Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

L'obiettivo generale della procedura di estrazione sequenziale del sale è quello di caratterizzare i profili di legame delle proteine con la cromatina di massa e di valutare come il legame viene alterato quando la proteina, o il suo ambiente, viene manipolato. Questo metodo misura l'affinità relativa dei regolatori epigenetici alla cromatina e può essere utilizzato per valutare come tali interazioni cambiano in seguito a manipolazione genetica, chimica e ambientale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo rapido ed economico per valutare i profili di legame delle proteine leganti la cromatina.

Gli individui nuovi al campo della cromatina spesso lottano con l'immunoprecipitazione della cromatina, o ChIP. L'estrazione sequenziale del sale è una vecchia tecnica che anche gli scienziati inesperti possono utilizzare per rispondere a molte delle stesse domande. Per iniziare la procedura, raccogliere 8.000.000 di cellule da ciascuna linea cellulare di interesse.

Lavare due volte ogni campione di cellula con cinque millilitri di PBS ghiacciato. Risospendere ogni campione e un millilitro di un tampone ipotonico con inibitori della proteasi. Trasferire le sospensioni cellulari in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Ruotare le sospensioni, dall'alto verso il basso, per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi centrifugare la sospensione per cinque minuti alla stessa temperatura a 6.000 G. Scartare il surnatante. Dotare una micro pipetta di un puntale da un millilitro.

Aggiungere al pellet 200 microlitri di tampone ripa modificato senza sale con inibitori della proteasi. Picchiettare il puntale della pipetta contro il fondo della provetta per microcentrifuga per aspirare il pellet nel puntale. Pipettare il pellet su e giù 15 volte.

Il campione dovrebbe diventare denso e appiccicoso man mano che il pellet si rompe. Omogeneizzare ogni campione in questo modo e incubare i campioni su ghiaccio per tre minuti. Quindi centrifugare i campioni a 6500 G in quattro gradi Celsius per tre minuti.

Trasferire i surnatanti in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ad ogni pellet aggiungere 200 millilitri di tampone ripa modificato con 100 millimolari di cloruro di sodio e con inibitori della proteasi. Pipettare il pellet su e giù 15 volte.

Se inizialmente il pellet è difficile da aspirare nel puntale della pipetta, picchiettare il puntale sul fondo della provetta. Ripetere questo processo per ogni campione e incubare i campioni su ghiaccio per tre minuti. Centrifugare i campioni a 6500 G a quattro gradi Celsius per tre minuti.

Trasferire i surnatanti in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Continuare l'estrazione dei campioni in soluzioni tampone ripa modificate con concentrazioni crescenti di cloruro di sodio. Quando il pellet non rimane più sul fondo della provetta, posizionare il pellet nel tappo della provetta da centrifuga prima di travasare il surnatante.

Dopo l'estrazione seriale del sale, per ogni campione, aggiungere 70 millilitri di colorante caricante quattro volte le proteine a ciascuna delle cinque frazioni surnatanti. Caricare 30 microlitri di ciascuna frazione su un gel di acrilammide SDS. Eseguire un western blot standard trasferendo le proteine su una membrana e colorandole con gli anticorpi primari appropriati.

Incubare il blot in anticorpi secondari marcati con un colorante a infrarossi e visualizzare il blot. Utilizzare un software di analisi delle immagini per calcolare l'intensità della banda di ciascuna concentrazione di sale. Tracciare l'intensità della banda rispetto alla concentrazione di sale per determinare il modello di eluizione della proteina di interesse.

L'estrazione sequenziale delle proteine ARID1a e Polybromo 1 ha mostrato un'eluizione costante con concentrazioni di sale rispettivamente di 200 e 300 millimolari. L'estrazione non sequenziale di sali delle stesse proteine ha mostrato risultati meno coerenti. Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato per ogni proteina esaminata.

Pertanto, l'SSE è stato utilizzato per esaminare i profili di eluizione dopo aver variato la lunghezza dell'incubazione. Un attivatore trascrizionale, Polybromo 1, ha mostrato profili di eluizione simili quando è stato incubato per tre minuti e 10 minuti. Il repressore trascrizionale, Polycomb Repressive Complex 1, indicato da BMI1, ha avuto bisogno di più di tre minuti per essere rilasciato dalla cromatina.

Le interazioni proteina-proteina sono state studiate esaminando il cambiamento nei profili di eluizione. In presenza di un inibitore, il bromodomain contenente la proteina quattro alludeva a concentrazioni di sale inferiori rispetto a quelle senza l'inibitore. Differenze nei pattern istonici sono state osservate quando le cellule sono state trattate con un inibitore dell'istone deacetilasi, alterando il paesaggio della cromatina.

I cambiamenti nel legame proteico quando le cellule hanno subito stress genomico si sono riflessi anche nei profili di eluizione. Qui, l'aumento della concentrazione di sale necessaria per l'eluizione, ha suggerito che il Polybromo 1 si lega più strettamente alla cromatina in seguito al danno al DNA con la doxorubicina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, ricorda di essere il più coerente possibile con il trattamento di ciascun campione. Questa procedura può essere utilizzata nelle fasi iniziali di uno studio per chiarire il meccanismo e la regolazione di una proteina legante la cromatina. Ciò consente di risparmiare tempo e denaro su studi inutili sull'intero genoma.