Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina
2 ottobre 2017
Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.
L'obiettivo generale della procedura di estrazione sequenziale del sale è quello di caratterizzare i profili di legame delle proteine con la cromatina di massa e di valutare come il legame viene alterato quando la proteina, o il suo ambiente, viene manipolato. Questo metodo misura l'affinità relativa dei regolatori epigenetici alla cromatina e può essere utilizzato per valutare come tali interazioni cambiano in seguito a manipolazione genetica, chimica e ambientale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo rapido ed economico per valutare i profili di legame delle proteine leganti la cromatina.
Gli individui nuovi al campo della cromatina spesso lottano con l'immunoprecipitazione della cromatina, o ChIP. L'estrazione sequenziale del sale è una vecchia tecnica che anche gli scienziati inesperti possono utilizzare per rispondere a molte delle stesse domande. Per iniziare la procedura, raccogliere 8.000.000 di cellule da ciascuna linea cellulare di interesse.
Lavare due volte ogni campione di cellula con cinque millilitri di PBS ghiacciato. Risospendere ogni campione e un millilitro di un tampone ipotonico con inibitori della proteasi. Trasferire le sospensioni cellulari in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Ruotare le sospensioni, dall'alto verso il basso, per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi centrifugare la sospensione per cinque minuti alla stessa temperatura a 6.000 G. Scartare il surnatante. Dotare una micro pipetta di un puntale da un millilitro.
Aggiungere al pellet 200 microlitri di tampone ripa modificato senza sale con inibitori della proteasi. Picchiettare il puntale della pipetta contro il fondo della provetta per microcentrifuga per aspirare il pellet nel puntale. Pipettare il pellet su e giù 15 volte.
Il campione dovrebbe diventare denso e appiccicoso man mano che il pellet si rompe. Omogeneizzare ogni campione in questo modo e incubare i campioni su ghiaccio per tre minuti. Quindi centrifugare i campioni a 6500 G in quattro gradi Celsius per tre minuti.
Trasferire i surnatanti in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ad ogni pellet aggiungere 200 millilitri di tampone ripa modificato con 100 millimolari di cloruro di sodio e con inibitori della proteasi. Pipettare il pellet su e giù 15 volte.
Se inizialmente il pellet è difficile da aspirare nel puntale della pipetta, picchiettare il puntale sul fondo della provetta. Ripetere questo processo per ogni campione e incubare i campioni su ghiaccio per tre minuti. Centrifugare i campioni a 6500 G a quattro gradi Celsius per tre minuti.
Trasferire i surnatanti in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Continuare l'estrazione dei campioni in soluzioni tampone ripa modificate con concentrazioni crescenti di cloruro di sodio. Quando il pellet non rimane più sul fondo della provetta, posizionare il pellet nel tappo della provetta da centrifuga prima di travasare il surnatante.
Dopo l'estrazione seriale del sale, per ogni campione, aggiungere 70 millilitri di colorante caricante quattro volte le proteine a ciascuna delle cinque frazioni surnatanti. Caricare 30 microlitri di ciascuna frazione su un gel di acrilammide SDS. Eseguire un western blot standard trasferendo le proteine su una membrana e colorandole con gli anticorpi primari appropriati.
Incubare il blot in anticorpi secondari marcati con un colorante a infrarossi e visualizzare il blot. Utilizzare un software di analisi delle immagini per calcolare l'intensità della banda di ciascuna concentrazione di sale. Tracciare l'intensità della banda rispetto alla concentrazione di sale per determinare il modello di eluizione della proteina di interesse.
L'estrazione sequenziale delle proteine ARID1a e Polybromo 1 ha mostrato un'eluizione costante con concentrazioni di sale rispettivamente di 200 e 300 millimolari. L'estrazione non sequenziale di sali delle stesse proteine ha mostrato risultati meno coerenti. Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato per ogni proteina esaminata.
Pertanto, l'SSE è stato utilizzato per esaminare i profili di eluizione dopo aver variato la lunghezza dell'incubazione. Un attivatore trascrizionale, Polybromo 1, ha mostrato profili di eluizione simili quando è stato incubato per tre minuti e 10 minuti. Il repressore trascrizionale, Polycomb Repressive Complex 1, indicato da BMI1, ha avuto bisogno di più di tre minuti per essere rilasciato dalla cromatina.
Le interazioni proteina-proteina sono state studiate esaminando il cambiamento nei profili di eluizione. In presenza di un inibitore, il bromodomain contenente la proteina quattro alludeva a concentrazioni di sale inferiori rispetto a quelle senza l'inibitore. Differenze nei pattern istonici sono state osservate quando le cellule sono state trattate con un inibitore dell'istone deacetilasi, alterando il paesaggio della cromatina.
I cambiamenti nel legame proteico quando le cellule hanno subito stress genomico si sono riflessi anche nei profili di eluizione. Qui, l'aumento della concentrazione di sale necessaria per l'eluizione, ha suggerito che il Polybromo 1 si lega più strettamente alla cromatina in seguito al danno al DNA con la doxorubicina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, ricorda di essere il più coerente possibile con il trattamento di ciascun campione. Questa procedura può essere utilizzata nelle fasi iniziali di uno studio per chiarire il meccanismo e la regolazione di una proteina legante la cromatina. Ciò consente di risparmiare tempo e denaro su studi inutili sull'intero genoma.
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Panoramica
La procedura di Estrazione Salina Sequenziale è progettata per caratterizzare i profili di legame proteico alla cromatina di massa e valutare come questi legami siano alterati da varie manipolazioni. Questo metodo è particolarmente utile per valutare l'affinità dei regolatori epigenetici verso la cromatina.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia della cromatina
- Interazioni proteiche
- Epigenetica
Sfondo
- L'Estrazione Salina Sequenziale è una tecnica per studiare le proteine che si legano alla cromatina.
- Offre un'alternativa rapida e conveniente all'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP).
- Questo metodo è accessibile anche per gli scienziati inesperti.
- Consente la valutazione di come le interazioni proteiche cambiano con fattori genetici, chimici e ambientali.
Obiettivo dello studio
- Caratterizzare i profili di legame delle proteine che si legano alla cromatina.
- Valutare gli effetti di varie manipolazioni sul legame proteico.
- Fornire un metodo semplice per i ricercatori nel campo della cromatina.
Metodi utilizzati
- Raccolta di 8.000.000 di cellule da ogni linea cellulare di interesse.
- Estrazione salina sequenziale per isolare le proteine legate alla cromatina.
- Valutazione dell'affinità di legame proteico alla cromatina.
- Valutazione dei cambiamenti nei profili di legame in diverse condizioni.
Risultati principali
- Il metodo caratterizza efficacemente i profili di legame proteico.
- Dimostra come le affinità di legame possano essere alterate da fattori ambientali.
- I risultati indicano l'utilità di questa tecnica sia per i ricercatori esperti che per quelli alle prime armi.
- Fornisce informazioni sulle interazioni dei regolatori epigenetici con la cromatina.
Conclusioni
- L'Estrazione Salina Sequenziale è uno strumento prezioso per studiare le interazioni cromatinica.
- Il metodo è efficiente e accessibile per varie applicazioni di ricerca.
- Migliora la comprensione della dinamica del legame proteico nella biologia della cromatina.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Sequential Salt Extraction (SSE) provides a rapid, cost-effective method to evaluate chromatin-binding protein affinity, enabling early-stage target validation in epigenetics-focused drug discovery. By quantifying how genetic, chemical, or environmental perturbations alter protein-chromatin interactions, SSE supports mechanistic de-risking of chromatin-modifying complexes before committing to resource-intensive assays. This approach improves predictive confidence in lead identification by distinguishing direct binding effects from indirect cellular responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding affinity changes when complex subunits are lost or domains inactivated, clarifying functional contributions of individual proteins to chromatin engagement.
- Scientific Value: Profiles elution patterns under increasing salt concentrations to differentiate specific chromatin binding from nonspecific associations, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enables non-experts to generate quantitative binding data without specialized ChIP expertise, accelerating early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible elution profiles that serve as quantitative readouts for screening compound effects on chromatin landscape alterations.
- Operational Value: Uses standard western blot infrastructure and image analysis, facilitating assay standardization across laboratories and reducing technical variability.
- Operational Value: Requires only basic centrifugation and electrophoresis equipment, lowering barriers to adoption in screening cascades for epigenetic modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links alterations in chromatin environment (e.g., via HDAC inhibitors) to changes in protein binding, supporting biomarker-aligned mechanistic studies in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Evaluates binding shifts under genomic stress (e.g., doxorubicin-induced DNA damage), informing predictive models of target engagement under pathophysiological conditions.
- Operational Value: Complements cellular and biochemical assays by providing orthogonal validation of chromatin interaction continuity from discovery to preclinical stages.
Pipeline & Workflow Integration
SSE fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, offering a mechanistic bridge between biochemical binding assays and cellular phenotypic readouts in epigenetics programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how complex alterations affect chromatin binding, enabling pathway clarification and biological de-risking of epigenetic targets.
- Screening: Delivers salt-dependent elution profiles as quantitative outputs for comparing compound-induced chromatin state changes across screening campaigns.
- Analytics: Generates band intensity data plotted against salt concentration, providing calculable binding affinity shifts that inform structure-activity relationship discussions.
- Translational Research: Connects in vitro binding changes to cellular chromatin landscape modifications, supporting translational biomarker alignment when coupled with functional readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, low-cost capability applicable across multiple chromatin targets, promoting platform reuse in epigenetic drug discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by distinguishing direct chromatin binding from indirect cellular effects through controlled salt elution.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative binding profiles using widely available laboratory equipment, enhancing cross-team standardization.
- Strategic Value: Reduces reliance on low-throughput ChIP for initial binding assessments, improving capital efficiency in early epigenetics projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying complex targets based on quantitative binding resilience to environmental perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biochemistry and western blot quantification to ensure accurate elution profile interpretation.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, microcentrifuge tubes, and standard SDS-PAGE/western blot instrumentation.
- Necessitates standardized cell harvesting and lysis protocols to minimize variability between samples and ensure comparable salt extraction results.
- Involves optimization of incubation times for each target protein, as binding release kinetics vary across chromatin-modifying complexes.
- Limited to relative affinity comparisons; absolute binding constants require orthogonal biophysical methods for validation.
