蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

この実験の目的は、植物オルガネラの形態学的および機能的完全性に関与する遺伝子を特定することです。これは、まず、オルガネラ蛍光マーカーを運ぶ変異原性アトピー種子に化学薬品としてエセルメタンスルホン酸を添加することによって達成されます。第2のステップは、最初の変異原世代の個々の植物から種子を収集して、後続の変異体第M世代2の系統を成長させることです。

次に、エリアナが種子した変異原を共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して観察し、異常な器官表現型を特定します。最後のステップは、第3変異原世代を生成し、変異体表現型の存在を確認することです。最終的には、劣性変異は、次世代のシーケンシングツールを使用してマッピングできます。

変異遺伝子の位置が特定されると、野生型遺伝子による形質転換により、異常な器官表現型が回復するはずです。この方法は、植物オルガネラの形態学的および機能的完全性の維持における重要な質問に答えるのに役立ちます。アチルメタン、スタ種子の上のスルホン酸処理は、ゲノムのシトシンタイミング変化を誘発し、シトシンからタイミング

突然変異の追加。EMS治療は、このプロトコルの重要なステップであり、M 2人の個人内で完全な比率の突然変異を確保します。まず、関連するオルガネラ蛍光マーカーを運ぶように以前に操作された野生型コロンビアエコタイプのシロイヌナズナの種子を入手します。

0.8グラムまたは約40, 000個の種子を50ミリリットルのファルコンチューブに移します。次に、25ミリリットルの蒸留水と0.2%エテルメタンスルホン酸を加えます。インキュベーション後、変異ミキサー上で低速で混合物を16時間インキュベートし、液体を吸引し、1モルの水酸化ナトリウムを含むフラスに廃棄します。

EMSを不活性化するには、種子を含むファルコンチューブに25ミリリットルの水を追加します。チューブを閉じ、5回反転させて種子を洗います。すべての種子が落ち着いたら、水を吸引し、1モルの水酸化ナトリウムフラスコに捨てます。

この洗浄ステップを最終洗浄後最大10回繰り返し、リースは最小限の水で種子を使用します。25ミリリットルの10%漂白剤を加え、30秒間激しく振とうして種子滅菌に進みます。種子が底に落ち着いたら、漂白剤を注ぎ、25ミリリットルの滅菌水ですすいでください。

滅菌水を取り除いた後、25ミリリットルの70%エタノールを追加します。.チューブを30秒間振って、種子が底に落ち着くのを待ちます。エタノールを注ぎ、25ミリリットルの滅菌水ですすいでください。

滅菌水洗いを2回繰り返します。次に、3mmの濾紙が入ったプラスチック製のペトリ皿に種を注ぎます。種子を摂氏4度で2日間インキュベートした後、フードの下で種子を乾燥させます。

150ミリメートルのペトリ皿に種子を1皿あたり約250〜300個の種子で入れ、半分のマギとファイタージェルを含むスクーグ培地に入れます。ゼリー剤として、M1世代の種子をプレートで2週間育てます。苗を土に移植し、植物が成長し続けるのを待ちます。

30〜45日後、植物は成熟する成熟段階に達するため、漏れがはっきりと見えます。この時点で、個々のM1植物からM個の2個の種子を収集して、1000個の独立したM個の2系統を生成します。共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で苗を観察するために、プラスチックのペトリ皿で半分に7〜10日間、各Mツーラインから60個の種子を成長させます。

ファイターゲルを配合したスクーグ培地とモリーシュも同じプレート上にEMS未処理コントロールの苗を5本育てます。苗が成長したら、顕微鏡スライド上の40倍レンズに向けてABACシール側を5〜10コスリードインに取り付け、蛍光下でカバースリップで封入し、皮質から内側領域までの各オレインを観察し、オルガネラマーカーの細胞内分布の変化を確認します。陽性植物を土壌に移植し、苗木が今述べたように成長した後、突然変異体の表現型がM3世代にあることを確認します。

文書化されたプロトコルに記載されているように、所望の有機蛍光マーカーを含む野生型ゲノムへの少なくとも3回のバッククロッシングを通じて、汚染されたバックグラウンド変異を除去する。マッピングを開始するには、コジェンDN Easy Z植物ミニキットを使用して、ホモ接合型変異体コロンビアDNAを表すM threeから約3マイクログラムのゲノムDNAを抽出します。このDNAをIlluminaゲノムアナライザー2 14シーケンシングに提出してください。

次のステップは、ザゴミュータントコロンビアウィルラスベルガーを交差させて、組み合わせが発生する可能性のある自家受粉に続く1つの子孫を生成することです。耳の聞こえない歯の世代は、結果として生じ、最終的には、突然変異を引き起こしている目的の遺伝子を含むマッピング集団として機能します。この集団のゲノムDNAをウェルタイプの植物のゲノムDNAと比較することにより、ゲノム内の突然変異の位置を特定できます。

F2株の生育後、野生型表現型を有するF2株と同数の異常な表現型を示すF2個体を70〜100株集め、ホールパンチを用いて各植物から葉盤を採取する。葉の円盤は、同じ年齢の葉から収集する必要があります。DNAの量を同程度にするために、サンプルを別々に、またはグループでゲノム抽出用に処理することができます。

この場合、ゲノムDNAを抽出しなければならないチューブが少なくなるように、各eendオーフチューブごとに5〜10個のサンプルを収集することができます。マスターピュア植物葉DNA精製キットを使用して、ゲノムDNAを抽出します。その後、各サンプルから得られたゲノムDNAをNanoDropで定量できます。

次に、各サンプルから同量のDNAを合計300ナノグラムまで組み合わせ、変異型サンプルと野生型サンプルを分離して最初に標識反応を行い、60マイクロリットルの2.5 xランダムプライマー溶液と42マイクロリットルの水を追加します。DNAを摂氏95度以上で5〜10分間変性させた後、氷上のサンプルを呼び出してDNAを変性させます。15マイクロリットルの10 X DN tpsを追加します。

ビオチンDCTPと混合し、3マイクロリットルで完成させます。グレンポリメラーゼ。サンプルを摂氏25度で一晩インキュベートします。

翌日、15マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと400マイクロリットルの冷たい100%エタノールを追加します。混合サンプルを摂氏マイナス80度で1時間インキュベートし、遠心分離後20,500倍Gで15分間インキュベートします。2回目のスピンに続いて、ペレットを500マイクロリットルの冷たい75%エタノールで洗浄します。

DNAペレットを摂氏37度で10分間乾燥させます。ペレットを100マイクロリットルの水に懸濁し、5マイクロリットルを使用してゲルバイオの収率と品質を確認します。プライムランダム標識反応を、野生型F 2植物のプールおよび変異型F 2植物のプールからの1%arosゲルにロードしました。

最後のステップとして、遺伝子チップシロイヌナズナと1つのゲノムアレイハイブリダイゼーションのための野生型および変異体標識反応の95マイクロリットルを送付します。消しゴムをスキャンした後、得られたドットCLファイルは、当社のソフトウェアを使用して分析されます。ソフトウェアをインストールした後、プログラムを開き、書かれた手順にある生体導体文字列を貼り付けます。

次に、リターンキーを押すと、アレイ、ジェノタイピング、マッピングのWebサイトから標準のBIOCONDUCTORパッケージがインストールされます。テキストにリストされているファイルをダウンロードして、デスクトップ上の新しいフォルダーに解凍します。遺伝子チップ実験で得られたデータを野生型C、L型、変異型Cに残し、野生型Cと変異体Cの遺伝子チップデータをフォルダにコピーします。

次に、PCのRを開きます。[ファイル] をクリックし、[ディレクトリの変更] をクリックします。ファイルを含むフォルダを選択し、[ファイルロードワークスペース]をクリックし、[A one V 5 R]データを選択してメモ帳を使用してCドRを開き、MacのRにテキスト全体をコピーし、[ミス]をクリックしてから、[作業ディレクトリの変更]をクリックします。

ファイルを含むフォルダを選択します。[ワークスペース] [ワークスペース ファイルの読み込み] をクリックし、[ATH one V five R data] を選択します。同様に、テキストを使用して SFP R と MAP R の両方を開き、コンソール ウィンドウでテキストを編集して R にコピーします。

シロイヌナズナ情報リソースまたはTAIRで遺伝子を検索するメッセージが表示されます。テキストにあるリンクをコピーして、インターネットブラウザに貼り付けます。ウィンドウが表示され、ファイルを開くか保存するかを尋ねられます。

[保存] を選択します。ファイル名を選択し、拡張子を添付します。do x ls.

次に、[保存]をクリックします。ここに示されているのは、予想される一般的な結果です。この図は、遺伝子チップシロイヌナズナH oneゲノムアレイから得られたデータを解析した後、遺伝子チップシロイヌナズナ(H oneゲノムハイブリダイゼーション)を用いたコロンビアゼロ変異のマッピングの一例を表しており、横棒は検出の閾値を表しています。

この例の突然変異は、縦棒で区切られた1番染色体上にあります。dot XLSファイルを開き、マッピングされた領域内の変異体の座標を見つけます。アセンブルされたIlluminaによる変異体ゲノムのリードで、一塩基多型間の特定のEMS遷移を特定します。

このプロトコルを説明するアプローチを習得すると、従来のマッピング方法と比較して、3つの短い時間枠で遺伝子をマッピングするために使用できます。