Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

La microscopia ottica è uno degli strumenti più abilitanti nel campo della ricerca biomedica, se non il più abilitante. A seconda dell'applicazione, sono desiderabili diverse modalità di illuminazione per la visualizzazione dei campioni. Questo video mostrerà due modalità ottiche di illuminazione a luce trasmessa, contrasto di fase e microscopia DIC o contrasto di interferenza differenziale.

Ciao, sono Victoria San Frolic della struttura di imaging ottico presso l'Health Science Center dell'Università del Texas a San Antonio. Oggi vi mostrerò come visualizzare correttamente i campioni utilizzando la microscopia a contrasto di fase e la microscopia a contrasto di interferenza differenziale. Quindi iniziamo.

La microscopia standard in campo chiaro non è adeguata per la visualizzazione di campioni trasparenti e incolori. La microscopia a contrasto di fase viene spesso utilizzata per produrre contrasto per campioni biologici trasparenti che non assorbono la luce. La tecnica è stata scoperta da Zurich nel 1942, che ha ricevuto il premio Nobel per la sua realizzazione.

Il microscopio a contrasto di fase è un microscopio ottico a campo chiaro con l'aggiunta di speciali obiettivi a contrasto di fase, che contengono una piastra di fase o un anello, e un anello a condensatore invece di un diaframma. L'anello si trova solitamente nella torretta del condensatore e la dimensione dell'anello deve essere selezionata per obiettivi diversi. Dopo aver impostato l'illuminazione Kohler, scegliere l'obiettivo di fase corretto e quindi ruotare l'anello di fase appropriato in posizione nel condensatore.

Una volta che l'anello di fase dell'obiettivo e l'anello del condensatore sono stati correttamente allineati per essere concentrici e sovrapposti, possiamo visualizzare il campione e regolare correttamente la messa a fuoco. Dimostriamo quindi come appare il contrasto di fase attraverso il microscopio. Ecco uno sguardo a una fetta di fegato di ratto.

Sotto contrasto di fase. Questo metodo migliora l'aspetto del materiale biologico modificando il contrasto da diverse tonalità di grigio a sfumature dal nero al bianco. Noterete però che gli esemplari sono circondati da un alone, che oscura la struttura fine.

Questo alone è un artefatto dell'illuminazione da parte dell'anello di fase. Ora noterete che quando passiamo al campo chiaro, questo esemplare è molto difficile da visualizzare. Tornando al contrasto di fase, possiamo vedere chiaramente la struttura e la forma delle cellule nel tessuto del fegato di ratto Dalla sua introduzione alla fine degli anni '60.

La microscopia a contrasto interferenziale differenziale o DIC è stata popolare nella ricerca biomedica perché produce immagini ad alta risoluzione di strutture fini migliorando le interfacce contrastate, l'immagine prodotta è di una sezione ottica molto sottile. Infatti, la capacità del DIC di produrre sezioni ottiche lo ha reso una modalità utile di illuminazione a luce trasmessa per una microscopia confocale aziendale. Il microscopio DIC è un microscopio ottico a campo chiaro con l'aggiunta dei seguenti elementi, un polarizzatore tra la sorgente luminosa e il condensatore.

Un prisma di divisione del fascio DIC nella crostata del condensatore, un prisma di combinazione del fascio DIC proprio nella parte posteriore dell'obiettivo e un analizzatore nello spazio infinito prima delle due miscele. Per ottenere le migliori prestazioni dall'ottica DIC, è importante allineare prima il microscopio ottico per l'illuminazione Kohler e quindi posizionare gli elementi DIC nel percorso ottico. La luce proveniente dalla sorgente passa attraverso un polarizzatore e viene poi divisa dal primo prisma.

Questi raggi accoppiati viaggiano vicini l'uno all'altro. Se entrambi i due sono passati attraverso lo stesso materiale nel campione, allora quando vengono ricombinati dal secondo prisma, non interferiscono l'uno con l'altro e quindi appaiono grigi. Tuttavia, al bordo di una struttura, una trave della pera passa attraverso un materiale diverso dal suo partner e viene alterata.

Quando questi raggi vengono ricombinati dal secondo prisma, interferiscono producendo in modo costruttivo un punto luminoso o producendo in modo distruttivo un punto scuro. Ecco uno sguardo alle diatomee sotto contrasto DIC. Noterai che i dettagli fini della struttura delle diatomee sono facilmente visibili.

Tuttavia, se l'ottica DIC viene rimossa, questi dettagli scompaiono. Il contrasto tra l'esemplare è luminoso da un lato e più scuro dall'altro. Questo dà l'impressione di una topografia, ma in realtà si tratta di un'illusione.

La direzione dell'effetto di proiezione dell'ombra può essere invertita ruotando il polarizzatore attraverso un punto di incrocio sul contrasto opposto. Abbiamo appena esaminato le modalità ottiche del contrasto di fase e DIC. Giusto per ricordare, l'eliminazione del contrasto di fase migliora i campioni contrastati dai neri ai bianchi ed è utile per visualizzare campioni sia incolori che trasparenti.

La DIC genera anche contrasto nel campione. Lo fa creando un'immagine ad alta risoluzione di una sottile sezione ottica. Quindi questo è tutto.

Grazie per l'attenzione e buona fortuna con la tua microscopia.