マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

バイオフラックスシステムは、制御された純粋な流量で生細胞アッセイを実行するための自動化された装置およびマイクロ流体デバイスです。このシステムは、ウェルプレートのマイクロ流体技術を使用して、ミクロンスケールのフローセルデバイスをSBS標準ウェルプレートに統合します。BioFlexは、血小板の接着および凝集研究をハイスループットで行い、血液量を減らすために使用できます。

蛍光色素で標識した全血をウェルに加え、チャネルを通って流れます。制御された純粋な流量の下で、高分解能の顕微鏡データが生成され、薬物化合物やその他のさまざまなパラメーターの存在下での血小板の接着と凝集を定量化します。こんにちは、Flexion BiosciencesのRD研究室のMike Schwartzです。

本日は、血小板接着アッセイでマイクロ流体フローセルを使用する手順をご紹介します。私たちの研究室では、このプロトコルをさまざまな血管生物学アッセイに使用しています。それでは始めましょう。

牛肉は、フローセル実験を実行する前に、バイオフラックスプレートのマイクロ流体チャネルを、この実験で使用するコラーゲン1のタンパク質コーティングで調製する必要があります。バイオフラックスプレートの24の実験チャネルのそれぞれは、このプレートの入口ウェルと出口ウェルに接続されています。入口の井戸はチャネルを供給する左側の井戸であり、出口の井戸は右側にあり、コラーゲン1のストックを1ミリリットルあたり200マイクログラムの濃度に希釈します。

0.02モル酢酸では、使用するチャネルごとに20マイクロリットルが必要になります。この実験には11チャンネルが必要なので、200マイクロリットルのコラーゲンコーティングを作ります。1つのチャンネルはコーティングされていないままで、マイクロピペットチップで穏やかな反復によって混合されます。

マイクロピペットを使用して、ウェルの内側パンチに液体を分注することにより、各チャネルに20マイクロリットルのコーティングを追加します。ここに示すように、目的のマイクロ流体チャネルに黄色の色素を供給すると、血小板の接着と凝集のネガティブコントロールとしてコラーゲンを含まない1つのチャネルが含まれます。コラーゲンコーティングをすべてのチャネルに追加した後、インターフェースをプレートに取り付けます。

バイオフラックス1000インターフェースを使用している場合は、両方のラッチをステージに固定できます。Bio flux 200インターフェースの人差し指を使用している場合は、4本のネジを締めます。そして、それらがすべて設定されたら、トルクドライバーを使用して完全に締めます。

トルクドライバーが最大に達するとクリックします。バイオフラックスソフトウェアの手動モードを使用して、出口から2Dセンチメートル二乗で目的のチャネルに灌流を適用します。よく顕微鏡で低倍率対物レンズを使用して入口をよく見つけ、液体で満たされている反対側の内側パンチを観察します。

あなたは最初に液体の小さなbeを見て、数分後にゆっくりと内側のパンチを満たし、入口の内側のパンチが満たされたら、ソフトウェアでストップを押してすべてのチャネルで溢れを停止します。プレートを室温で1時間インキュベートします。この潜伏期間中は、1時間の潜伏期間の終わりに全血の調製を開始できます。

血液が準備されたら、インターフェースを取り外し、1ミリリットルのPBSとカルシウムおよびマグネシウムイオンを出口に追加します。さて、出口から2つの食事の平方センチメートルでよく溢れ始め、10分間溢れ続けます。10分後、増殖を停止します インターフェースを取り外した後、インレットウェルとアウトレットウェルの両方から余分なPBSを取り除きます。

インナーパンチを満たしている液体は絶対に取り除かないでください。チャネルをブロックするには、各出口に1ミリリットルのブロッキング溶液を追加します。よく使用するには、出口からよく2つの食事センチメートルの二乗で灌流し、10分間灌流を続けます。

10分後に増殖を停止し、インターフェースを取り外します。これでチャネルの準備ができ、プレートがコラーゲンでコーティングされている間、一日中使用できます。1時間のインキュベーション中に、空腹時患者からの新鮮なヒト血液を調製し、イメージングしてプレートに流す必要があります。

血液はクエン酸ナトリウム、抗凝固剤に引き込まれ、収集から3時間以内に使用する必要があります。.まず、DMSO中のカルシウムMの4ミリモルストックを、1体積あたり1〜1000容量の希釈で血液に加えます。4マイクロモルのカルシウムを得るためには、穏やかな反転によって混合されます。

次に、1ミリリットルのカルシウムam標識血液を10本の1ポイント5ミリリットルのマイクロチューブに分配します。GP two B three a阻害剤抗体を各チューブに所望の希釈率で添加します。無抗体陰性対照と無関係の抗体陽性対照を穏やか反転で混合したものを必ず含めてください。

チューブを室温で1時間インキュベートし、10分ごとに穏やかに反転させて混合してから、フローセル実験を実行します。コラーゲンのバイオフラックス制御モジュールでは、自動化されたプロトコルを設定する必要があります。1。出口から10分間、10、9センチ四方で血液を流すためのプロトコルを設定します。

BioFlex 1000ワークステーションを使用して、フィッツ波長での所望のステージ位置取得やタイムラプス設定など、データ収集パラメータを設定する必要があります。このプロトコルの一般的な画像取得計画は、チャネルごとに1つの視野で構成され、合計10分間にわたって30秒ごとに10倍対物レンズを使用してキャプチャされます。追加の視野や代替のタイムラプス設定も可能です。

自動プロトコルとデータ取得パラメータを設定したら、BioFlexプレートに戻り、インナーパンチを除くチャネルの両側の液体を取り除きます。迅速に作業するように注意しながら、各条件の500マイクロリットルの血液を各チャネルの出力ウェルに入れます。出力ウェルは、表示ゾーンへの最短経路であり、コラーゲンコーティングに対する血液のより迅速な反応を提供するため、血液の送達に使用されていることに注意してください。

さらに、抗体を含まない対照血液を、コラーゲンでコーティングされたチャネルとブロックされたばかりのチャネルに入れます。プレートをBioFlex 1000ワークステーション顕微鏡に置き、インターフェースをクランプします。ステージ リストのキャリブレーションを実行するには、原点として定義されている最初のキャリブレーション ポイントを特定します。

次に、2番目のキャリブレーションポイントを見つけてマークします。このキャリブレーションを適切なステージリストに適用します。これにより、プレート上のすべての表示位置が自動的に検出されます。

BioFlexモンタージュソフトウェアで、露光時間やゲインなどの画像キャプチャパラメータに適合する血液セットを含むチャネルの1つにステージを移動します。目的のボタンをクリックして、適切なワークフローを起動します。これにより、フロープロトコルと画像取得が同時に開始されます。

実験の最後に、BIOFLU 1000ワークステーションからプレートを取り外し、施設のガイドラインに従って廃棄してください。バイオフラックスシステムのコラーゲンコーティングされたマイクロ流体チャネルを使用。侵攻性の血栓形成は、未治療の対照血液サンプルで経時的に観察されます。

対照的に、コーティングされていないチャネルでは血栓形成は観察されません。最近行われたある実験では、制御条件下での凝集体の平均サイズは2000マイクロメートルの二乗でした。GP two B three Aは、抗GB two B three a抗体と1時間前にインキュベートした後、ここに示すようにコラーゲンへの接着によって活性化されると、血小板血小板相互作用と凝集安定化の強力なメディエーターであり、血栓のサイズの減少と血栓形成の頻度の減少が観察されます。

用量依存的な反応は、典型的には10、9センチメートルの二乗で観察でき、この特定の阻害剤のIC 50値は17ナノモルであった。このドナーの最大阻害は、抗体なしのコントロールと比較した場合、10 dine センチメートル二乗で 11% でした。48ウェルの高せん断板は、最大200 Dパーセントセンチメートルの二乗または5、000逆秒の全血実験にも利用できます。

マイクロ流体流路を使用して、生理学的に関連性のある血管生物学実験を行う方法を紹介しました。このプロトコールを行う際には、コラーゲンを正しいバッファーで希釈することを忘れないようにすることが重要です。気泡の混入を避けるために、常に正しいピペッティング技術を使用し、常にラボのバイオセーフティ規制に従ってください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。