代謝ラベリングを使用して、生化学的変換とセルに発生する変更をプローブします。自然の生体分子の構造を模倣する化学類縁体を使用して、これは。セルは、類縁体の内因性の生化学的プロセスは、ラベル付けされている化合物を生産を利用します。ラベル検出および親和性の札は、SDS-PAGE や NMR などの他の生化学的分析手法を用いた代謝経路を解明するために使用することができることができます。
このビデオは、代謝ラベリングとショー 2 つの一般的な手順の概念を紹介します。 最初は、同位体標識を使用して蛋白質のリン酸化の特徴します。2 番目のカバー代謝ラベリングのも 3 つのアプリケーション内でのタンパク質間相互作用を特徴付けるための光反応性ラベリング表示されます: 植物素材をラベル付け、分類の速度を測定するための RNA および初期胚の糖鎖をラベリングします。
代謝ラベリングを使用して、セルの機械を調査します。これは生化学的変換と発生する変更をプローブする化学類縁体を使って実現されます。このビデオは、同位体およびプロシージャ、およびいくつかのアプリケーションをラベリング光反応性代謝ラベリング、一般的な原則が表示されます。
代謝ラベリングは、さまざまな方法を使用して実施できます。ここで同位体、光反応性、およびバイオ直交のラベル付けについて説明します。
自然相手のこと化学的に同一構造の類似を使用して実行は同位体標識しますですが、珍しい同位体組み込まれている構造。この L-リジン アナログ炭素・窒素原子、炭素 13、窒素 15 に置き換えられます。同位体の類縁体の存在下で培養した細胞は、その生化学的構造にそれらを組み込む予定します。代謝産物は細胞から収集および分析のための精製します。安定同位体のサンプルを分析するには、質量分析法や核磁気共鳴分光法などの技術を使用しています。放射性ラベルとサンプル同位体ラベリング プロトコルで示される液体のシンチレーション カウントと x 線フィルムを用いています。
光反応性ラベルは、紫外線にさらされるまで安定なタンパク質に組み込む機能グループです。機能グループは、最も近い蛋白質に結合する反応性官能基を形成します。一般的な例では、L-写真-ロイシン, 光反応性架橋剤の光反応基ジアジリン リングが含まれています。同位体ラベリングと対照をなして光反応性化学類縁体と自然相手のいくつかの化学類似があります。細胞は優先的に類縁体の天然化合物を組み込むことができます。したがって、模倣されている化合物の中で光反応性ラベリングを行うことが重要です。紫外線にさらされ、一度分類された蛋白質の光反応性グループ不安定になり、反応性の高いタンパク質の複雑な作成の原因に相互作用の蛋白質と相互リンク。架橋複合体は、SDS-PAGE と質量分析法を使用して、分析することができますスナップショットとして機能します。これはどんな反応が反応種を識別することによって代謝経路で発生しているし、の結合部位を決定することでやり取りする方法に洞察力を提供します。
Bioorthogonal ラベリング戦略は、自然な生体分子がほとんどない反応性を持つ小型の官能基を持つ類縁体を利用します。たとえば、アザイドと言われてその反応の生化学的反応に直交する、小規模の機能グループです。シュタウディンガー結紮のホスフィン グループのアジドフェニル グループを攻撃します。これは近くのエステル、アミン結合リガンドの結果と分子反応遷移状態を得られます。Bioorthogonal 機能グループ分子に組み込まれては蛍光官能など検出タグで結紮することができ、親和性抗原などタグします。
いくつかの概念および新陳代謝の戦略が議論されている今、研究室では、プロセスを見てみましょう。
代謝標識実験の最初のステップは興味の蛋白質を集めることです。これを行うには、セル、プレート、育つ、表現方法は目的タンパク質の合成を促進するために使用されます。この例では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼまたはニラで表現されます。リン酸、放射性リン-32 を含む、アナログとして使用されます。電離放射線に対する保護するために適切な対策が必要です。これには、作業領域の設定、適切な保護具を身に着けている、放射能汚染のチェックが含まれます。安全対策が実行されると、同位体の類縁化合物を含む培地が用意しています。文化からメディアを削除、1 つを含む同位体化学類縁体に置き換えされ、培養します。次の培養細胞が分離します。ライセートの収集し、精製します。
浄化後、蛋白質は SDS ページを使用し、PVDF 膜に転送が解決されます。オートラジオグラフィーは、フィルムを x 線に膜を公開することによってされるので、蛍光イメージャを使用して測定します。西部にしみが付くこと、PVDF 膜のタンパク質の相対レベルを測定するために使用されます。この例ではロイシン豊富なリン酸化レベルは、キナーゼは、293 t 細胞を測定した合成を繰り返します。どのくらいリン ゲノムスキャニング ショーは、蛋白質に組み込まれました。ニラの蛋白質のレベルを解明西部にしみが付くこと。画像解析ソフトを使用して、蛋白質のリン酸化レベルの定量的なデータを取得します。
この次の手順では、光反応性のラベルに示します。最初に、セルを準備して培養します。光反応性アナログ中間ログ段階でセルに追加し、培養します。この手順では、p benzoylphenylalanine が使用されます。サンプル間隔で収集、氷の上に置きます。サンプルは、時間の経過とともに生化学プロセスのスナップショットを取得する公開されます。興味の蛋白質は、精製し、SDS-PAGE を使用して解決します。
光反応性ラベリング戦略は興味の蛋白質と相互作用する化合物を識別するために使用されました。ウエスタンブロット高分子量蛋白質を示すショー タンパク質バンドとバイオアセッテイ照射試料に存在しています。これら紫外線照射時に発生する蛋白質蛋白質の相互作用により架橋からです。
代謝ラベリング手順を確認しましたところ、今、いくつかのプロセスを使用する方法を見てみましょう。
代謝ラベリングの概念は、多細胞生物に拡張できます。植物は作り出されたラベルの付いた植物材料に安定同位体の豊富な密封された環境で育ちます。炭素 13 を含んでいる炭酸ガスは、窒素 15 の豊富な肥料を使用しながら、筐体に追加されます。結果収穫された植物材料は炭素・窒素循環の生態系からの質問に答えることができます。
ラベルは、古い RNA から新たに合成された RNA を分離をできます。アナログの初期濃度を変更すると、新しい RNA 合成の速度を決定できます。結果は、4 thiouridine の濃度がどのくらい新しい RNA の転写に影響を示します。さらに、分光光度計で直接 RNA にラベルの混入率を定量化することができます。
双直交クリックケミストリーを用いたゼブラフィッシュ胚の糖鎖がラベル付けできます。卵は、糖のアルキン ラベルでラベリング化合物が注入されます。幼虫の糖鎖が次に縛られる色素化合物に必要な開発段階で。胚の糖鎖はイメージします。異なる時点で生成される糖鎖は、胚の開発のさまざまな段階でさまざまな色を使用したラベリングによって識別できます。
代謝ラベリング ゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ代謝ラベリングの概念と戦略を説明、2 つの一般的な手順を行って、技術の用途のいくつかをカバーします。
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代謝標識は、細胞の機構を調査するために使用されます。これは、化学類似体を使用して、発生する生化学的変換と修飾を調査して達成されます。このビデオでは、代謝標識の原理、典型的な同位体および光反応性標識手順、およびいくつかのアプリケーションを紹介します。
代謝標識は、いくつかの戦略を使用して実施できます。ここでは、同位体標識、光反応性標識、および生体直交標識について説明します。
同位体標識は、天然の同位体と化学的に同一であるが、その構造に一般的でない同位体が組み込まれている構造類似体を使用して行われます。このL-リジン類似体では、炭素原子と窒素原子は炭素13と窒素15に置き換えられています。同位体類似体の存在下で培養された細胞は、それらを生化学的構造に取り込む。代謝物は細胞から収集され、分析のために精製されます。安定同位体を含むサンプルは、質量分析やNMR分光法などの手法を使用して分析されます。放射性標識のあるサンプルは、液体シンチレーション計数とX線フィルムを使用して分析され、同位体標識プロトコルで実証されます。
光反応性標識は、タンパク質に組み込まれた官能基であり、紫外線にさらされるまで安定です。官能基は反応性ラジカルを形成し、これは最も近いタンパク質に結合します。一般的な例であるL-フォトロイシンには、光反応性架橋剤であるジアジリン環が含まれています。同位体標識とは対照的に、光反応性化学類似体とそれらの天然の対応物との間には化学的に相違点があります。細胞は、類似体よりも天然化合物を優先的に取り込むことができます。したがって、模倣される化合物を含まない媒体で光反応性標識を行うことが重要です。紫外線にさらされると、標識タンパク質の光反応性基は不安定で反応性が高くなり、相互作用するタンパク質と架橋してタンパク質複合体を形成します。架橋錯体はスナップショットとして機能し、SDS-PAGEおよび質量分析法を使用して分析できます。これにより、反応種を特定することで代謝経路でどのような反応が起こっているのか、また、結合部位を決定することでそれらがどのように相互作用するかについての洞察が得られます。
生体直交標識戦略は、天然の生体分子との反応性がほとんどまたはまったくない小さな官能基を持つ類似体を利用します。例えば、アジドは小さな官能基であり、その反応性は生化学反応と直交すると言われています。シュタウディンガーライゲーションでは、ホスフィン基がアジド基を攻撃します。これにより、分子内で近くのエステルと反応する遷移状態が得られ、アミン結合配位子が得られます。生体分子に取り込まれた生体直交性官能基は、蛍光官能基などの検出タグや抗原などのアフィニティータグでライゲーションすることができます。
代謝標識の概念と戦略についていくつか説明したところで、研究室でのプロセスを見てみましょう。
代謝標識実験の最初のステップは、目的のタンパク質を収集することです。これを行うには、細胞をプレート上で増殖させ、発現方法を使用して目的のタンパク質の合成を促進します。この例では、ロイシンリッチリピートキナーゼ(LRRK)が発現しています。放射性リン-32を含むリン酸二ナトリウムが類似体として使用されます。電離放射線から保護するために、適切な対策を講じる必要があります。これには、作業エリアの設置、適切な保護具の着用、放射能汚染のチェックが含まれます。安全対策が講じられたら、同位体類似体を含む培地を調製します。培養物から培地を取り出し、同位体化学類似体を含む培地と交換し、インキュベートします。インキュベーション後、細胞を溶解します。ライセートを回収し、精製します。
精製後、タンパク質はSDS-PAGEを使用して分離され、PVDFメンブレンに転写されます。オートラジオグラフィーは、メンブレンをX線フィルムにさらし、蛍光体イメージャーを使用して測定することによって実行されます。ウェスタンブロッティングは、PVDFメンブレン内の相対的なタンパク質レベルを測定するために使用されます。この例では、293T細胞で合成されたロイシンリッチリピートキナーゼのリン酸化レベルを測定しました。オートラジオグラムは、タンパク質にどれだけのリンが取り込まれたかを示しています。ウェスタンブロッティングは、LRRKタンパク質のレベルを解明します。画像解析ソフトウェアを使用して、タンパク質のリン酸化レベルの定量データを取得します。
この手順では、光反応性標識について説明します。まず、細胞を調製し、培養します。光反応性アナログは、中対数期で細胞に添加され、インキュベートされます。この手順では、p-ベンゾイルフェニルアラニンが使用されます。サンプルは間隔を空けて収集され、氷の上に置かれます。次に、サンプルを曝露して、経時的な生化学的経路のスナップショットを取得します。次に、目的のタンパク質を精製し、SDS-PAGEを使用して分離します。
光反応性標識戦略を使用して、目的のタンパク質と相互作用する化合物を同定しました。ウェスタンブロッティングによる免疫検出では、照射されたサンプル中に高分子量のタンパク質が存在することを示すタンパク質バンドが示されました。これらは、UV照射中に発生するタンパク質間相互作用による架橋によるものです。
メタボリックラベリングの手順を確認したので、このプロセスの使用方法をいくつか見てみましょう。
代謝標識の概念は、多細胞生物に拡張できます。植物は密閉された環境で栽培され、安定した同位体が豊富で、生産された標識植物材料に富んでいます。炭素13を含む二酸化炭素がエンクロージャーに追加され、窒素15が豊富な肥料が使用されます。収穫された植物材料は、生態系からの炭素と窒素の循環に関する質問に答えるのに役立ちます。
標識により、新しく合成されたRNAを古いRNAから分離することができます。アナログの初期濃度を変えることで、新規RNA合成の動態を決定することができます。その結果、4-チオウリジンの濃度が新しいRNAの転写量に影響を与えることが示されています。さらに、標識のRNAへの取り込み速度は、分光光度計で直接定量化できます。
バイコンソネゴンクリックケミストリーを使用して、ゼブラフィッシュの胚の糖鎖を標識できます。卵には標識化合物が注入され、その結果、糖鎖にアルキン標識がもたらされます。その後、幼虫の糖鎖は、目的の発育段階で色素化合物にライゲーションされます。次に、胚の糖鎖を画像化します。異なる時点で産生された糖鎖は、胚発生の異なる段階で異なる色を使用して標識することにより同定できます。
JoVEの代謝ラベリングに関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、メタボリックラベリングの背後にある概念とその戦略を説明し、2つの一般的な手順について説明し、技術の使用の一部について説明しました。
ご覧いただきありがとうございます!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:31
Principles of Metabolic Labeling
3:39
Isotopic Labeling Procedure
5:30
Photoreactive Labeling Procedure
6:31
Applications
8:06
Summary
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