イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胎生における脳血管構造を評価することです。これは、最初に受精したゼブラフィッシュの卵を収集し、処理条件を設定することによって達成されます。3日間の成長期間の後、ゼブラフィッシュは固定で犠牲にされ、目を慎重に取り除いてから標本をカバーガラスに取り付けます。

次に、脳血管系を共焦点顕微鏡で画像化します。最後に、血管系の3Dレンダリングは、オープンソースソフトウェアを使用して生成されます。最終的には、再建の分析を使用して、治療条件が血管の分岐と密度に及ぼす影響を判断します。

発達中のゼブラフィッシュの脳で。この手法は、ゼブラフィッシュの胚の血管系全体を評価します。これにより、アミロイドベータの生物学を臓器系レベルで研究することができました。

この手法は、解剖と画像解析が技術的に困難であるため、習得が難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。まず、目的の組織で緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ株を摂氏28.5度で、14時間の光と10時間の暗サイクルで育てます。この例では、血管内皮細胞でEGFPを発現するトランスジェニック魚を、卵収集の前夜に飼育し、メッシュ底の交尾水槽に雄と雌をセットし、翌朝、仕切りを取り除き、魚が15分ごとに卵をチェックしながら交尾することを可能にする。

メッシュストレーナーで卵を採取し、Eスリーメディウムで卵を洗った後、Eスリーで卵を100mm培養皿に移し、28°Cで孵化させることで脳血管の枝分かれを変化させます。受精後24時間から、DMSOに可溶化されたガンマセクレターゼ阻害剤などの化学物質を追加します。必要に応じて、0.03%PTUを添加して色素形成を抑制します。

溶液中の胚を12のウェルに移した後、ウェルプレートは、胚が所望の発達段階に達するまで摂氏28.5度でインキュベートする。トリカで胚を犠牲にし、摂氏4度で一晩アルデヒドで固定した後。胚を摂氏4度の暗闇でPBSに保存します。

胚から眼を摘出するには、鋭利なタングステン針を使用し、片方の眼をつなぐ組織の周りを切断します。次に、筋肉を切断し、最後に視神経を切断して目を取り除きます。目を取り除いたら、胚を空の眼窩を下に向けてカバーガラスに触れて、胚をカバーガラスにひっくり返します。

3%メチルセルロースを一滴加えて、胚を所定の位置に保持し、胚全体を覆って乾燥を防ぎます。20 x planのAPO対物画像、胚の即時画像を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用したイメージング中、多くのイメージングシステムは、この標本の途中でしか血管構造を分解できません。この場合、胚をPBSに懸濁させ、反対側に再マウントしてさらにイメージングを行い、3Dレンダリングに最適化された画像Jを使用して脳血管画像の3D再構成を行います。

プラグイン、loci、bio formats importerに移動して共焦点スタックをインポートし、Nikonスタックの共焦点ファイルを選択し、ハイパースタックでスタックを表示し、カラーモードをグレースケールに設定します。次に、自動スケールとチャンネルの分割を確認します。これらの選択により、4つの別々のチャンネルパネルが開きます。

ファイル名の後に c が 1 に等しい 16 ビット イメージ以外のすべてを閉じます。しきい値を調整するには、下部のスクロールタブを使用してスキャンし、関心のある領域または構造を持つスライスを見つけます。次に、画像調整しきい値に移動します。

表示されるパネルで、上部バーを左にスライドさせて、構造が背景からかなりよく見えるようにし、下部のスライドをそのままにして新しい8ビット画像を作成します。b と w を選択します。次に、暗い背景。

スライスごとに異なる調整が必要でない限り、画像ごとにしきい値の計算を選択しないでください。次に、プラグインの3Dビューアしきい値ゼロリサンプリング係数1または2に移動し、赤と青のカラーボックスの選択を解除して、緑の3D出力を作成します。それ以外の場合は、白いレンダリングが生成されます。

次に、[適用] を選択します。マウスとキーボードのコントロールを使用して、3D画像を回転、回転、ズームし、任意の時点で静止画像を保存します。メニューのキャプチャオプションを使用します。

画面上の画像ボックスのサイズによって、生成される画像のピクセル寸法が決まるため、高解像度の画像が必要な場合は、右下隅をドラッグしてボックスを大きくします。360度回転して表示記録を選択して、回転する3Dムービーを作成します。最後に、利用可能ないくつかの形式のいずれかでファイルを保存し、無料のオープンソースメディアプレーヤーVLCを使用して3Dを表示します。

血管構造の再構築は、ゼブラフィッシュの発達について包括的で視覚的に興味深い視点を提供します。ここに示されているのは、消化後6日間のゼブラフィッシュ胚の血管構造を数角度から示したもので、内皮細胞でEGFPを発現したものが単色の緑色または白色です。信号強度を評価するのは難しい場合がありますが、擬似カラーリングはルックアップテーブルから画像強度を提供し、重なり合う構造の奥行き知覚を向上させます。

例えば、この図は、受精後6日間のゼブラフィッシュの発達後の血管系の疑似カラー3D画像を示しています。この技術により、脊椎動物の脳におけるアミロイドベータの血管への影響を調査することができました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚の血管網を可視化する方法を十分に理解できるはずです。これにより、血管新生を研究するための経済的でアクセス可能なシステムが提供されます。