Name: レンチウイルスの生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶレンチウイルス生産法。ヒト293T細胞へのトランスフェクション、ウイルス上清の回収と濃縮、蛍光発現によるタイター測定の手順を解説。遺伝子導入研究に有用な実験プロトコルです。

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サンドラー喘息基礎研究センター（SABRE） サンドラー財団

パート1：レンチウイルスを生成するためにHEK 293細胞のトランスフェクション * 24時間50から70パーセント翌日のコンフルエントのため10 cmディッシュにトランスフェクション、プレート2.5 × 10 6個の細胞の前に。 <ol><li>一つ後のウイルスを下すために、単一の細胞をトランスフェクトするとなるとDNAを調製してこのプロトコルを開始します。最初に、FuGENE 6トランスフェクション試薬ロシュ、細胞がDNAを取るように脂質の試薬を希釈する。 1.5 mlチューブに、ピペット30μlのFuGENE 6トランス600ulの無血清培地に（SFDMEM）。それは媒体に配信されるようにトランスフェは、チューブの側面に接触させてように注意してください。このトランスフェと5分間室温でSFDMEMミックスとインキュベートしてみましょう。 </li><li>チューブのキャップでは、それぞれの第3世代ウイルスパッケージングベクトル（PMDL、pRSVとpVSV - G）は、4μgのレンチウイルスプラスミド4μgのを混ぜる。レンチウイルスプラスミドは、パッケージングベクターがレンチウイルスを作るために必要なすべての他のタンパク質の遺伝子を含んでいる間、ウイルスは、それが感染するすべての細胞のゲノムに挿入するDNAが含まれています。 </li><li>チューブを反転させて蓋をし、混合数回を閉じます。 </li><li>室温で15-20分インキュベートする。 </li><li> 293プレートへのチューブのピペット全体の内容。前後に傾斜板で静かに混和。 </li><li>インキュベーターにセルを戻すと、ウイルス産生が収穫前48〜96時間継続することができます。 </li><li>インキュベーションの間、293細胞は、レンチウイルスコンストラクトのRNAのコピーを作成し、レンチウイルスプラスミドから目的のDNAを転写する。彼らはまた、ウイルス蛋白質へのパッケージングベクター中の遺伝子を転写し、翻訳する。これらのタンパク質は、ウイルスが転写するを逆転させ、それが感染するすべての細胞のゲノムに挿入するあなたのレンチウイルスコンストラクトのRNAのバージョンを含むウイルスを作るに進んでください。 </li></ol>第2部：レンチウイルス収穫<ol><li>潜伏期間の後、インキュベーターから細胞を取り出し、現在ウイルスを含む上清を除去するために使い捨て、10mlのシリンジを使用してください。上清10mlを約あるでしょう。 </li><li>先端に0.45μMシリンジフィルターを取り付け、ベックマンの超遠心管にウイルスをフィルタリングする。フィルタはウイルスではなく、細胞が通過することができます。 </li><li>廃棄する前に、すべてのウイルス産生細胞、培養プレート、45分間10％の漂白剤のシリンジとフィルターをインキュベートする。 </li></ol>パート3：超遠心法を経由してレンチウイルス濃度<ol><li> SW - 41TiまたはSW - 28ローターバケットに遠心管をロードする。 </li><li>すべてのウイルスを含むチューブに0.2グラム内のバランスをとるために無血清DMEMを使用してください。 </li><li>超遠心機内部のローターを配置する前に、ローターバケットをシャットダウンして、ローターの上にそれらをフック封印</li><li> 4℃で超遠心機で90分間ウイルスをスピン· SW - 41Tiローターで25000回転またはSW - 28ローターで24000 rpmでC。 </li><li>組織培養フードの中で、10％の漂白剤を入れた容器に上清を注ぐために逆さにチューブを反転させる。 </li><li>ペレットの周りに余分な液体を吸収し、5分を超えないために便利なラックにチューブを反転させるためにキムワイプを使用してください。 </li><li>ウイルスのペレットを再度中断するには、約20回上下にピペッティングして、チューブに100μLの滅菌PBSを追加するには、フィルターチップを使用。 </li><li>再懸濁完了する℃で一晩4℃でウイルスを残す。一つは、約1週間と1年まで-80℃で4℃でウイルスプレップを保存することができます。廃棄するまでに10％漂白剤ですべての空のチューブを扱うことをお忘れなく。 </li><li>いずれかの1週間よりも長くウイルスprepを使用しようとする場合、最小限の将来の実験のための5 -20μlののアリコートと滴定のための5μlの3の1アリコートを行います。マイナス80℃アリコートを凍結して保存する。 </li></ol>パート4：フローサイトメトリーを用いてレンチウイルス滴定<ol><li>次のステップは、フローサイトメトリーにより、ウイルス力価を決定することです。このメソッドは、レンチウイルスプラスミドは、蛍光レポーター遺伝子が含まれている場合に動作します。アイデアは、ウイルスが細胞に感染した場合、それはその細胞のゲノムにレンチウイルスプラスミドDNAを導入することです。感染細胞は、転写と翻訳が含まれている遺伝子をレンチウイルスプラスミドにし、蛍光レポーター遺伝子が含まれていると、感染細胞は蛍光を発するでしょう。蛍光のレベルは、ウイルスの効力、または力価を、表します。 </li><li>滴定する各ウイルス株については、完全なメディアを1.5 ml（DMEM、ペン連鎖球菌、グルタミン、FBS）に濃縮されたウイルスの3μlを希釈する。 </li><li> 96ウェルプレートの1行目の井戸1-6に、以下の連続希釈を行います：全6ウェルに完全DMEM培地を100μlを加える。ウェルを100μlを加えるだけでなく秒に、（これは未染色のコントロールです）がないウイルスとメディアの100μLを追加する第三者に、希釈したウイルス液100μlを（希釈ウイルスと同等の最高1ミリリットルである）最初に追加するによく秒からミックス、よくよく第五に、よく3日から100 mlを加えるだけでなく第四井戸から、目と6番目に100μLを加えるも5日から100μlを加える4位に。最後に第六井戸から100ulを取り出して、漂白剤で捨てる。各ウェルは、その前のに比べてウイルスの半分のボリュームを持っている場所連続希釈を行った。 </li><li> 200μlのためにすべてのウェルの総量をもたらす。これらが最も集中してウイルスを力価測定のために働く必要は推奨希釈率、であることに注意してください。ウイルスは、力価の低い場合、または未濃縮場合、1つは、希釈を調整する必要があります。 </li><li>バイオハザード廃棄物容器に廃棄する前に45分間、10％漂白剤で使用されていない希釈したウイルスを扱う。 </li><li> 6ウェルの各々に〜15,000健全な、活発に分裂した293細胞を追加。シングル96ウェルプレートは、16のウイルスプレップを力価に使用することができます。 </li><li> 5％のCOと37度のインキュベーターにセルを返す2、感染が少なくとも48時間続行することができます。 </li><li>インキュベーション後、細胞をフローサイトメーターで（我々の場合の蛍光で）レポーターの発現を分析している。ウイルス粒子は、ウェルあたりの蛍光細胞の割合によって定量される。 </li></ol>次の式でmlあたり感染単位数を計算します。 <div style="text-align:center;"> （＃感染Xのレポーター陽性細胞の日にウェルあたりの細胞の）X 1000 ______________________________________________________ ベクトルのmlのウェルに添加 </div>パート5：代表的な結果： 48時間のインキュベーション期間の後のトランスフェクションした後、293細胞のプレートは、蛍光灯約90％になっているはず。蛍光細胞の割合が高いウイルス産生細胞の割合が高いの指標です。 再懸濁するときに遠心分離した後、ウイル​​スペレットはほとんど見えないです。ペレットは透明で非常に小さいため、これは正常です。 細胞は細胞ごとに1つしかウイルスの統合を受けている（蛍光灯）に感染したときに一つだけ正確な力価の計算を達成することができるフローサイトメーターの結果の解釈、注意してください。これが事実であることを保証するために、計算のための&lt;15％の感染率を持つ細胞を使用してください。高い感染率を有する細胞は、おそらく、セルごとに複数のウイルスintegrantsを受けている。手順2で提案された希釈液は、感染症のこの範囲内でいくつかのサンプルを生成する必要があります。理想的には、最後の力価を計算することができますが、必要に応じて、単一のサンプルを用いて力価を計算できるから滴定プロット（直線）を生成するためにいくつかのサンプルを使用してください。一つは、1.0 × 10 7 TU非濃縮したウイルスのための/ mlおよび1.0 × 10 8濃縮したウイルスのためのTU / mlの力価が期待できます。

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM、HEK 293T細胞、ペニシリン-ストレプトマイシン、グルタミン、リン酸緩衝生理食塩水、FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 トランスフェクション試薬、pSico mCherry、pMDL、pRSV、pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm 細胞培養ディッシュ、96ウェル細胞培養プレート</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルター付きピペットチップ</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorfチューブ、シリンジ、シリンジフィルター (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心管</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 組織培養インキュベーター</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41T.I ローター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 超遠心機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

レンチウイルスの生産

Lentivirus Production

RNA干渉（RNAi）は、生きた細胞内の遺伝子サイレンシングのシステムです。 RNAi実験では、短い干渉RNA（siRNA）のシーケンスの相同遺伝子は、転写後の状態で沈黙している。ショートヘアピンRNA、siRNAに前駆体は、種々の細胞型におけるRNAiを可能に、レンチウイルスを用いて表現することができる。このようなヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスは、感染の両方で割ると、非分裂細胞に対応しています。我々は、レンチウイルスをパッケージ化する手順を説明します。パッケージングは​​、DNAベクターから有能なウイルスの準備を指します。レンチウイルスベクターの生産システムは、天然のウイルスゲノムは、個々のヘルパープラスミドコンストラクトに分割された&quot;分割&quot;システムに基づいています。 4つの別々のベクターに異なるウイルスの要素のこの分裂は、レンチウイルスゲノムの不定組換えによる複製が可能なウイルスを作成することのリスクを減少させる。ここでは、関心と3種類のパッケージでベクトル（P - VSVG、pRSV、PMDL）のshRNAを含むベクターを、一過性のヒト293細胞にトランスフェクトされています。少なくとも48時間のインキュベーション期間の後、ウイル​​スを含む上清を回収し、濃縮する。最後に、ウイルスの力価は、レポーター（蛍光灯）フローサイトメーターによる式によって決定されます。

レンチウイルスを作成するには、DNAベクターは、ヒト293細胞にトランスフェクトされています。収穫後、上清を濃縮し、ウイルス力価は、フローサイトメーターと蛍光式によって決定されます。

RNA干渉（RNAi）は、生細胞内における遺伝子サイレンシングのシステムである。RNAiでは、短鎖干渉RNA（siRNA）と配列が相同な遺伝子が…

この手順は、293T細胞にレンチウイルス、プラスミド、およびウイルスパッケージングベクターをトランスフェクションすることから始まり、少なくとも48時間の培養期間後にウイルス上清を回収します。上清はろ過し、超遠心機を用いて濃縮します。ウイルスペレットをPBSで再懸濁してウイルスタイターを求め、まず濃縮ウイルスを完全培地で希釈し、次に段階希釈を行い、レンチウイルスを用いて細胞に感染させます。こんにちは。私はカリフォルニア大学サンフランシスコ校糖尿病センターのMichael McManus研究室のShein Wongです。Michael McManusです。本日は、レンチウイルスの作製手順について解説します。本手順では、RNA干渉のためのレンチウイルスを研究室で作製します。それでは、開始しましょう。まず、293T細胞にトランスフェクションするためのDNAを準備します。まず、1.5 mLチューブ内で、30 µLのFuji sixと600 µLの無血清培地を混合し、FU gene sixトランスフェクション試薬を希釈します。Fuji sixを培地に加える際、チューブの壁面に触れないように注意し、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブのキャップ内で、4 µgのレンチウイルスプラスミドを1.33 µgと混合します。各第3世代ウイルスパッケージングベクター。レンチウイルスプラスミドがDNAを含有しています。ウイルスは感染したすべての細胞のゲノムに挿入され、一方でパッケージングベクターはレンチウイルス作製に必要なその他のすべてのタンパク質の遺伝子を含んでいます。蓋を閉め、チューブを数回反転させて混ぜ合わせます。DNAとトランスフェクション試薬を室温で15～20分間インキュベートします。次に、準備したDNAをHEK 293細胞にトランスフェクションします。24時間前に播種し、コンフルエンシーが50～70%に達した細胞を、組織培養フード内で使用してください。準備したDNAをすべて293細胞のプレートにピペッティングし、プレートを前後にゆっくりと傾けて優しく混ぜ合わせます。細胞をインキュベーターに戻し、回収まで48～96時間、ウイルス産生を継続させます。インキュベーションの間、293細胞は、目的のDNAのRNAコピーをゲノムに含むレンチウイルスを産生します。次に、ウイルスを回収します。インキュベーターから細胞を取り出します。組織培養フード内に、0.4または5 µmのシリンジフィルター、使い捨ての10 mLシリンジ、およびBeckman社のUltraClear遠心チューブを用意しておきます。使い捨てシリンジを使用して、ウイルスを含む上清を除去します。先端に0.45 micronのシリンジフィルターを取り付け、ウイルスをUltraClear Beckman遠心チューブにろ過します。このフィルターにより、細胞を除去してウイルスのみを通過させることができます。ろ過後、ウイルス産生細胞はすべて廃棄してください。培養プレート、シリンジ、およびフィルターを10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に45分間浸します。ウイルスの回収およびろ過が完了したので、まず超遠心分離によってウイルスを濃縮します。無血清DMEMを用いて、ウイルス含有チューブすべての重量を0.2g以内の誤差に調整し、バランスを合わせます。次に、バランスを調整した遠心管をSW 41 TIまたはSW 28ローターバケットに入れます。ローターバケットを密閉し、ローターに固定します。その後、ローターを超遠心機の中に設置します。SW 41 TIローターを用いて25,000 RPM、またはSW 28ローターを用いて24,000 RPMで、4°Cにて約90分間ウイルスを遠心分離します。遠心分離後、組織培養フードに戻し、チューブを反転させてSNATを10%漂白剤の入った容器に注ぎ入れます。キムワイプを使用してペレット周囲の余分な液体を吸収し、ペレットを再懸濁する準備が整うまで、チューブを便利なラックに反転させた状態で5分以内に保持します。ウイルスのペレットを再懸濁させるため、フィルターチップを用いて、滅菌済みでろ過済みのPBS 100 microlitersをチューブに加えます。その後、ピペッティングを20回ほど繰り返します。完全に再懸濁させるため、ウイルスを4 degreesで一晩静置します。ウイルス調製液は、4°Cで約1週間、-80°Cで最大1年間保存可能です。空になったチューブはすべて、廃棄前に10%漂白剤で処理してください。1週間を超えてウイルス調製液を使用する場合は、冷蔵庫で保存してください。今後の実験用に5〜20 µLの小分け分注液を数本と、タイトレーション用に3〜5 µLの分注液を1本作成し、これらの分注液を約-80°Cで保存します。次のステップはウイルスタイターの決定です。レンチウイルスプラスミドに蛍光レポーター遺伝子を組み込んでいる場合は、感染細胞が蛍光を発するため、フローサイトメトリーを用いてウイルスタイターを決定できます。まず、96ウェルプレートの1行にあるウェル1から6に、濃縮ウイルス3 µLを完全培地1.5 mLで希釈します。100 µLの完全DMを用いて、これら6つのすべてのウェルで以下の連続希釈を行います。最初のウェルには、ウイルスを含まない培地100 µLを加えます。これは未染色のコントロールです。2番目のウェルに希釈したウイルスを100 µL加え、3番目のウェルにも同様に加えます。次に、2番目のウェルの混合液を100 µL、4番目のウェルに加えます。3番目のウェルから5番目のウェルへ100 µLを加えます。4番目のウェルから6番目のウェルへ100 µLを加えます。5番目のウェルから100 µLを加えます。最後に、6番目のウェルから100 µLを取り出して廃棄し、漂白剤で処理します。その後、すべてのウェルの全量をDMEMで200 µLに調整します。希釈を繰り返すごとに、ウイルスの濃度は半分になります。なお、これらは推奨される希釈倍率であり、ほとんどの高濃度ウイルスのタイタリングにおいて良好に機能します。ウイルスのタイターが低い場合や濃縮されていない場合は、希釈倍率を調整する必要があるかもしれません。未使用の希釈ウイルスは、バイオハザード廃棄物容器に捨てる前に、10%次亜塩素酸ナトリウム液で45分間処理してください。6つのウェルのそれぞれに、健康で活発に分裂している293T細胞を約15,000個ずつ加えてください。単一の96ウェルプレートを使用して、16種類のウイルス調製液のタイターを測定できます。各ウェルの液量を200 microlitersまで補充し、細胞をインキュベーターに戻して、少なくとも48時間感染を進行させます。インキュベーション後、フローサイトメーターを用いて細胞の蛍光を解析します。ウェルあたりの蛍光細胞の割合から、タイターまたは添加したウイルス1 milliliterあたりの感染性ウイルス粒子数を決定できます。フローサイトメーターの結果を解析する際は、以下の式を用いて1 mLあたりの感染単位数を算出します。なお、正確なタイター算出が可能なのは、感染細胞1個あたりにウイルスが1回以下しか組み込まれていない場合に限られます。これを確実にするため、計算には感染率が15%未満の細胞を使用してください。感染率が高い細胞は、1細胞あたりに複数のウイルスが組み込まれている可能性が高いためです。ステップ2で推奨される希釈を行えば、この感染率の範囲内に収まるサンプルがいくつか得られるはずです。理想的には、いくつかのサンプルを用いてタイトレーションプロットを作成し、そこから最終的なタイターを算出してください。フィッティングさせた直線から得られる計算式を用いてウイルスタイターを算出できますが、必要に応じて単一のサンプルからタイターを算出することも可能です。非濃縮ウイルスのタイターは1×10⁷ transducing units/mL、濃縮ウイルスのタイターは1×10⁸ transducing units/mLになると予想されます。本手順におけるレンチウイルスの作製方法について説明しました。すべてのバイオセーフティ規制を遵守し、廃棄物を適切に処理することが重要です。以上で終了となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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