レンチウイルスの生産

この手順は、レンチウイルス、プラスミド、およびウイルスパッケージングベクターで2 9 3 T細胞をトランスセクトすることから始まり、ウイルス上清は少なくとも48時間のインキュベーション期間後に回収されます。スナットは、超遠心分離後に超遠心分離機で濃縮するためにろ過されます。ウイルスペレットをPBSで再懸濁してウイルス力価を取得し、最初に濃縮ウイルスを完全な培地で希釈し、次に段階希釈を行って細胞にレンチウイルスを感染させます。

こんにちは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校糖尿病センターのマイケル・マクマナス研究室のシェイン・ウォンです。私はマイケル・マクマナスです。今日は、レンチウイルスの製造手順をご紹介します。

この手順を実験室で使用して、RNA干渉用のレンチウイルスを作成します。それでは始めましょう。このプロトコールを開始するには、2 9 3 T細胞をトランスフェクションするためのDNAを調製します。

まず、30マイクロリットルのフジシックスを600マイクロリットルの無血清培地と混合することにより、1.5ミリリットルのチューブ内でFU遺伝子6トランスフェクション試薬を希釈します。Fujiがチューブの側面に触れないように注意して、チューブを培地インキュベート室温に5分間送り込みます。次に、チューブのキャップに、4マイクログラムのレンチウイルスプラスミドを1.33マイクログラムと混合します。

各第3世代のウイルスパッケージングベクター。レンチウイルスプラスミドにはDNAが含まれています。ウイルスは感染するすべての細胞のゲノムに挿入されますが、パッケージングベクターには、レンズ豆ウイルスを蓋を閉めてチューブを数回反転させて混合するために必要な他のすべてのタンパク質の遺伝子が含まれています。

DNAとトランスフェクション試薬を室温で15〜20分間インキュベートします。今、それはあなたが準備したDNAで2 9 3細胞をトランスフェクションする時間ですあなたが準備したDNAは、あなたが24時間前にメッキし、組織培養フードで50〜70%coの流暢さに達した細胞を使用し、準備したDNAのすべてを2 9 3プレートにピペットでピペットし、プレートを前後に傾けて穏やかに混合します。 細胞をインキュベーターに戻し、収穫前にウイルス産生を48〜96時間継続させます。インキュベーション中、2 9 3細胞は、ゲノムに目的のDNAのRNAコピーを含むレンチウイルスを産生します。

今度はウイルスを収集する時です。インキュベーターから細胞を取り出します。組織培養フードには、0.4ミクロンまたは5ミクロンのシリンジフィルター、使い捨ての10ミリリットルシリンジ、UltraClear Beckman遠心分離チューブが入っています。

使い捨て注射器を使用して、ウイルスが含まれている上清を取り除きます。0.45ミクロンのシリンジフィルターをチップに取り付け、ウイルスをUltraClear Beckman遠心チューブにろ過します。フィルターは、ウイルスのみを許可し、細胞は通過させず、廃棄する前に、すべてのウイルス産生細胞をインキュベートします。

培養プレート、シリンジ、フィルターを10%漂白剤で45分間。ウイルスを採取してろ過したので、まずは超遠心分離でウイルスを濃縮します。無血清DMEMを使用して、すべてのウイルス含有チューブを互いに0.2グラム以内にバランスを取ります。

次に、バランス型遠心分離管をSW 41 TIまたはSW 28ローターバケットにロードします。ローターバケットを密閉して閉じ、ローターに引っ掛けます。次に、ローターを超遠心分離機の中に入れます。

SW 41 TIローターで25, 000 RPM、またはSW 28ローターで24, 000 RPMで摂氏4度で約90分間ウイルスを回転させます。遠心分離後、組織培養フードに戻り、チューブを反転させて、10%漂白剤を含む容器にSNATを注ぎます。キムワイプを使用してペレットの周りの余分な液体を吸収し、ペレットを再懸濁する準備ができるまで、便利なラックでチューブを5分以内に反転させます。

ウイルスペレットを再懸濁するには、フィルターチップを使用して、滅菌済みのろ過済みPBSを100マイクロリットルのチューブに加えます。その後、ピペットで約20回上下します。ウイルスを4度で一晩放置して、再懸濁を完了させます。

ウイルス調製物は、4度で約1週間、マイナス80度で最大1年間保存できます。廃棄する前に、すべての空のチューブを10%漂白剤で処理することを忘れないでください。ウイルス調製物を1週間以上使用する場合は、冷蔵庫で保管します。

将来の実験のために5〜20マイクロリットルの最小アリコートを作成し、滴定凍結用に3〜5マイクロリットルの1アリコートを作成し、アリコートを約マイナス80で保存します。次のステップは、ウイルス力価を決定することです。レンチウイルスプラスミドに蛍光レポーター遺伝子が含まれている場合、感染細胞は蛍光を発し、フローサイトメトリーを使用してウイルス力価を決定できます。

まず、3マイクロリットルの濃縮ウイルスをウェル内の1.5ミリリットルの完全な培地に希釈します(1〜6)。96ウェルプレートの1列。100マイクロリットルの完全ウェルで6つのウェルすべてに対して以下の段階希釈を行い、最初のウェルにウイルスを含まない100マイクロリットルの培地 DM.To 加えます。

これがあなたの汚れていないコントロールです。2番目に、3番目に希釈したウイルス100マイクロリットルをよく加えます。よく2番目の井戸から4番目の井戸に100マイクロリットルの混合物を加えます。

よく3番目の井戸から5番目の井戸に100マイクロリットルを追加します。よく4番目の井戸からそして6番目の井戸に100マイクロリットルを追加します。よく5番目から100マイクロリットルを追加します。

最終的に6番目の井戸から100マイクロリットルを取り出し、廃棄して漂白すると、DMEMですべての井戸の総量が200マイクロリットルになります。希釈するたびに、ウイルス濃度は半分に減少します。これらは推奨される希釈にすぎず、ほとんどの濃縮ウイルスの力価測定にうまく機能するはずです。

ウイルスの力価が低い場合や濃縮されていない場合は、希釈液を調整する必要があるかもしれません。未使用の希釈ウイルスは、バイオハザード廃棄物容器に廃棄する前に、10%漂白剤で45分間処理します。約15, 000の健康な2 9 3 T細胞を6つのウェルのそれぞれに活発に分裂させます。

1つの96ウェルプレートを使用して、16種類のウイルス調製物を力価で測定し、ウェルを200マイクロリットルまで補充し、細胞をインキュベーターに戻し、感染を少なくとも48時間進行させることができます。インキュベーション後、フローサイトメーターを使用して細胞蛍光を分析します。ウェルあたりの蛍光細胞の割合を使用して、添加されたウイルスのミリリットルあたりの感染性ウイルス粒子の力価または数を決定できます。

フローを解釈するときは、次の式を使用してミリリットルあたりの感染単位の数を計算します。サイトメーターの結果。正確な力価計算を達成できるのは、感染した細胞が細胞ごとに1つ以上のウイルス統合を受けていないときだけであることに注意してください。

これを確実にするために、感染率が15%未満の細胞を計算に使用してください。感染率が高い細胞は、細胞ごとに複数のウイルス統合を受けている可能性があります。ステップ2で提案した希釈により、この感染範囲内でいくつかのサンプルが得られるはずです。

理想的には、いくつかのサンプルを使用して滴定プロットを生成し、そこから最終的な力価を計算できます。適合した線形線から計算された式を使用してウイルス力価を計算できますが、必要に応じて単一のサンプルを使用して力価を計算できます。力価は、非濃縮ウイルスの場合は1ミリリットルあたり10〜7番目の形質導入単位、濃縮ウイルスの場合は1ミリリットルあたり10〜8番目の形質導入単位×1です。

この手順を行う際にレンチウイルスを生成する方法を示しました。すべてのバイオセーフティ規制を遵守し、廃棄物を適切に処理することが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。