Metodo di Interazione DNA-DNA con Cromatina Associata a RNA
30 aprile 2026
Qui presentiamo un protocollo per catturare le interazioni DNA-DNA cromatina associate all'RNA per mappare l'organizzazione genomica tridimensionale correlata all'RNA.
Abbiamo sviluppato il metodo di interazione DNA-DNA con cromatina associata a RNA, o metodo RDD, per mappare il contatto con la cromatina organizzato da specifiche molecole di RNA. RDD mappa in modo robusto il banding specifico dell'RNA per la cromatina e l'interazione a lungo raggio tra RNA endogeni ed esogeni. Per cominciare, risospendere il pellet dei nuclei permeabilizzati derivato da cellule doppie reticolate di Drosophila S2 in 15 millilitri di buffer di lisi allo 0,1% FA contenente Triton X-100.
Aliquota 1,5 millilitri della sospensione nucleare in una provetta da 14 millilitri a fondo rotondo evitando la formazione di bolle. Sonica la sospensione a un'ampiezza del 38% per 4,5 minuti usando cicli di 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento. Raccogli la cromatina sonicata in un tubo da 15 millilitri e centrifuga a 3, 200g per 20 minuti a temperatura ambiente.
Trasferire circa 13 millilitri del sovrantagente in un nuovo tubo da 15 millilitri. Ora, aggiungi 100 microlitri di sfere preparate di strreptavidina C1 nel tubo contenente cromatina sonicata e ruota per 20 minuti a temperatura ambiente. Poi, posiziona il tubo su un rack magnetico per un minuto e trasferisci il sovrantantante contenente la cromatina pre-cleared in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Conserva un'aliquota da 10 microlitri a meno 20 gradi Celsius per l'analisi. Incubare 26 millilitri di tampone di ibridazione appena preparato con 13 millilitri di cromatina pre-cleared su un rotatore per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, si tratta di aliquota della miscela di ibridazione in tre tubi da 15 millilitri e si aggiungono sei microlitri di sonde biotinilate da 100 micromolari a ciascun campione.
Dopo aver sigillato i tappi dei tubi con la pellicola, ruota i tubi a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver bloccato le sfere di stretavidina C1, rimuovere il tampone bloccante e risospendere le sfere in 400 microlitri di tampone di ibridazione. Ora, aggiungere le sfere di stretavidina C1 trattate con tampone bloccanti alla cromatina ibrida corrispondente preparata in precedenza.
Ruota la miscela per 2,5 ore a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il sovrantato e trasferito le sfere in un tubo da 1,5 millilitri, lavare le sfere cinque volte con 800 microlitri di tampone di lavaggio e poi due volte con tampone TE. Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere le sfere in 1.000 microlitri di tampone TE contenente 1X inibitore della proteasi a temperatura ambiente.
Per bloccare i siti non occupati sulle sfere di sreptavidina C1 legate al complesso sonda-cromatina, aggiungere 220 microlitri di IPB denaturato alle sfere e ruotare il tubo a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le perle di Streptavidina C1 cinque volte usando il tampone TE. Successivamente, aggiungi 693 microlitri di miscela di riparazione alla cromatina sulle perle di streptavidina C1 e mescola bene.
Poi, aggiungi sette microlitri di DNA polimerasi T4. Incubare la miscela su un termomiscelatore a 800 giri al minuto e 12 gradi Celsius per 30 minuti. Poi incubare il campione su un mixer a 16 gradi Celsius per 15 minuti.
Lava le palline tre volte con 800 microlitri di buffer ChIA-PET ghiacciato e poi una volta con il tampone TE. Poi, aggiungi 693 microlitri di miscela A-tailing alla cromatina sulle perle di Streptavidina C1 e mescola bene. Successivamente, aggiungere sette microlitri di esonucleasi prima da tre primi a cinque primi minori.
Incubare il tubo su un mixer a 12 giri al minuto e a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Lava le perline tre volte con 800 microlitri di tampone ChIA-PET ghiacciato e poi una volta con tampone per eluzione pipettando delicatamente. Ora, aggiungi 1.390 microlitri di miscela di ligatura di prossimità alla cromatina sulle sfere di streptavidina C1 e incuba su un mixer a temperatura ambiente per cinque minuti.
Aggiungi 10 microlitri di legasi di DNA T4 alla miscela e incuba con rotazione a 20 giri al minuto a temperatura ambiente per cinque minuti, poi passa a 12 rivoluzioni al minuto a temperatura ambiente per 50 minuti e prosegue l'incubazione a 16 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, lava le perne tre volte con 800 microlitri di tampone ChIA-PET gelato e poi due volte con tampone TE. Per il rilascio della cromatina, aggiungi 480 microlitri di LC ChIP elution buffer alla cromatina sulle perle di streptavidina C1 e mescola bene.
Aggiungi 20 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K per la de-reticolazione. Incubare il tubo su un termomiscelatore a 950 giri al minuto e 65 gradi Celsius durante la notte, poi purificare il DNA legato in prossimità usando un reagente fenolico:cloroformio:isoamil alcol. Aggiungi tutti i componenti necessari per il test di etichettatura Tn5 in un volume di reazione totale di 50 microlitri in un tubo PCR su ghiaccio.
Incubare la reazione di marcatura a 55 gradi Celsius per 10 minuti in un termociclatore con il coperchio impostato a 70 gradi Celsius, poi mantenerla a quattro gradi Celsius. Aggiungi 50 microlitri di tampone di eluzione ChIP e un microlitro di proteinasi K al DNA marcato. Mescola la soluzione e incuba su un termomiscelatore a 65 gradi Celsius e 900 giri al minuto per 30 minuti.
Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA e quantificare il DNA utilizzando un sistema automatico di elettroforesi capillare. Aggiungi tutto il DNA frammentato e ligato a sfere M280 prebloccate con buffer bloccante e DNA genomico e mescola la sospensione. Ruota il tubo di un mixer a temperatura ambiente per 45 minuti.
Dopo una breve rotazione, posiziona il tubo su un rack magnetico e scarta il surnadante. Seguendo i passaggi di lavaggio, aggiungi 30 microlitri di tampone di eluzione alle perle senza mescolarle. Prepara la miscela PCR secondo il kit di preparazione della biblioteca del DNA.
Trasferisci le valvole PCR a una macchina PCR e imposta il programma di amplificazione. Infine, dopo aver purificato il prodotto PCR usando sfere magnetiche, misurare da 10 a 30 nanogrammi di DNA biblioteca utilizzando un quantificatore di acidi nucleici per preparare il campione al sequenziamento. I frammenti di cromatina sonicata variavano da circa 1.000 a 3.000 coppie di base, indicando una frammentazione riuscita e ricavata.
La cromatina associata all'RNA mostrava un intervallo di dimensioni dei frammenti che va da circa 1.000 a 3.000 coppie di basi. La cromatina marcata con Tn5 ha mostrato una distribuzione dei frammenti indicativa dell'efficienza della marcatura della cromatina. La libreria di sequenziamento dopo amplificazione mostrava una distribuzione della dimensione dei frammenti che variava da circa 180 a 1.000 coppie di base.
Dopo la selezione delle dimensioni, i frammenti della libreria di sequenziamento sono stati arricchiti prevalentemente in un intervallo di circa 250-600 coppie di base. L'interazione DNA-DNA con cromatina associata all'RNA, o metodo RDD, ha rilevato le posizioni genomiche del legame roX2 e 7SK di RNA NC, insieme ai corrispondenti anelli di interazione remoti della cromatina. I dati della RNA polimerasi II ChIA-PET rivelano una chiara relazione regolatoria tra questi RNA NC e l'espressione genica, con picchi che indicano la forza dell'interazione.
L'analisi multidimensionale è stata ottenuta integrando interazioni ancorate alla RDD con mappe di conformazione della cromatina genomica a livello genomico Hi-C e marchi epigenomici, trascrizione nascente e dati ChIA-PET della polimerasi RNA II. In queste regioni, domini topologicamente associati erano chiaramente visualizzati, con anelli di cromatina guidati da RNA spesso situati ai loro confini o che attraversavano più di questi domini. Inoltre, sono stati determinati i centri regolatori sull'RNA.
RDD e interazioni con cromatina ancorate rivelando siti di legame RNA e interazioni DNA-DNA associate nell'organizzazione genomica 3D. Gli insegnamenti chiave sono il mantenimento dei corretti rapporti di sonda, linker e cromatina e il blocco dei siti di streptavinina non limitati con la biotina naturale prima della legazione della polimerasi. Studi futuri possono esplorare come l'RNA avvolga dinamicamente le interazioni della cromatina attraverso sviluppo, perturbazioni e infezioni.
Overview
The RNA-Associated Chromatin DNA-DNA Interaction Method (RDD) is a targeted approach for mapping chromatin interactions anchored by specific RNAs. This technique enables simultaneous identification of genomic loci associated with a target RNA and the resolution of long-range DNA-DNA contacts among these loci, providing insights into spatial genome organization and regulatory mechanisms.
Key Study Components
Area of Science
- Genomics
- Epigenetics
- Molecular Biology
Background
- Chromatin interactions play a crucial role in gene regulation and genome architecture.
- RNAs, including coding and non-coding types, can organize chromatin and influence gene expression.
- Existing methods often lack the ability to map chromatin interactions specifically anchored by RNAs.
- Understanding RNA-mediated chromatin organization is essential for dissecting regulatory networks.
Purpose of Study
- To develop a robust method for mapping chromatin interactions anchored by specific RNAs.
- To enable high-resolution identification of RNA-associated genomic loci and their spatial contacts.
- To facilitate the study of enhancer-promoter pairing and long-range gene regulation mediated by RNAs.
Methods Used
- Use of biotinylated antisense probes complementary to the target RNA for enrichment of RNA-chromatin complexes.
- Cell crosslinking, chromatin fragmentation, and end-repair.
- Proximity ligation using a designed linker to join spatially adjacent DNA fragments within captured complexes.
- Purification of ligation products, sequencing library preparation, and high-throughput sequencing.
- Bioinformatic analysis to generate RNA-anchored chromatin interaction maps.
Main Results
- RDD enables locus-specific, high-resolution mapping of chromatin contacts anchored by RNAs.
- The method is applicable to both endogenous and exogenous RNAs, including those from viruses and microorganisms.
- RDD is compatible with diverse cell types and experimental conditions.
- The workflow is robust and reproducible, yielding detailed contact profiles for regulatory studies.
Conclusions
- RDD provides a powerful tool for dissecting the three-dimensional genome architecture associated with regulatory RNAs.
- The method advances understanding of how RNAs organize chromatin and regulate gene expression.
- RDD is broadly applicable for studying enhancer-promoter interactions and long-range genomic regulation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
The RNA-Associated Chromatin DNA-DNA Interaction Method (RDD) enables biopharma R&D teams to map chromatin interactions anchored by specific RNAs, providing high-resolution insight into regulatory genome architecture. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at early discovery and preclinical inflection points, especially for RNA-mediated regulatory pathways. RDD's compatibility with diverse cell types and both endogenous and exogenous RNAs enhances its portfolio relevance for complex disease models and host-pathogen studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA-mediated regulatory mechanisms and spatial genome organization.
- Supports functional target validation by mapping RNA-associated chromatin contacts.
- Facilitates mechanistic de-risking for RNA and chromatin-modifying targets.
- Provides locus-specific data to inform predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin interaction maps for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative contact profiles for assay standardization.
- Enables platform reuse across coding and non-coding RNA targets.
- Supports reliable evaluation of compounds affecting RNA-chromatin interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by mapping regulatory RNA interactions in diverse cell types.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of RNA-mediated pathways.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for RNA-targeted therapeutics.
- Supports biomarker identification through high-resolution chromatin contact profiling.
Pipeline & Workflow Integration
RDD integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target identification and translational research.
- Discovery Biology: Reveals RNA-anchored chromatin interactions to clarify regulatory pathways and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides quantitative, reproducible contact maps for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates high-resolution sequencing data for comparative analysis of chromatin contacts across conditions.
- Translational Research: Enables mapping of disease-relevant RNA interactions in primary or model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, adaptable workflow for diverse RNA and chromatin research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-mediated regulation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible chromatin interaction mapping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of RNA and chromatin-modifying targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology, RNA biochemistry, and next-generation sequencing.
- Needs access to high-throughput sequencing and bioinformatics infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe design and data analysis.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with protocol optimization.
- Dependent on probe specificity and sequencing depth for resolution and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:25
Chromatin Fragmentation and Preclearing with Streptavidin C1 Beads
1:51
Chromatin-RNA Probe Hybridization and Immobilization on Streptavidin C1 Beads
3:42
On-Bead Chromatin End-Repair and A-Tailing
4:59
Chromatin Proximity Ligation and Release from the Streptavidin C1 Beads
6:22
Tn5 Tagmentation of Proximity-Ligated DNA
7:19
Immobilization and PCR Amplification of Ligated DNA on M280 Beads
8:23
Results
10:18
Conclusion
