Name: 蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ 蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシングを用いた植物オルガネラの形態・機能的整合性に関与する遺伝子の同定法。この手法は細胞生物学研究に有用です。

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我々は化学科学、地球科学とバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学、科学局、米国エネルギー省（受賞番号DE-FG02-91ER20021）と国立科学財団（MCB 0948584）（FB）の事務局のサポートを認める。私たちは、原稿を編集するためのMSカレン鳥に感謝しています。

1。 EMSトリートメント シロイヌナズナの種子は、T /変異が5月7日にC / Gの結果ゲノムのC-to-T変化に誘導される変異剤エチルメタンスルホン酸（EMS）3,4、として使用して変異しています。 <ol><li>細胞小器官蛍光マーカー（具体的には、本研究ではssGFPHDEL（シグナル配列-GFP-HDELテトラペプチド）は、ERのマーカーとして使用されている）を運ぶ0.8グラムシロイヌナズナ種子（〜40,000シーズ）を量る。 </li><li> 50 mlのファルコンチューブに種子を譲渡し、25ミリリットルの蒸留水を追加します。 </li><li> 0.2％（v / v）のエチルメタンスルホン酸塩を追加します。 </li><li>低速でミキサーをnutatingで16時間インキュベートします。 </li><li>液体を吸引除去し、EMSを不活性化するために1.0 M NaOHを含むフラスコにそれを破棄します。 </li><li>近くに、種子を含むファルコンチューブに25mlの水を追加し、5回反転の種子を洗浄するために、すべての種子が定着するまで待機し、その後1.0 Mナトリウムに水を吸引して捨てる<html>フラスコOH。 </li><li>最大10回まで洗浄工程を繰り返します。 </li><li>最後の洗浄後、水の最小量の種子を再懸濁する。 </li><li> 10％の漂白剤の25 mLを加え、シード滅菌に進み、30秒間激しく振る。種子が底に沈殿させ、その後、漂白剤を捨て、滅菌水25 mLで洗浄してください。滅菌水を捨て、25mlの70％エタノールを追加します。 30秒間チューブを振る。種子が底に沈殿しましょう​​。エタノールを捨て、滅菌水25 mLで洗浄してください。滅菌水で2回洗浄を繰り返し、その後3 MMろ紙を含むプラスチック製のペトリ皿に種を注ぎ、ボンネットの下に乾燥させます。 2日間4℃で保管してください。 </li><li> ½MS phytagel（MurashigeおよびSkoog培地の半分の濃度）、150 mmのペトリ皿（プレート〜250から300種）のプレートの種子を。 </li><li>土壌に移植し、2週間プレート上にM1の種子を栽培しています。 </li><li> M2線（1000独立した行）を生成するために、個々のM1植物からM2の種子を収集します。 </li></ol>M2とM3の個体群のove_title &quot;&gt; 2。焦点スクリーニングこのセクションでは、以前の8の説明に従って、共焦点または蛍光顕微鏡で苗の観察を説明します。 <ol><li>各M2ラインから起算して六十種は、プラスチック製のペトリ皿に7〜10日間栽培されている½MS phytagel、同じプレートでも（コントロール）EMS-未処理の5本の苗木を栽培されています。 </li><li> 5〜10子葉は、顕微鏡スライド上にレンズ（40X）に向かって背軸側でマウントし、カバーガラスで囲まれています。 </li><li>それぞれの子葉は、オルガネラのマーカーのいずれかに変更された細胞内分布の蛍光の下で、皮質から内側領域に観察される。 </li><li>陽性植物は、土壌に移植され、その種子はM3世代における変異体の表現型を確認するために再度収集し、スクリーニングされる。 </li><li>野生型ゲノムに少なくとも3回は、おそらく共同戻し交配を通して汚染のバックグラウンドの変異を削除します。希望するオルガネラの蛍光マーカーをntaining。 <ol><li>母植物から、細かいハサミや鉗子を使用すると、成熟したsiliquesを削除して、開いた花。 </li><li>分裂組織から小さすぎるつぼみを削除します。 </li><li> 1花芽を開き、すべての葯を削除するには、花弁とがく片の間に鉗子の一組の先端を挿入します。 </li><li>鉗子のいずれかのペアを使用すると、父親の工場から開いている成熟した花を取ると去勢植物の柱頭に葯をこする。 </li></ol></li></ol> 3。マッピングこのセクションでは、伝統的なマッピング方法10,11と比較する場合に高速ですBorevitz 9時から変更されたプロトコルを使用して、劣性突然変異をマッピングする方法を本質的に説明しています。このアプローチは、単一のアッセイ12に多数の単一の機能多型（SFPを）検出する能力と高密度のオリゴヌクレオチド配列を使用します。アフィメトリクスシロイヌナズナATH1のGeneChipのアレイを使用することも可能です約24,000の遺伝子を分析します。変異を示すF 2個体のプールは、同じ分離集団内で収集された野生型のF 2植物のプールと比較されます。その後、変異は変異体プールが変異遺伝子の対立遺伝子が濃縮されている領域にマッピングされ、その結果、同じ地域に野生型プールは、野生型の親の対立遺伝子13の豊かなことになります。 <ol><li>ゲノムDNA（3μg）をQiagen社DNeasy植物ミニキットを使用して、ホモ接合変異体コロンビア（M3）から抽出され、イルミナGenome AnalyzerのII（GA II）14シークエンシングのために提出されています。 </li><li>ホモ接合変異体コロンビア（M3）は、マッピング集団を生成するためランツベルクエレクタと交配されています。 </li><li>マッピングは、異常な表現型と野生型の表現型とF2植物の同じ数を示す70、最大100 F2個体で実行されます。 </li><li>各工場から穴パンチを使用してリーフディスク（0.60 mm）を収集します。ザリーフディスクは、DNAの類似した量を持っていることを確認するため、同じ年齢の葉から収集する必要があります。サンプルは、個別に、またはグループ内のゲノム抽出のために処理することができます。この場合、それは最終的にはゲノムDNAを抽出する必要があり、そこからより少ないエッペンドルフチュー​​ブを持つようにそれぞれのエッペンドルフチュー​​ブに5〜10サンプルを収集することが可能です。 </li><li> MasterPure植物の葉のDNA精製キット（EPICENTRE）は、ゲノムDNAを抽出するために使用されています。各試料から得られたゲノムDNAは、光度計で定量されています。 </li><li>各サンプルからのゲノムDNAの同量は、植物のDNAを300 ngの（〜30μL）の合計に一緒に入れて、60μL2.5Xランダムプライマー溶液を加え、[125 mMのトリス-HCl（pH6.8）を、12.5mMののMgCl 2、25mMの2 - メルカプトエタノール、750μg/ mlのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ランダム八量体）]（Bioprimeキット）と42μLの水（最終容量132μL）。 </li><li> 5から10分&gt; 95°Cで変性はDNAが。 </li><li>氷の上で涼しい。 </li><li>各denatuへ赤のDNAは、[1 mMのビオチン-14-dCTPを、1mMのdCTPを、2mMのdATPを、2mMのdGTPを、10mMトリス-HCl（pH7.5）で2 mMのdTTPを、1mMのNa2EDTA]ビオチンdCTPで15μL10XのdNTPミックスを追加する（Bioprimeキット）、3μLクレノウポリメラーゼ（Bioprimeキット）で完了します。 </li><li> 25℃で一晩インキュベートする</li><li>ミックス、次の日に、15μlの3 M NaOAc、400μL冷100％エタノールを追加します。 </li><li> 1時間-80℃でインキュベートし、その後15分間20500×gで回転、上清を除去し、500μLの冷75％EtOHで洗浄する。 </li><li> 10分間、20500×gで遠心する。 </li><li> 100μLの水で10分間再懸濁し、37℃で乾燥したDNAペレット。 </li><li>ゲル（ 図2）収量と品質を確認するために5μLを使用しています。 </li><li>のために、野生型と変異型のGeneChip ATH1シロイヌナズナゲノムアレイハイブリダイゼーション反応をラベリングの95μLを送信します。 </li><li> Rソフトウェア（使用してアレイがスキャンされ、得られた。CELファイルが解析され<a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.oを</a>RG /）。 </li><li> Rのソフトウェアをインストールし、プログラムを開き、次の文字列を貼り付けます。 ソース（ &quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;） biocLite（） その後、リターンキーを押して、これは標準BioConductorのパッケージ（インストールされます<a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ）。 </li><li>デスクトップ上の新しいフォルダには、次のWebサイト（からダウンロード<a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ）ファイル： readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip ファイルColLerCEL.zipが解凍され、結果のファイルは新しいフォルダに貼り付ける必要があります。 </li><li> wildtype.CELとmutant.CELにあなたのGeneChipの実験から得られたデータの名前を変更します。 </li><li>あなたのGeneChipのデータ（wildtype.CELは 、今コピーします。あなたのフォルダにmutant.CEL）。 </li><li>クリックして &quot;その他&quot;とクリックします。オープンR、Mac用） &quot;作業ディレクトリを変更します。&quot;クリックして &quot;ファイル&quot;から &quot;チェンジディレクトリ&quot;：B）PC用</li><li> Macの場合）：ファイルを含むフォルダを選択します。 &quot;ワークスペース&quot;、 &quot;ロード·ワークスペース·ファイルをクリックします。、ファイルを&quot; PC用を選択しath1V5.RData、b）に上記のファイルを含むフォルダを選択し、クリックして&quot;&quot;それから&quot;ロードワーク&quot;とath1V5.RDataを選択します 。 </li><li>メモ帳を使用してreadCEL.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする</li><li>メモ帳を使用してSFP.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする</li><li>メモ帳を使用してMap.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする</li><li>コンソールウィンドウに次のメッセージが表示されます。 X染色体は、MB YZを制限する このリンクを貼り付けTAIRで検索遺伝子 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>＆最後= Z </li><li>インターネットブラウザにリンクをコピーして貼り付けます。ウィンドウが表示され、ファイルを開くか保存するかを尋ねてきます。あなたは、保存を選択する必要があります。ファイル名を選択し、[保存]をクリックし、 &quot;。XLS&quot;拡張子を添付してください。 </li><li>ファイルを開き、あなたの変異体の座標を（結果はグラフィカルに、図3に表される）を見つけることができます。 &quot;XLS&quot;。 </li><li>組み立てイルミナにマップされた領域内の単一塩基多型のうち、特定のEMSの遷移4を識別する変異体ゲノムの読み取り。標準的な手順15を使用して、野生型遺伝子（s）で形質転換して変異体の表現型を補完します。 </li></ol> 4。代表的な結果 図1は、共焦点顕微鏡のスクリーニングを使用して、分泌経路の変異体の同定に使用されるアプローチを示しています。 図2は、アレイハイブリダイゼーションのために標識されたゲノムDNAの典型的な準備を示しています。。 図3に、GeneChipのシロイヌナズナATH1ゲノム配列から得られたデータを分析した後、予想される典型的な結果が提示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> 図1。ssGFPHDEL（ERマーカー）（1）を発現するシロイヌナズナ形質転換植物は、EMS処理（2）のための十分な種子を生産するために培養した。 EMSで処理した種子は、その後M1植物（3）を生成するために播種した。各M1プラントは別の行を表しており、種子は、それらの各々から別々に収集した。 M2種子は½MS基板（4）上に播種し、共焦点顕微鏡（5）でER形態の欠陥についてスクリーニングした。スクリーニング時に我々は、野生型ERの形態（6）不良ER表現型（7）を示す植物を保存すること植物を発見した。これらの植物は、M3世代を取得し、表現型（8）を確認するために、成長させた。 M3の植物からのゲノムDNAは、Solexaイルミナシーケンス（）を使用した。同じ植物また、F2マッピング集団（b）を得るためにLER-WTとの交雑のために使用されていました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> 図2。Bioprimeランダムラベリング反応（100μL、5μL）をアガロースゲル1％ロードされていました。レーンは、野生型F2植物のプールからのものであり、レーンBは変異体F2植物のプールからのものです。 （マーカーはNEBから、1 kbのDNAラダー-N3232）です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> 図3図は、GeneChipのシロイヌナズナATH1ゲノムアレイハイブリダイゼーションを使用して、COL-0突然変異のマッピングの例を表しています。この例では変異は染色体1、縦棒で区切られて位置しています。横棒は、検出のしきい値を表しています。

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは、内膜変異体の同定のための共焦点顕微鏡ベースのスクリーニングを説明しました。このアプローチは、簡単に特定の蛍光タンパク質マーカーが用意されているセルの他の器官に拡張することができます。画面は、ターゲット細胞小器官で、またはマーカーを含むことが想定されていない細胞小器官のいずれかに蛍光マーカーの異常分布を示す変異体の同定に基づいています。それぞれ、これらの変異体は正常細胞小器官の間でマーカーを転位することができませんマーカーをsubcompartimentalizeする細胞小器官の機能のいずれかが侵害されている集団や突然変異体を表しています。しかし、その他は開発の後期段階での表現型を示した。スクリーニングの間に我々はいくつかの変異体は発芽7日後には早くも開発の初期段階で表現型を示したことに気づいた。これは、変異の開発に依存した表現を含むいくつかの理由、にリンクされているかもしれませんが対立遺伝子（s）は、これは植物が潜在的に興味深い突然変異体が破棄されていないことを保証するために（少なくとも7〜14日）は、異なる成長段階で検討すべきであることを示唆している。 このプロトコルで...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>エチルメタンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> JTベーカー</td><td> 3722から05 </td></tr><tr><td>ムラシゲスクーグ培地ワットgamborgビタミン</td><td>フィトtechnolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td>シグマ</td><td> P8169-1キロ</td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td>マスター純粋な植物の葉のDNA精製キット</td><td> EPICENTRE </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime DNAラベリングシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td>アルコール200プルーフ</td><td>デカンラボラトリーズ。 </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JTベーカー</td><td></td></tr><tr><td>遺伝子チップシロイヌナズナATH1ゲノム配列</td><td>アフィメトリクス</td><td> 900385 </td></tr><tr><td>ファルコンチューブ50 mLの</td><td>コー​​ニング</td><td> 430290 </td></tr><tr><td>エッペンドルフチュー​​ブを1.5 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 90ミリメートルろ紙</td><td>ワットマン</td><td> 1001090 </td></tr><tr><td>化学てんびん</td><td>メトラー·トレドAB54-S </td><td> NA </td></tr><tr><td> Nutating（波）シェーカー</td><td> Heidolph PolyMAXの1040 </td><td> NA </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ5417-R </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

このプロトコルは、 シロイヌナズナ実生の蛍光顕微鏡ベースのスクリーニングを説明し、分泌経路内の特定のタグ付き蛍光マーカーの細胞内分布を変化させる劣性変異をマッピングする方法について説明します。 シロイヌナズナたため、そのゲノムサイズの遺伝学的研究のための強力な生物学的なモデルであり、世代時間、王国間の分子機構の保全。分子マーカーに基づいて、従来の方法に代わるもので突然変異をマッピングするためのアプローチとして、ジェノタイピングアレイは、比較的高速であるため有利であると本当に短い時間枠のいくつかの変異体のマッピングを可能にすることができる。この方法は、植物のどのオルガネラの整合性に影響を与えることができるタンパク質の同定を可能にします。ここでは、一例として、我々は小胞体（ER）の整合性のための重要なマップの遺伝子に画面を提案する。我々のアプローチは、しかし、簡単に他の植物の細胞小器官に拡張することができます（例えば、1,2を参照）ため、他の細胞内構造を支配する分子基盤を理解する重要な一歩を表しています。

細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。

本プロトコールでは、シロイヌナズナの幼苗を用いた蛍光顕微鏡ベースのスクリーニングについて述べ、...を変化させる劣性変異をマッピングする方法について説明します。

この実験の目的は、植物オルガネラの形態的および機能的な完全性を担う遺伝子を特定することです。まず、オルガネラ蛍光マーカーを保持するシロイヌナズナの種子に化学変異剤としてエチルメタンスルホナートを添加します。次に、第一世代の変異株（M1）の個別の植物から種子を回収し、次世代の変異株（M2）のラインを育成します。次に、変異誘発したElianaの種子を共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察し、器官の異常表現型を特定します。最終ステップとして、第3世代の変異体を作成し、変異表現型の存在を確認します。最終的に、次世代シーケンシングツールを用いて、劣性変異のマッピングを行うことができます。変異遺伝子の位置が特定された後、野生型遺伝子による形質転換を行うことで、異常なオルガネラの表現型を回復させることができます。この手法は、植物オルガネラの形態的および機能的な完全性の維持に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。Atil methanesおよびスルホン酸処理をatop sta種子に施すと、ゲノム内でシトシンのタイミング変化が誘導され、結果としてシトシンgwanからtimingへの変化が生じます。変異の導入。本プロトコルにおいて、M2個体内で最適な変異率を確保するために、EMS処理は重要なステップとなります。まず、適切なオルガネラ蛍光マーカーを導入済みの野生型Columbia ecotypeのArabidopsis種子を用意します。0.8 g（約40,000粒）の種子を50 mLファルコンチューブに移します。次に、25 mLの蒸留水と0.2%エチルメタンスルホン酸を添加します。この混合物を変異誘発用ミキサーを用いて低速で16時間インキュベートします。インキュベーション後、液体を吸引し、1 M水酸化ナトリウムを含むフラスコに廃棄します。EMSを不活化させるため、種子が入ったFalconチューブに25 millilitersの水を加えます。チューブを閉め、5回反転させて種子を洗浄します。すべての種子が沈殿した後、水を吸引し、1 molar水酸化ナトリウムフラスコに廃棄してください。この洗浄工程を最大10回繰り返した後、最終洗浄で種子を少量の水に浸します。次に、10% bleachを25 milliliters加え、30秒間激しく振って種子の滅菌を行います。種子が底に沈殿したら、bleachを捨て、25 millilitersの滅菌水で洗浄します。滅菌水を除去した後、70%エタノールを25 milliliters加えます。チューブを30秒間振盪し、種子が底に沈降するまで待ちます。エタノールを捨て、25 millilitersの滅菌水で洗浄します。滅菌水での洗浄を2回繰り返します。次に、3 mmのフィルターペーパーを入れたプラスチック製ペトリ皿に種子を注ぎます。種子を4 °Cで2日間インキュベートした後、フード内で乾燥させます。種子を、ゲル剤としてフィターゲルを含む1/2 MS培地（Magi and scoog medium）が入った150 mmのペトリ皿に、1枚あたり約250〜300粒の割合で播種します。M1世代の種子をプレート上で2週間育成します。その後、苗を土壌に移植し、引き続き生育させます。30日から45日後、植物は成熟期に達し、リーク（漏出）が明確に確認できるようになります。この時点で、個々のM1植物からM2種子を回収し、1000系統の独立したM2ラインを作製します。共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で苗を観察するため、各M2ラインから60粒の種子を、半分の培地を入れたプラスチック製ペトリ皿で7日から10日間育成します。Phytagelを含むMoreishおよびscoog培地を用いて、同一プレート上にEMS未処理の対照群として5つの苗を育成します。苗が成長したら、5〜10本のcotyledon（子葉）を、ABACシール側を顕微鏡の40倍対物レンズに向けてスライドガラス上に固定し、カバーガラスで覆います。蛍光顕微鏡下で、皮層から髄まで各oleinを観察し、オルガネラマーカーの細胞内分布に変化があるかを確認します。陽性個体を土壌に移植し、上述と同様に苗を育成させ、M3世代で変異表現型が固定していることを確認します。書面によるプロトコルに記載されている通り、目的のオルガネラ蛍光マーカーを含む野生型ゲノムへ少なくとも3回の戻し交雑を行い、混入した背景変異を除去します。マッピングを開始するには、Qiagen DNeasy Plant Mini Kitを用いて、ホモ接合型変異体Columbia DNAであるM3から約3 µgのゲノムDNAを抽出します。このDNAをIllumina Genome Analyzer 2 14シーケンシングに提出してください。次のステップは、zago変異体ColombiaとLas Bergerを交配させ、自己受粉後の後代において組換えが起こりうる個体を生成することです。得られた後代（F2世代）は、最終的に、変異の原因となる目的遺伝子を含むマッピング集団として機能します。この集団のゲノムDNAと野生型植物のゲノムDNAを比較することで、ゲノム内における変異箇所の特定が可能になります。F2個体を育成した後、異常な表現型を示すF2個体を70〜100個体、および野生型表現型を示すF2個体を同数集め、ホールパンチを用いて各個体から葉ディスクを採取する。葉ディスクは、同齢の葉から採取すること。DNA量を均一にするため、サンプルは個別に、またはグループに分けてゲノム抽出処理を行うことができる。この場合、各eend orphチューブにつき5〜10個のサンプルを回収することが可能であり、これによりゲノムDNAを抽出する必要があるチューブの数を減らすことができます。MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kitを使用してゲノムDNAを抽出してください。その後、各サンプルから得られたゲノムDNAをNanoDropで定量できます。次に、変異型と野生型のサンプルを分けて、各サンプルから等量のDNAを合わせて合計300 nanogramsになるように混合し、標識反応の準備をします。まず、2.5 x random primer solutionを60 microlitersと、水を42 microliters加えます。DNAを95 degrees Celsius以上で5～10分間変性させた後、サンプルを氷上で急冷してDNAを変性させます。10 X DN tpsを15 microliters加えます。biotin DCTPおよび3 µLのGlen polymeraseを加えて混合します。サンプルを25 °Cで一晩インキュベートします。翌日、3 Mの酢酸ナトリウム15 µLと、冷却した100%エタノール400 µLを加えます。混合サンプルを20,500 ×gで15分間遠心分離した後、-80 °Cで1時間インキュベートします。再度遠心分離を行い、ペレットを冷却した75%エタノール500 µLで洗浄します。DNAペレットを37 °Cで10分間乾燥させます。ペレットを100 µLの水で再懸濁し、そのうち5 µLを用いてゲル電気泳動で収量と品質を確認します。野生型F2植物のプールおよび変異体F2植物のプールから得られたランダム標識反応産物を、1%アガロースゲルにアプライしました。最終ステップとして、野生型および変異体のラベル化反応液 95 µL を、gene chip arabidopsis ath one ゲノムアレイハイブリダイゼーションに供します。スキャナーで読み取った後、得られたドット CL ファイルを専用ソフトウェアを用いて解析します。ソフトウェアをインストールし、プログラムを起動して、書面の手順書にある bioconductor 文字列を貼り付けてください。次にリターンキーを押すと、array, genotyping and mappingのウェブサイトから標準的なBIOCONDUCTORパッケージがインストールされます。テキストに記載されているファイルをダウンロードし、デスクトップ上の新しいフォルダに解凍して保存します。ジーンチップ実験で得られたデータを、野生型C、L、および変異型Cとして保持します。次に、野生型Cと変異型Cのジーンチップデータをそのフォルダにコピーします。次に、PCでRを開きます。[ファイル]をクリックし、[ディレクトリの変更]をクリックします。ファイルが保存されているフォルダを選択し、[ワークスペースの読み込み]をクリックして、A1V5 R dataを選択します。メモ帳でread C do Rを開き、全文をRにコピーします。Macの場合は、[メニュー]をクリックし、[作業ディレクトリの変更]をクリックします。ファイルが含まれているフォルダーを選択します。[workspace load workspace file] をクリックし、ATH one V five R data を選択します。同様に、テキストエディタを使用して SFP R と MAP R の両方を開き、そのテキストをコンソールの R ウィンドウにコピーします。Arabidopsis information resource（TAIR）で遺伝子を検索するようメッセージが表示されます。テキスト内にあるリンクをコピーしてインターネットブラウザに貼り付けてください。ウィンドウが表示され、ファイルを「開く」か「保存」かを確認するメッセージが出ます。「保存」を選択します。ファイル名を入力し、拡張子を付加してください。x lsを実行します。次に、「保存」をクリックします。ここに期待される典型的な結果を示します。ジーンチップ Arabidopsis H1 ゲノムアレイから得られたデータを解析した後、この図はジーンチップ Arabidopsis H1 ゲノムハイブリダイゼーションを用いた Columbia 0 変異のマッピング例を表しており、水平線は検出閾値を示しています。この例の変異は第1染色質上に位置しており、垂直線で区切られています。dot XLSファイルを開き、マッピング領域内にある変異体の座標を確認してください。変異体ゲノムのアセンブルされたIlluminaリードにおいて、一塩基多型の中から特定のEMS遷移を特定します。本プロトコルで説明する手法を習得すれば、従来のマッピング法と比較して、より短い期間で遺伝子のマッピングを行うことが可能です。

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蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

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