1.000 coppie di base.

Dopo la selezione delle dimensioni, i frammenti della libreria di sequenziamento sono stati arricchiti prevalentemente in un intervallo di circa 250-600 coppie di base. L'interazione DNA-DNA con cromatina associata all'RNA, o metodo RDD, ha rilevato le posizioni genomiche del legame roX2 e 7SK di RNA NC, insieme ai corrispondenti anelli di interazione remoti della cromatina. I dati della RNA polimerasi II ChIA-PET rivelano una chiara relazione regolatoria tra questi RNA NC e l'espressione genica, con picchi che indicano la forza dell'interazione.

L'analisi multidimensionale è stata ottenuta integrando interazioni ancorate alla RDD con mappe di conformazione della cromatina genomica a livello genomico Hi-C e marchi epigenomici, trascrizione nascente e dati ChIA-PET della polimerasi RNA II. In queste regioni, domini topologicamente associati erano chiaramente visualizzati, con anelli di cromatina guidati da RNA spesso situati ai loro confini o che attraversavano più di questi domini. Inoltre, sono stati determinati i centri regolatori sull'RNA.

RDD e interazioni con cromatina ancorate rivelando siti di legame RNA e interazioni DNA-DNA associate nell'organizzazione genomica 3D. Gli insegnamenti chiave sono il mantenimento dei corretti rapporti di sonda, linker e cromatina e il blocco dei siti di streptavinina non limitati con la biotina naturale prima della legazione della polimerasi. Studi futuri possono esplorare come l'RNA avvolga dinamicamente le interazioni della cromatina attraverso sviluppo, perturbazioni e infezioni.