リポ多糖類注射によるゼブラフィッシュ幼生の神経炎症誘発

麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫をアガロースゲルで裏打ちされた皿に入れ、注射のために脳が上を向くようにします。

皿を顕微鏡下に置き、発達中の脳内の液体で満たされた空洞である脳室を視覚化します。

免疫応答を引き起こす細菌成分であるリポ多糖類(LPS)の溶液を含むマイクロインジェクション針を取ります。

ニューロンと常在免疫細胞、特にミクログリアを含む領域である脳蓋の上に針を置きます。

針で脳に穴を開け、LPS溶液を心室に注入します。

周囲の組織のミクログリアは、トール様受容体を介してLPSに結合します。

この結合により炎症誘発性サイトカインの放出が引き起こされ、好中球がその部位に動員され、神経炎症を引き起こします。

好中球は活性酸素種のバーストを生成し、タンパク質分解酵素を放出し、神経細胞死を引き起こします。

神経炎症誘発幼虫を培地に移し、下流のアッセイのために維持します。

マイクロインジェクション装置の針先が高倍率で幼虫と同じ視野になるようにマイクロマニピュレーターをセットアップします。電子レンジを使用して二重蒸留水中の2%アガロースの溶液を溶かします。溶融したアガロースをプラスチック皿に注ぎます。プラスチックトランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫を2%アガロースでコーティングされたプラスチック皿の中心に輸送します。

取り付けられた幼虫を、針にアクセスできるように脳側を上に向けます。顕微鏡の倍率を調整して、ゼブラフィッシュの脳室構造が視野にはっきりと見えるようにします。針を脳蓋の上に慎重に置きます。脳部を70%エタノールで洗浄し、マイクロマニピュレーターを使って針先でゼブラフィッシュの脳の皮膚をゆっくりと

穿刺します。

フットペダルを踏んで、1ナノリットルの1X PBSまたは異なる濃度のリポ多糖類を排出します。注射直後に幼虫をクリーンなE3培地に移します。