Name: 蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ 蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシングを用いた植物オルガネラの形態・機能的整合性に関与する遺伝子の同定法。この手法は細胞生物学研究に有用です。

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我々は化学科学、地球科学とバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学、科学局、米国エネルギー省（受賞番号DE-FG02-91ER20021）と国立科学財団（MCB 0948584）（FB）の事務局のサポートを認める。私たちは、原稿を編集するためのMSカレン鳥に感謝しています。

1。 EMSトリートメント シロイヌナズナの種子は、T /変異が5月7日にC / Gの結果ゲノムのC-to-T変化に誘導される変異剤エチルメタンスルホン酸（EMS）3,4、として使用して変異しています。 <ol><li>細胞小器官蛍光マーカー（具体的には、本研究ではssGFPHDEL（シグナル配列-GFP-HDELテトラペプチド）は、ERのマーカーとして使用されている）を運ぶ0.8グラムシロイヌナズナ種子（〜40,000シーズ）を量る。 </li><li> 50 mlのファルコンチューブに種子を譲渡し、25ミリリットルの蒸留水を追加します。 </li><li> 0.2％（v / v）のエチルメタンスルホン酸塩を追加します。 </li><li>低速でミキサーをnutatingで16時間インキュベートします。 </li><li>液体を吸引除去し、EMSを不活性化するために1.0 M NaOHを含むフラスコにそれを破棄します。 </li><li>近くに、種子を含むファルコンチューブに25mlの水を追加し、5回反転の種子を洗浄するために、すべての種子が定着するまで待機し、その後1.0 Mナトリウムに水を吸引して捨てる<html>フラスコOH。 </li><li>最大10回まで洗浄工程を繰り返します。 </li><li>最後の洗浄後、水の最小量の種子を再懸濁する。 </li><li> 10％の漂白剤の25 mLを加え、シード滅菌に進み、30秒間激しく振る。種子が底に沈殿させ、その後、漂白剤を捨て、滅菌水25 mLで洗浄してください。滅菌水を捨て、25mlの70％エタノールを追加します。 30秒間チューブを振る。種子が底に沈殿しましょう​​。エタノールを捨て、滅菌水25 mLで洗浄してください。滅菌水で2回洗浄を繰り返し、その後3 MMろ紙を含むプラスチック製のペトリ皿に種を注ぎ、ボンネットの下に乾燥させます。 2日間4℃で保管してください。 </li><li> ½MS phytagel（MurashigeおよびSkoog培地の半分の濃度）、150 mmのペトリ皿（プレート〜250から300種）のプレートの種子を。 </li><li>土壌に移植し、2週間プレート上にM1の種子を栽培しています。 </li><li> M2線（1000独立した行）を生成するために、個々のM1植物からM2の種子を収集します。 </li></ol>M2とM3の個体群のove_title &quot;&gt; 2。焦点スクリーニングこのセクションでは、以前の8の説明に従って、共焦点または蛍光顕微鏡で苗の観察を説明します。 <ol><li>各M2ラインから起算して六十種は、プラスチック製のペトリ皿に7〜10日間栽培されている½MS phytagel、同じプレートでも（コントロール）EMS-未処理の5本の苗木を栽培されています。 </li><li> 5〜10子葉は、顕微鏡スライド上にレンズ（40X）に向かって背軸側でマウントし、カバーガラスで囲まれています。 </li><li>それぞれの子葉は、オルガネラのマーカーのいずれかに変更された細胞内分布の蛍光の下で、皮質から内側領域に観察される。 </li><li>陽性植物は、土壌に移植され、その種子はM3世代における変異体の表現型を確認するために再度収集し、スクリーニングされる。 </li><li>野生型ゲノムに少なくとも3回は、おそらく共同戻し交配を通して汚染のバックグラウンドの変異を削除します。希望するオルガネラの蛍光マーカーをntaining。 <ol><li>母植物から、細かいハサミや鉗子を使用すると、成熟したsiliquesを削除して、開いた花。 </li><li>分裂組織から小さすぎるつぼみを削除します。 </li><li> 1花芽を開き、すべての葯を削除するには、花弁とがく片の間に鉗子の一組の先端を挿入します。 </li><li>鉗子のいずれかのペアを使用すると、父親の工場から開いている成熟した花を取ると去勢植物の柱頭に葯をこする。 </li></ol></li></ol> 3。マッピングこのセクションでは、伝統的なマッピング方法10,11と比較する場合に高速ですBorevitz 9時から変更されたプロトコルを使用して、劣性突然変異をマッピングする方法を本質的に説明しています。このアプローチは、単一のアッセイ12に多数の単一の機能多型（SFPを）検出する能力と高密度のオリゴヌクレオチド配列を使用します。アフィメトリクスシロイヌナズナATH1のGeneChipのアレイを使用することも可能です約24,000の遺伝子を分析します。変異を示すF 2個体のプールは、同じ分離集団内で収集された野生型のF 2植物のプールと比較されます。その後、変異は変異体プールが変異遺伝子の対立遺伝子が濃縮されている領域にマッピングされ、その結果、同じ地域に野生型プールは、野生型の親の対立遺伝子13の豊かなことになります。 <ol><li>ゲノムDNA（3μg）をQiagen社DNeasy植物ミニキットを使用して、ホモ接合変異体コロンビア（M3）から抽出され、イルミナGenome AnalyzerのII（GA II）14シークエンシングのために提出されています。 </li><li>ホモ接合変異体コロンビア（M3）は、マッピング集団を生成するためランツベルクエレクタと交配されています。 </li><li>マッピングは、異常な表現型と野生型の表現型とF2植物の同じ数を示す70、最大100 F2個体で実行されます。 </li><li>各工場から穴パンチを使用してリーフディスク（0.60 mm）を収集します。ザリーフディスクは、DNAの類似した量を持っていることを確認するため、同じ年齢の葉から収集する必要があります。サンプルは、個別に、またはグループ内のゲノム抽出のために処理することができます。この場合、それは最終的にはゲノムDNAを抽出する必要があり、そこからより少ないエッペンドルフチュー​​ブを持つようにそれぞれのエッペンドルフチュー​​ブに5〜10サンプルを収集することが可能です。 </li><li> MasterPure植物の葉のDNA精製キット（EPICENTRE）は、ゲノムDNAを抽出するために使用されています。各試料から得られたゲノムDNAは、光度計で定量されています。 </li><li>各サンプルからのゲノムDNAの同量は、植物のDNAを300 ngの（〜30μL）の合計に一緒に入れて、60μL2.5Xランダムプライマー溶液を加え、[125 mMのトリス-HCl（pH6.8）を、12.5mMののMgCl 2、25mMの2 - メルカプトエタノール、750μg/ mlのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ランダム八量体）]（Bioprimeキット）と42μLの水（最終容量132μL）。 </li><li> 5から10分&gt; 95°Cで変性はDNAが。 </li><li>氷の上で涼しい。 </li><li>各denatuへ赤のDNAは、[1 mMのビオチン-14-dCTPを、1mMのdCTPを、2mMのdATPを、2mMのdGTPを、10mMトリス-HCl（pH7.5）で2 mMのdTTPを、1mMのNa2EDTA]ビオチンdCTPで15μL10XのdNTPミックスを追加する（Bioprimeキット）、3μLクレノウポリメラーゼ（Bioprimeキット）で完了します。 </li><li> 25℃で一晩インキュベートする</li><li>ミックス、次の日に、15μlの3 M NaOAc、400μL冷100％エタノールを追加します。 </li><li> 1時間-80℃でインキュベートし、その後15分間20500×gで回転、上清を除去し、500μLの冷75％EtOHで洗浄する。 </li><li> 10分間、20500×gで遠心する。 </li><li> 100μLの水で10分間再懸濁し、37℃で乾燥したDNAペレット。 </li><li>ゲル（ 図2）収量と品質を確認するために5μLを使用しています。 </li><li>のために、野生型と変異型のGeneChip ATH1シロイヌナズナゲノムアレイハイブリダイゼーション反応をラベリングの95μLを送信します。 </li><li> Rソフトウェア（使用してアレイがスキャンされ、得られた。CELファイルが解析され<a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.oを</a>RG /）。 </li><li> Rのソフトウェアをインストールし、プログラムを開き、次の文字列を貼り付けます。 ソース（ &quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;） biocLite（） その後、リターンキーを押して、これは標準BioConductorのパッケージ（インストールされます<a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ）。 </li><li>デスクトップ上の新しいフォルダには、次のWebサイト（からダウンロード<a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ）ファイル： readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip ファイルColLerCEL.zipが解凍され、結果のファイルは新しいフォルダに貼り付ける必要があります。 </li><li> wildtype.CELとmutant.CELにあなたのGeneChipの実験から得られたデータの名前を変更します。 </li><li>あなたのGeneChipのデータ（wildtype.CELは 、今コピーします。あなたのフォルダにmutant.CEL）。 </li><li>クリックして &quot;その他&quot;とクリックします。オープンR、Mac用） &quot;作業ディレクトリを変更します。&quot;クリックして &quot;ファイル&quot;から &quot;チェンジディレクトリ&quot;：B）PC用</li><li> Macの場合）：ファイルを含むフォルダを選択します。 &quot;ワークスペース&quot;、 &quot;ロード·ワークスペース·ファイルをクリックします。、ファイルを&quot; PC用を選択しath1V5.RData、b）に上記のファイルを含むフォルダを選択し、クリックして&quot;&quot;それから&quot;ロードワーク&quot;とath1V5.RDataを選択します 。 </li><li>メモ帳を使用してreadCEL.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする</li><li>メモ帳を使用してSFP.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする</li><li>メモ帳を使用してMap.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする</li><li>コンソールウィンドウに次のメッセージが表示されます。 X染色体は、MB YZを制限する このリンクを貼り付けTAIRで検索遺伝子 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>＆最後= Z </li><li>インターネットブラウザにリンクをコピーして貼り付けます。ウィンドウが表示され、ファイルを開くか保存するかを尋ねてきます。あなたは、保存を選択する必要があります。ファイル名を選択し、[保存]をクリックし、 &quot;。XLS&quot;拡張子を添付してください。 </li><li>ファイルを開き、あなたの変異体の座標を（結果はグラフィカルに、図3に表される）を見つけることができます。 &quot;XLS&quot;。 </li><li>組み立てイルミナにマップされた領域内の単一塩基多型のうち、特定のEMSの遷移4を識別する変異体ゲノムの読み取り。標準的な手順15を使用して、野生型遺伝子（s）で形質転換して変異体の表現型を補完します。 </li></ol> 4。代表的な結果 図1は、共焦点顕微鏡のスクリーニングを使用して、分泌経路の変異体の同定に使用されるアプローチを示しています。 図2は、アレイハイブリダイゼーションのために標識されたゲノムDNAの典型的な準備を示しています。。 図3に、GeneChipのシロイヌナズナATH1ゲノム配列から得られたデータを分析した後、予想される典型的な結果が提示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> 図1。ssGFPHDEL（ERマーカー）（1）を発現するシロイヌナズナ形質転換植物は、EMS処理（2）のための十分な種子を生産するために培養した。 EMSで処理した種子は、その後M1植物（3）を生成するために播種した。各M1プラントは別の行を表しており、種子は、それらの各々から別々に収集した。 M2種子は½MS基板（4）上に播種し、共焦点顕微鏡（5）でER形態の欠陥についてスクリーニングした。スクリーニング時に我々は、野生型ERの形態（6）不良ER表現型（7）を示す植物を保存すること植物を発見した。これらの植物は、M3世代を取得し、表現型（8）を確認するために、成長させた。 M3の植物からのゲノムDNAは、Solexaイルミナシーケンス（）を使用した。同じ植物また、F2マッピング集団（b）を得るためにLER-WTとの交雑のために使用されていました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> 図2。Bioprimeランダムラベリング反応（100μL、5μL）をアガロースゲル1％ロードされていました。レーンは、野生型F2植物のプールからのものであり、レーンBは変異体F2植物のプールからのものです。 （マーカーはNEBから、1 kbのDNAラダー-N3232）です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> 図3図は、GeneChipのシロイヌナズナATH1ゲノムアレイハイブリダイゼーションを使用して、COL-0突然変異のマッピングの例を表しています。この例では変異は染色体1、縦棒で区切られて位置しています。横棒は、検出のしきい値を表しています。

<ol><li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li>
<li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3%2C+a+non-essential+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li>
<li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li>
<li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li>
<li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li>
<li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li>
<li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Golgi+apparatus%3A+from+imaging+to+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li>
<li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li>
<li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li>
<li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li>
<li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li>
<li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).</li>
<li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは、内膜変異体の同定のための共焦点顕微鏡ベースのスクリーニングを説明しました。このアプローチは、簡単に特定の蛍光タンパク質マーカーが用意されているセルの他の器官に拡張することができます。画面は、ターゲット細胞小器官で、またはマーカーを含むことが想定されていない細胞小器官のいずれかに蛍光マーカーの異常分布を示す変異体の同定に基づいています。それぞれ、これらの変異体は正常細胞小器官の間でマーカーを転位することができませんマーカーをsubcompartimentalizeする細胞小器官の機能のいずれかが侵害されている集団や突然変異体を表しています。しかし、その他は開発の後期段階での表現型を示した。スクリーニングの間に我々はいくつかの変異体は発芽7日後には早くも開発の初期段階で表現型を示したことに気づいた。これは、変異の開発に依存した表現を含むいくつかの理由、にリンクされているかもしれませんが対立遺伝子（s）は、これは植物が潜在的に興味深い突然変異体が破棄されていないことを保証するために（少なくとも7〜14日）は、異なる成長段階で検討すべきであることを示唆している。 このプロトコルで...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>エチルメタンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> JTベーカー</td><td> 3722から05 </td></tr><tr><td>ムラシゲスクーグ培地ワットgamborgビタミン</td><td>フィトtechnolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td>シグマ</td><td> P8169-1キロ</td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td>マスター純粋な植物の葉のDNA精製キット</td><td> EPICENTRE </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime DNAラベリングシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td>アルコール200プルーフ</td><td>デカンラボラトリーズ。 </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JTベーカー</td><td></td></tr><tr><td>遺伝子チップシロイヌナズナATH1ゲノム配列</td><td>アフィメトリクス</td><td> 900385 </td></tr><tr><td>ファルコンチューブ50 mLの</td><td>コー​​ニング</td><td> 430290 </td></tr><tr><td>エッペンドルフチュー​​ブを1.5 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 90ミリメートルろ紙</td><td>ワットマン</td><td> 1001090 </td></tr><tr><td>化学てんびん</td><td>メトラー·トレドAB54-S </td><td> NA </td></tr><tr><td> Nutating（波）シェーカー</td><td> Heidolph PolyMAXの1040 </td><td> NA </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ5417-R </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

このプロトコルは、 シロイヌナズナ実生の蛍光顕微鏡ベースのスクリーニングを説明し、分泌経路内の特定のタグ付き蛍光マーカーの細胞内分布を変化させる劣性変異をマッピングする方法について説明します。 シロイヌナズナたため、そのゲノムサイズの遺伝学的研究のための強力な生物学的なモデルであり、世代時間、王国間の分子機構の保全。分子マーカーに基づいて、従来の方法に代わるもので突然変異をマッピングするためのアプローチとして、ジェノタイピングアレイは、比較的高速であるため有利であると本当に短い時間枠のいくつかの変異体のマッピングを可能にすることができる。この方法は、植物のどのオルガネラの整合性に影響を与えることができるタンパク質の同定を可能にします。ここでは、一例として、我々は小胞体（ER）の整合性のための重要なマップの遺伝子に画面を提案する。我々のアプローチは、しかし、簡単に他の植物の細胞小器官に拡張することができます（例えば、1,2を参照）ため、他の細胞内構造を支配する分子基盤を理解する重要な一歩を表しています。

細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。

本プロトコールでは、シロイヌナズナの幼苗を用いた蛍光顕微鏡ベースのスクリーニングについて述べ、...を変化させる劣性変異をマッピングする方法について説明します。

この実験の目的は、植物オルガネラの形態的および機能的な完全性を担う遺伝子を特定することです。まず、オルガネラ蛍光マーカーを保持するシロイヌナズナの種子に化学変異剤としてエチルメタンスルホナートを添加します。次に、第一世代の変異株（M1）の個別の植物から種子を回収し、次世代の変異株（M2）のラインを育成します。次に、変異誘発したElianaの種子を共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察し、器官の異常表現型を特定します。最終ステップとして、第3世代の変異体を作成し、変異表現型の存在を確認します。最終的に、次世代シーケンシングツールを用いて、劣性変異のマッピングを行うことができます。変異遺伝子の位置が特定された後、野生型遺伝子による形質転換を行うことで、異常なオルガネラの表現型を回復させることができます。この手法は、植物オルガネラの形態的および機能的な完全性の維持に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。Atil methanesおよびスルホン酸処理をatop sta種子に施すと、ゲノム内でシトシンのタイミング変化が誘導され、結果としてシトシンgwanからtimingへの変化が生じます。変異の導入。本プロトコルにおいて、M2個体内で最適な変異率を確保するために、EMS処理は重要なステップとなります。まず、適切なオルガネラ蛍光マーカーを導入済みの野生型Columbia ecotypeのArabidopsis種子を用意します。0.8 g（約40,000粒）の種子を50 mLファルコンチューブに移します。次に、25 mLの蒸留水と0.2%エチルメタンスルホン酸を添加します。この混合物を変異誘発用ミキサーを用いて低速で16時間インキュベートします。インキュベーション後、液体を吸引し、1 M水酸化ナトリウムを含むフラスコに廃棄します。EMSを不活化させるため、種子が入ったFalconチューブに25 millilitersの水を加えます。チューブを閉め、5回反転させて種子を洗浄します。すべての種子が沈殿した後、水を吸引し、1 molar水酸化ナトリウムフラスコに廃棄してください。この洗浄工程を最大10回繰り返した後、最終洗浄で種子を少量の水に浸します。次に、10% bleachを25 milliliters加え、30秒間激しく振って種子の滅菌を行います。種子が底に沈殿したら、bleachを捨て、25 millilitersの滅菌水で洗浄します。滅菌水を除去した後、70%エタノールを25 milliliters加えます。チューブを30秒間振盪し、種子が底に沈降するまで待ちます。エタノールを捨て、25 millilitersの滅菌水で洗浄します。滅菌水での洗浄を2回繰り返します。次に、3 mmのフィルターペーパーを入れたプラスチック製ペトリ皿に種子を注ぎます。種子を4 °Cで2日間

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生物学

GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ-...

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劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。...

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

このビデオでは、界面活性剤可溶化後の大腸菌における緑色蛍光タンパク質(GFP)融合膜タンパク質の安定性をスクリーニングするための蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー技術を示しています。サイズ排除プロファイルで対称的なピークを示し、遊離GFPがほとんどまたはまったくないタンパク質は、分解と凝集が最小限に抑えられた精製タンパク質を示しており、その後、構造機能解析のために選択できます。...

蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー:界面活性剤の可溶化に伴う蛍光膜タンパク質の完全性を同定する技術

Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy...

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。...

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。...

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

電子顕微鏡、遺伝子センサー、免疫蛍光法によるマイトファジーの探索には、高価な機器、熟練した人員、および多大な時間投資が必要です。ここでは、 カエノラブディティスエレガンス...

オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出

このプロトコルは、老化中の C.エレガンスの...

老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

ここでは、画像への基本的なプロトコルを記述し、siRNAのトランスフェクション後のライブ哺乳類の組織培養細胞の有糸分裂のタイミングを定量化する。...

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

学ぶ 蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシングを用いた植物オルガネラの形態・機能的整合性に関与する遺伝子の同定法。この手法は細胞生物学研究に有用です。

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

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