ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

このビデオは、ジョージア大学ワーネル森林天然資源学部の研究者によって作成されました。このトレーニングビデオの目的は、ハイブリダイゼーションの前後にアレイの洗浄と取り扱いに特に注意を払いながら、LOBロリーパインpt、第2世代CDNA、マイクロアレイの処理方法を詳しく説明することです。一般的に、当社のプロトコルは、Institute for Genomic Research TigerおよびVanderbilt Microarray Shared Resource Facility(VMSR)で開発されたプロトコルに従っており、そこでアレイが印刷されています。

PT Gen 2のより厳密な処理は、信号品質の均一性と低いバックグラウンドに関して最大限の一貫性を提供する必要があることがわかりました。最初のステップはプレウォッシュです。これは、スポッティングバッファーの塩分が非常に多く含まれており、その塩分を除去するためにこの予備洗浄が必要であるためです。

スライドを顕微鏡スライドキャリアに入れ、43°Cに予熱した0.2%SDS溶液に15〜20回激しく突入します。スライドをSDS溶液で洗浄した後、プレハイブリダイゼーションバッファーを含むコープランドジャーに鉗子で慎重に除去します。このバッファーには、5つのXSSC 0.1%SDSと1%BSAが含まれており、43°Cで加熱されます。

コープランドの瓶を香水で覆い、43度のインキュベーターに1時間入れます。プレハイブリダイゼーションに続いて、スライドを顕微鏡スライドキャリアに移し、脱イオン水を5回交換して15〜20回交換することで連続的に処理します。最後に、スライドをイソプロパノールに入れ、5〜6回浸してから、チップMメイト遠心分離機で遠心分離して乾燥させます。

遠心分離後、0.2ミクロンのフィルターを通過した圧縮空気でスライドを吹き込みます。その後、スライドにリフタースリップを重ね、これも圧縮空気で洗浄し、小さなピペットチップを使用してリフタースリップを正しい位置に調整します。スライド上。

リフタースリップが配置された後、ハイブリダイゼーションバッファーが追加される前に、チャンバーの端にある湿度ウェルに20マイクロリットルの100ミリモルディヒ、3アトールを追加します。これで、ハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁されたターゲットCDNAを追加する準備が整いました。ピペットチップをリフタースリップの端に置き、スライドと溶液をゆっくりとピペットで挟みます。

その結果、キャピラリー効果を利用してアレイをロードすると、一貫性が最も高まり、不要な気泡の取り込みが大幅に減少することがわかりました。ターゲット材料をアレイに追加した後、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立て、アルミホイルで覆います。次いで、ハイブリダイゼーションチャンバーを振盪水浴に入れ、一晩、通常は14〜16時間インキュベーションする。

ウォーターバスは48度、シェーカーは50rpmに設定されています。ハイブリダイゼーション溶液を添加する時点から、すべてのハイブリダイゼーション後の洗浄を通じて、光の酸化を防ぐために、手順は暗い場所で行われることにも注意することが重要です。翌日、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、53度に予熱した1番の洗浄液が入ったコープランドジャーに入れます。

スライドは、リフターのスリップが落ちるまで約1分間コープランドジャーに留まることが許され、その時点でスライドは鉗子で穏やかに除去され、洗浄を進めるために顕微鏡スライドキャリアに置かれます。次に、スライドを2番目の容器に約15〜20回激しく沈め、これも53度の1番の洗浄液を含んでいます。次に、容器を香水で覆い、53度と100rpmに設定されたインキュベーターエアシェーカーに入れます。

10分間のインキュベーションと洗浄液(1番)の後、スライドを15〜20回激しく15〜20回、洗浄液2番の容器(室温)に入れます。これをパラフィルムで覆い、室温で再びシェーカーに置き、10分間インキュベーションします。最後に、スライドを洗浄液2番から取り出し、洗浄液3番の入った容器に15〜20回激しく浸します。

次に、スライドをパーフィルで覆った洗浄液番号3の2番目の容器に移し、再びシェーカーに10分間置きます。最終洗浄後、スライドを遠心分離して完全に乾燥させます。これを行うには、15ミルのファルコンキャップを50ミルのコニカルチューブに入れ、アレイのバーコード面を下にしてコニカルチューブに配置します。

その後、チューブはスイングバケットヘッドで室温で1500RPMで回転します。遠心分離後、スライドはアルミホイルで覆われた50ミルの円錐管の2番目のセットに移されます。その後、チューブは窒素ガスでパージされ、0.22ミクロンのフィルターとキャップでろ過され、輸送またはスキャンまでの保管が行われます。

PerkinElmer スキャンアレイ 5 、 000 でスキャンデータを収集します。アレイ画像はグリッド化され、生のスキャンデータが処理され、バイオディスカバリーのイメージングソフトウェアスイートで初期データ解析が行われます。次に、米国国立がん研究所からダウンロードできる堅牢で自由に利用可能なマイクロアレイ統計パッケージであるBRBアレイツールを使用して統計解析を行い、スポットシグナル強度データを正規化します。

その他の統計解析および遺伝子発現パターン検索は、遺伝子発現パターンおよび解析スイートのJeep PPAを使用して実行されます。これも無料で入手できるWebベースの分析パッケージです。ロブロリーパインPT Gen twoマイクロアレイの処理方法に関するビデオをご覧いただきありがとうございます。

このトレーニングビデオの内容と制作を担当したのは、以下の方々です。