Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina
2 ottobre 2017
Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.
L'obiettivo generale della procedura di estrazione sequenziale con sali è caratterizzare i profili di legame proteico alla cromatina globale e valutare come tale legame venga alterato quando la proteina o il suo ambiente vengono modificati. Questo metodo misura l'affinità relativa dei regolatori epigenetici per la cromatina e può essere utilizzato per valutare come tali interazioni cambino in seguito a manipolazioni genetiche, chimiche e ambientali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che rappresenta un modo rapido ed economico per valutare i profili di legame delle proteine che interagiscono con la cromatina.
I ricercatori alle prime armi nel campo della cromatina spesso incontrano difficoltà con l'immunoprecipitazione della cromatina, o ChIP. L'estrazione sequenziale con sale è una tecnica consolidata che anche i ricercatori meno esperti possono utilizzare per rispondere a molte delle stesse domande. Per iniziare la procedura, raccogliere 8.000.000 di cellule da ciascuna linea cellulare di interesse.
Lavare ogni campione cellulare due volte con cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Risospendere ogni campione in un millilitro di un buffer ipotonico con inibitori della proteasi. Trasferire le sospensioni cellulari in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro.
Ruotare le sospensioni, dall'alto verso il basso, per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi centrifugare la sospensione per cinque minuti alla stessa temperatura a 6.000 G. Scartare il soprannatante. Equipaggiare una micropipetta con un puntale da un millilitro.
Aggiungere al pellet 200 microlitri di buffer RIPA modificato senza sale con inibitori della proteasi. Toccare delicatamente la punta della pipetta sul fondo del tubo da microcentrifuga per aspirare il pellet all'interno della punta. Aspirare e rilasciare il pellet su e giù per 15 volte.
Il campione dovrebbe diventare denso e appiccicoso man mano che il pellet si disgrega. Omogeneizzare ogni campione in questo modo e incubare i campioni sul ghiaccio per tre minuti. Successivamente, centrifugare i campioni a 6500 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire i soprannatanti in provette pulite da 1,5 millilitro per microcentrifuga. Aggiungere a ogni pellet 200 millilitri di buffer RIPA modificato contenente cloruro di sodio 100 millimolare e inibitori delle proteasi. Aspirare e rilasciare il pellet 15 volte con la pipetta.
Se il pellet è inizialmente difficile da aspirare nella punta della pipetta, battere leggermente la punta sul fondo del tubo. Ripetere questo procedimento per ogni campione e incubare i campioni sul ghiaccio per tre minuti. Centrifugare i campioni a 6500 G's a quattro gradi Celsius per tre minuti.
Trasferire i soprannatanti in nuovi tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri. Continuare ad estrarre i campioni in soluzioni di buffer RIPA modificato con concentrazioni crescenti di cloruro di sodio. Quando il pellet non rimane più sul fondo del tubo, posizionare il pellet sul cappuccio del tubo da centrifuga prima di decantare il soprannatante.
Dopo l'estrazione seriale con sale, aggiungere a ciascun campione 70 millilitri di tampone di carico proteico quattro volte concentrato a ciascuna delle cinque frazioni di sopranatante. Caricare 30 microlitri di ciascuna frazione su un gel di acrilamide SDS. Eseguire un western blot standard trasferendo le proteine su una membrana e rivelando con gli anticorpi primari appropriati.
Incubare la membrana con anticorpi secondari marcati con un colorante infrarosso e acquisire l'immagine della membrana. Utilizzare un software di analisi dell'immagine per calcolare l'intensità delle bande per ciascuna concentrazione di sale. Riportare l'intensità delle bande in funzione della concentrazione di sale per determinare il profilo di eluizione della proteina di interesse.
L'estrazione sequenziale con sale delle proteine ARID1a e Polybromo 1 ha mostrato un'eluzione costante rispettivamente con concentrazioni di sale di 200 e 300 millimolari. L'estrazione non sequenziale con sale delle stesse proteine ha mostrato risultati meno costanti. Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato per ciascuna proteina in esame.
Pertanto, l'SSE è stato utilizzato per esaminare i profili di eluizione dopo diversi tempi di incubazione. Un attivatore trascrizionale, Polybromo 1, ha mostrato profili di eluizione simili quando incubato per tre minuti e per 10 minuti. Il represseore trascrizionale, Complesso Repressivo Polycomb 1, indicato da BMI1, ha richiesto più di tre minuti per essere rilasciato dalla cromatina.
Le interazioni proteina-proteina sono state studiate analizzando il cambiamento nei profili di eluizione. In presenza di un inibitore, la proteina contenente il bromodominio quattro è stata eluita a concentrazioni di sale più basse rispetto all'assenza di inibitore. Sono state osservate differenze nei modelli delle istoni quando le cellule sono state trattate con un inibitore dell'istone deacetilasi, alterando il paesaggio della cromatina.
Le variazioni nel legame proteico quando le cellule subivano stress genomico si riflettevano anche nei profili di eluizione. In questo caso, l'aumento della concentrazione di sale necessaria per l'eluizione suggeriva che Polybromo 1 si lega più strettamente alla cromatina dopo il danno al DNA indotto da doxorubicina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se effettuata correttamente.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, ricordarsi di essere il più coerente possibile nel trattamento di ciascun campione. Questa procedura può essere utilizzata nelle fasi iniziali di uno studio per chiarire il meccanismo e la regolazione di una proteina legante la cromatina. Ciò consente di risparmiare tempo e denaro su studi a livello genomica non necessari.
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Panoramica
La procedura di estrazione sequenziale con sale è progettata per caratterizzare i profili di legame proteico alla cromatina globale e valutare come questi legami vengano modificati da diverse manipolazioni. Questo metodo è particolarmente utile per valutare l'affinità dei regolatori epigenetici nei confronti della cromatina.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia della cromatina
- Interazioni proteiche
- Epigenetica
Sfondo
- L'estrazione sequenziale con sale è una tecnica utilizzata per lo studio delle proteine leganti la cromatina.
- Offre un'alternativa rapida ed economica alla immunoprecipitazione della cromatina (ChIP).
- Questo metodo è accessibile anche per scienziati inesperti.
- Permette di valutare come le interazioni proteiche cambiano in risposta a fattori genetici, chimici e ambientali.
Scopo dello studio
- Caratterizzare i profili di legame delle proteine leganti la cromatina.
- Valutare gli effetti di diverse manipolazioni sul legame proteico.
- Fornire un metodo semplice e diretto per i ricercatori che operano nel campo della cromatina.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di 8.000.000 di cellule da ciascuna linea cellulare di interesse.
- Estrazione sequenziale con sale per isolare le proteine legate alla cromatina.
- Valutazione dell'affinità di legame delle proteine alla cromatina.
- Valutazione dei cambiamenti nei profili di legame in diverse condizioni.
Risultati principali
- Il metodo caratterizza efficacemente i profili di legame delle proteine.
- Illustra come le affinità di legame possano essere modificate da fattori ambientali.
- I risultati indicano l'utilità di questa tecnica sia per ricercatori esperti che per principianti.
- Fornisce informazioni sulle interazioni tra regolatori epigenetici e cromatina.
Conclusioni
- L'estrazione sequenziale con sale è uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni della cromatina.
- Il metodo è efficiente e accessibile per diverse applicazioni di ricerca.
- Migliora la comprensione della dinamica del legame proteico nella biologia della cromatina.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'estrazione sequenziale con sale (SSE) fornisce un metodo rapido ed economico per valutare l'affinità delle proteine leganti la cromatina, consentendo una validazione precoce delle proteine bersaglio nella scoperta di farmaci focalizzata sull'epigenetica. Quantificando come perturbazioni genetiche, chimiche o ambientali alterano le interazioni tra proteine e cromatina, la SSE supporta la riduzione del rischio meccanicistico dei complessi che modificano la cromatina prima di avviare saggi ad alta richiesta di risorse. Questo approccio migliora la capacità predittiva nell'identificazione dei composti promettenti, distinguendo gli effetti diretti del legame da risposte cellulari indirette.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Misura le variazioni dell'affinità di legame relativa quando vengono perse subunità del complesso o inattivati domini, chiarificando i contributi funzionali delle singole proteine all'interazione con la cromatina.
- Valore scientifico: Profila i modelli di eluizione in condizioni di concentrazioni crescenti di sale per differenziare il legame specifico alla cromatina da associazioni non specifiche, riducendo i falsi positivi nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Consente a persone non esperte di generare dati quantitativi sul legame senza richiedere competenze specialistiche in ChIP, accelerando la verifica delle ipotesi nelle fasi iniziali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili di eluizione riproducibili che fungono da letture quantitative per lo screening degli effetti dei composti sulle alterazioni del paesaggio della cromatina.
- Valore operativo: Utilizza infrastrutture standard per il western blot e analisi delle immagini, facilitando la standardizzazione del saggio tra diversi laboratori e riducendo la variabilità tecnica.
- Valore operativo: Richiede soltanto apparecchiature di base per la centrifugazione e l'elettroforesi, riducendo le barriere all'adozione nelle sequenze di screening di modulatori epigenetici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le alterazioni dell'ambiente della cromatina (ad esempio, tramite inibitori dell'HDAC) a cambiamenti nel legame proteico, sostenendo studi meccanicistici allineati a biomarcatori in sistemi rilevanti per la malattia.
- Valore scientifico: Valuta gli spostamenti del legame in condizioni di stress genomico (ad esempio, danno al DNA indotto da doxorubicina), fornendo informazioni per modelli predittivi dell'interazione con il bersaglio in condizioni fisiopatologiche.
- Valore operativo: Complementa i saggi cellulari e biochimici fornendo una validazione ortogonale della continuità delle interazioni con la cromatina, dalla fase di scoperta a quella preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
SSE si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, offrendo un collegamento meccanicistico tra saggi biochimici di legame e letture fenotipiche cellulari nei programmi di epigenetica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando come alterazioni complesse influenzino il legame alla cromatina, consentendo la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio biologico dei bersagli epigenetici.
- Screening: Fornisce profili di eluizione dipendenti dal sale come output quantitativi per confrontare i cambiamenti dello stato della cromatina indotti da composti in diverse campagne di screening.
- Analisi: Genera dati sull'intensità delle bande riportati in funzione della concentrazione di sale, fornendo variazioni calcolabili dell'affinità di legame che informano le discussioni sulle relazioni struttura-attività.
- Ricerca traslazionale: Collega i cambiamenti del legame in vitro alle modifiche del paesaggio della cromatina cellulare, supportando l'allineamento dei biomarcatori traslazionali quando abbinati a letture funzionali.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità standardizzata e a basso costo applicabile a diversi bersagli della cromatina, promuovendo il riutilizzo della piattaforma nei percorsi di scoperta di farmaci epigenetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del target distinguendo il legame diretto alla cromatina dagli effetti cellulari indiretti attraverso un'eluzione controllata con sale.
- Valore operativo: Fornisce profili di legame riproducibili e quantitativi utilizzando attrezzature di laboratorio ampiamente disponibili, migliorando la standardizzazione tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Riduce la dipendenza da esperimenti ChIP a bassa produttività per le valutazioni iniziali del legame, migliorando l'efficienza nell'utilizzo delle risorse nei progetti iniziali di epigenetica.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei target appartenenti a complessi modificatori della cromatina, basata sulla resilienza quantitativa del legame alle perturbazioni ambientali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica della cromatina e nella quantificazione dei blot westhern per garantire un'interpretazione accurata dei profili di eluizione.
- È subordinato all'accesso a centrifughe refrigerate, provette per microcentrifuga e strumentazione standard per SDS-PAGE e immunoblotting.
- Necessita di protocolli standardizzati per il prelievo e la lisi cellulare al fine di ridurre al minimo la variabilità tra i campioni e assicurare risultati comparabili nelle estrazioni saline.
- Richiede l'ottimizzazione dei tempi di incubazione per ciascuna proteina bersaglio, poiché la cinetica di rilascio dall'associazione varia tra i diversi complessi che modificano la cromatina.
- Si limita a confronti di affinità relativi; la determinazione delle costanti di legame assolute richiede metodi biofisici ortogonali per la validazione.
