Name: マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶマイクロ流体フローセルを用いた血小板粘着と凝集の測定法。生理的なせん断流条件下で血小板挙動を評価し、創薬研究や血管生物学への応用が可能です。

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パート1：BioFlux板のマイクロ流体チャネルの準備。 <ol><li>フローセルの実験を実行する前に、人は目的のタンパク質のコーティングとマイクロ流体チャネルを準備する必要があります。このケースでは、コラーゲンは私が使用されます。各チャネルは、よく入口と出口を持っています。このプレートの場合、入口は井戸チャネルと同様の右にあるコンセントに給電左です。 </li><li> 0.02M酢酸に200μg/mlの濃度にコラーゲンI（5mg/ml株式）コーティングを希釈する。一つは、使用される各チャネルの20μlのが必要になります。マイクロピペットチップで穏やかtriterationで混ぜる。 </li><li>使用するそれぞれのチャネルにコーティングの20μlを添加する。一つは、よくマイクロピペットを用いて関心のマイクロ流体チャネルを供給するコンセントの内側のパンチに、液体を分注する必要があります。気泡を導入しないように、ピペットから空気を押さないでください。ないコラーゲンのコントロール（接着および凝集のためのネガティブコントロール）のためのコラーゲンせずに1つのチャネルが含まれています。 </li><li>一度、それらがすべて設定されている、4本のネジを締めて、最初の指でプレートにインターフェイスを接続、完全に締め、トルクドライバーを使用してください。それが最大の気密性に達するとトルクドライバがクリックされます。 </li><li> BioFluxソフトウェアで手動モードを使用して、コンセントも2dyn/cm -から2で興味のあるチャンネルに灌流を適用する。ここで一つは液体で満たされている反対側の内側のパンチを監視しなければなりません。これには数分かかります。一つは、これは顕微鏡で低消費電力の目標を使用して（4X）と同様またはプレートを保持し、下から入口の井戸を調べることでその入口を見つけることが発生見ることができます。一つは、最初ゆっくりと内側のパンチを満たす液体の小さなビーズが表示されるはずです。インレット内部のパンチがいっぱいになると、ソフトウェアでストップを押して、一度に灌流を停止します。 </li><li> 1時間室温でインキュベートする。 </li><li>インタフェースを削除し、よく口に1mlのPBSを（プラスのCa 2 + / Mg 2 +を ）追加する。 2dyn/cm 2でよく口から血流を開始します。 10分間の灌流を続ける。血流を停止し、インタフェースを削除します。 </li><li>入口と出口の井戸の両方から過剰なPBSを削除する - インナーパンチをいっぱいに液体を削除することはありません。ブロッキング溶液（PBS中の0.5％（v / v）のBSAを（プラスのCa 2 + / Mg 2 +を ））を使用してチャネルをブロックします。使用するだけでなく、各コンセントにブロッキング溶液1 mlを添加し、2dyn/cm 2でよくコンセントから灌流。 10分間の灌流を続ける。血流を停止し、インタフェースを削除します。このステップまでの準備のチャンネルは一日を通して使うことができます。 </li><li>血液を追加する前に、内側のパンチ以外のチャネルの両側で液体を取り除く。 </li></ol>パート2。 GPIIb / IIIaの阻害抗体を持つ血液を準備する。 <ol><li>コラーゲンは、チャネルでインキュベートされていますが、一つは全血を準備する必要があります。一つは、人間の血液を処理するときに、彼/彼女の機関によって決定バイオセーフティ規制に従ってください。 </li><li>クエン酸ナトリウムの抗凝固剤に引き込ま新鮮なヒト血液を（絶食した患者から）コレクションの3時間以内にご使用ください。 </li><li>回答4μMカルセインを追加することにより、血液を準備します。 DMSO中のカルセインAMの4mmの株式を準備し、A / V 1 / 1000の希釈で血液に追加対穏やかに転倒混和します。 </li><li> 1.5mlのマイクロチューブ - カルセインの1mlを10に血液をラベル付け午前注します。希望の希釈（IgGの分子量は〜150kDaである）でそれぞれにGPIIb / IIIa阻害薬の抗体を追加。例の希釈系列は、1200nMから9nMすることであり、抗体のコントロールはと無関係な抗体のコントロールが含まれていません。 抑制のための優秀なポジティブコントロールが20ug/mlの濃度でレオプロ（アブシキシマブ、イーライリリー）となる。穏やかに転倒混和します。 </li><li> 1時間室温でインキュベートする。静かに転倒混和して10分おきに混ぜる。 </li></ol>パート3：BF1000ワークステーション上でフローセルの実験を実行する。 <ol><li>最初に、人はBioFluxの制御モジュールで自動化されたプロトコルを設定する必要があります。コラーゲンの場合私は、人はよく口から10分間10dyn/cm 2を実行するプロトコルを設定する必要があります。この時点で、一つでもBF1000ワークステーションを使用してデータ収集パラメータを設定する必要があります、チャネルの位置を含めて、FITC波長と時間経過の情報にキャプチャ。それは合計10分の期間にわたって、チャネルあたり10倍の目標を30秒ごとに使用してビューの3つのフィールドをキャプチャすることをお勧めします。 </li><li>素早く作業を、別々の準備のチャンネルに各条件の準備血の500ulを置きます。コラーゲンとだけブロックされているものでコーティングされているチャンネルには抗体のコントロールの血を置かない。 </li><li>プレート上のインターフェイスを置きます。 </li><li> BF1000ワークステーションの顕微鏡でプレートを置きます。インターフェイス上でクランプ。 </li><li>プレートの負荷調整を行います。また、よく血液を含むものにステージを移動する。 FTを設定するICの画像キャプチャのパラメータ（露光時間、ゲイン等...）。 </li><li> BioFluxモンタージュのソフトウェアでは、同時に流れと取得を開始するために取得を開始します。 </li><li> BF1000ワークステーションからプレートを外し、制度的なガイドラインに従ってプレートを処分。 </li></ol>パート4：代表的な結果。 ここではマイクロ流体チャネルにおける血小板粘着と凝集のためのプロトコルが発表された。血小板凝集阻害剤による治療は、anti-GPIIb/IIIaもプロトコルに含まれていた。 BioFluxシステムのコラーゲンコーティングされたマイクロ流体チャネルを使用して、1つは、未処理の対照の血液サンプルとコーティングされていないチャネル上なく血栓形成に時間をかけて積極的な血栓形成を期待してください。 one最近行った実験では、制御条件下で凝集体の平均サイズは2000μm2であった。 図1。 <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1">活性化GPIIb / IIIaとは、血小板-血小板相互作用および凝集安定化1の強力なメディエーターである。コラーゲンへの接着は、この応答2を引き出すためにGPIIb / IIIaとの複合体を活性化する。せん断暴露前に1時間anti-GPIIb/IIIaとのインキュベーション後、1つは血栓の大きさの減少だけでなく、血栓形成の頻度の減少を観察することが予想されます。用量依存性の応答は、通常10dyn/cm 2で観察することができます。 図2。 <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> この特定の阻害剤のIC 50値は10 DYN / cm 2で17nMであった。抗体の制御なしに比べて最大阻害は、（このドナーのための）10 DYN / cm 2で11％であった。 ここでメソッドが特定の細胞外マトリックスタンパク質と血小板凝集の特異的阻害剤を用いて提示された一方で、プロトコルは他のコーティング、他の細胞型と細胞接着アッセイのための他の阻害剤への拡張が可能です。このような実験の成功するための秘訣は、すべての試薬のためのマイクロ流体チャネル、正しい希釈剤内のすべての試薬の適切な希釈、および適切な培養条件における気泡の回避です。

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+complexity+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li>
<li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP%5BTitle%5D)+AND+%22VI.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li>
</ol>

寄稿者は、流出Biosciences社の従業員です。

ここでメソッドが特定の細胞外マトリックスタンパク質と血小板凝集の特異的阻害剤を用いて提示された一方で、プロトコルは他のコーティング、他の細胞型と細胞接着アッセイのための他の阻害剤への拡張が可能です。このような実験の成功するための秘訣は、すべての試薬のためのマイクロ流体チャネル、正しい希釈剤内のすべての試薬の適切な希釈、および適切な培養条件における気泡の回避です。

<table><tbody><tr><td>コラーゲン I, ウシ由来</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td>他のコラーゲン I の供給源も使用可能</td></tr><tr><td>PBS（Ca/Mg添加）</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-2930 Bottom of Form</td><td>VWRより入手</td></tr><tr><td>カルセイン AM</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td>BD社のカルセイン AM も使用可能</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 System</td><td>試薬</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>メーカーに問い合わせ</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux Plate</td><td>試薬</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>900013</td><td></td></tr><tr><td>anti-GPIIb/IIIa</td><td>試薬</td><td>Abcam</td><td>ab33407</td><td>代替番号は ab15021</td></tr><tr><td>ReoPro</td><td>試薬</td><td>Eli Lilly</td><td></td><td>処方箋のみ</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

血小板凝集、内皮下細胞外マトリックスが露出された血管損傷への応答として発生します。血小板接着カスケードには、せん断流の存在下で、従来の（静的）ウェルプレートアッセイでは考慮されていない要因を行われます。この記事の生理的せん断流れの条件をエミュレートするマイクロ流体ウェルプレートフォーマットを利用した血小板凝集アッセイに関するレポート。細胞外タンパク質、コラーゲンI、またはvon Willebrand因子は、空気ポンプでアクティブな灌流を用いたマイクロ流体チャネル内に堆積される。マトリックスタンパク質を緩衝液で洗浄し、血小板の相互作用のためのマイクロ流体チャネルを準備するためにブロックされます。蛍光色素で標識された全血は、血小板活性化および凝集を達成するために様々な流量でチャネルを介して灌流される。血小板凝集の阻害はIC50用量応答データを生成するためのフローセル実験に先立って追加することができます。

血小板接着カスケードには、せん断流の存在下で、従来の（静的）ウェルプレートアッセイでは考慮されていない要因を行われます。この記事の生理的せん断流れの条件をエミュレートするマイクロ流体ウェルプレートフォーマットを利用した血小板凝集アッセイに関するレポート。

血小板凝集は、血管内皮下にある細胞外マトリックスが露出した血管損傷に反応して起こります。血小板の接着は...

BioFluxシステムは、制御されたせん断流下で生細胞アッセイを実行するための自動装置およびマイクロ流体デバイスです。本システムはウェルプレートマイクロ流体技術を用いており、ミクロンスケールのフローセルデバイスをSBS規格のウェルプレートに統合しています。BioFlexを使用することで、少量の血液量でハイスループットな血小板粘着および凝集研究を行うことが可能です。蛍光染料で標識した全血をウェルに添加し、チャネル内に流します。制御されたせん断流の下で高解像度顕微鏡データを取得し、薬剤化合物やその他の変動パラメータが存在する場合における血小板の接着および凝集を定量化します。こんにちは、Flexion Biosciences社のRDラボのマイク・シュワルツです。本日は、血小板粘着アッセイにおけるマイクロ流体フローセルの使用手順について解説します。当研究室では、このプロトコルをさまざまな血管生物学アッセイに活用しています。それでは、始めていきましょう。フローセル実験を行う前に、BioFluxプレートのマイクロ流体チャネルを目的のタンパク質でコーティングして準備する必要があります。本実験ではcollagen oneを使用します。BioFluxプレートの24本の実験チャネルは、それぞれプレートの入口ウェルと出口ウェルに接続されています。入口ウェルはチャネルに液を供給する左側のウェルであり、出口ウェルは右側にあります。collagen oneストック溶液を200 µg/mLの濃度に希釈してください。0.02 M 酢酸において、使用するチャンネルごとに 20 µL が必要になります。本実験では 11 チャンネルを必要とするため、コラーゲンコーティング液を 200 µL 調製します。1 つのチャンネルはコーティングせず、マイクロピペットチップを用いて穏やかに反復混合します。マイクロピペットを用いて、各チャネルのウェル内側のパンチ部分にコーティング液を20 µLずつ分注します。黄色い染料で示すように、目的のマイクロ流体チャネルに液を供給します。この際、血小板の接着および凝集の陰性対照として、コラーゲンを含まないチャネルを1つ設けてください。すべての該当チャネルにコラーゲンコーティングを完了させた後、インターフェースをプレートに取り付けます。bio flux 1000インターフェースを使用している場合は、両方のラッチをステージにしっかりと固定してください。Bio flux 200インターフェースを使用している場合は、まず4本のネジを締めます。その後、すべてが配置されたことを確認し、トルクドライバーを使用して完全に締め付けてください。トルクドライバーは最大値に達するとクリック音が鳴ります。BioFluxソフトウェアのマニュアルモードを使用して、目的のチャネルに出口から2D per centimeter squaredの灌流を行います。顕微鏡の低倍率対物レンズを用いてインレットウェルを確認し、反対側のインナーパンチに液体が満たされるのを観察します。まず、数分後から少量の液体が内部パンチにゆっくりと満たされるのが確認できます。入口の内部パンチが満たされたら、ソフトウェアのストップボタンを押し、すべてのチャネルの注入を停止してください。プレートを室温で1時間インキュベートします。このインキュベーション期間中に、全血の調製を開始し、1時間のインキュベーション終了までに準備を完了させてください。血液の準備が完了したら、インターフェースを取り外し、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含むPBS 1 mLを流出孔（アウトレット）に加えます。流出孔ウェルから2 dyn/cm²で灌流を開始し、10分間継続します。10分後、灌流を停止します。インターフェースを取り除いた後、流入孔（インレット）と流出孔ウェルの両方から余分なPBSを除去します。インナーパンチを満たしている液体は決して除去しないでください。チャネルをブロックするには、各アウトレットウェルに1 mLのブロッキング溶液を加えます。使用するウェルを、2 µL/cm²の速度でアウトレットウェルから灌流させ、灌流を10分間継続します。10分後に灌流を停止し、インターフェースを取り除きます。これでチャネルの準備が完了し、プレートにコラーゲンをコーティングしている間、一日を通して使用することが可能です。1時間のインキュベーションの間に、空腹状態の被験者から採取した新鮮なヒト血を、イメージングおよびプレートへの注入用に準備します。血液はクエン酸ナトリウム抗凝固剤を用いて採取し、採取後3時間以内に使用してください。まず、DMSOに溶解した4 mMのカルシウムMストック溶液を、容量比1:1000の希釈率で血液に添加します。4 µMのカルシウム濃度とするため、緩やかに転倒混和して混ぜ合わせます。次に、カルシウムラベルした血液1 mLを1.5 mLマイクロチューブ10本に分注します。各チューブに、目的の希釈率でGP2B3阻害抗体を添加します。抗体なしの陰性対照と、無関係な抗体を用いた陽性対照を必ず含め、緩やかな転倒混和によって混合してください。フローセル実験を行う前に、チューブを室温で1時間インキュベートし、10分ごとに緩やかに転倒混和します。BioFluxコントロールモジュールで、コラーゲン用の自動プロトコルを設定する必要があります。1. 流出口から10分間、10 $\text{cm}^2$で血液を流すプロトコルを設定します。BioFlex 1000ワークステーションを使用して、目的のステージ位置、取得する波長、およびタイムラプス設定を含むデータ取得パラメータを設定します。本プロトコルの典型的な画像取得プランでは、10倍対物レンズを用い、チャンネルあたり1つの視野を30秒間隔で合計10分間にわたって撮影します。また、視野を追加したり、別のタイムラプス設定を適用したりすることも可能です。自動プロトコルとデータ取得パラメータの設定が完了したら、BioFlexプレートに戻り、内側のパンチ以外のチャネル両側の液体を除去します。迅速に作業し、各条件の血液500 µLを各チャネルの出力ウェルに入れます。血液をビューイングゾーンへ届ける最短経路であり、コラーゲンコーティングに対する血液のより即時的な反応を得られるため、出力ウェルを使用して血液を注入することに注意してください。さらに、抗体を含まないコントロール血液を、コラーゲンでコーティングしたチャネルと、ブロッキングのみを行ったチャネルにそれぞれ注入します。プレートをBioFlex 1000ワークステーション顕微鏡に設置し、インターフェースに固定します。原点として定義される最初のキャリブレーションポイントを特定し、ステージリストのキャリブレーションを行います。次に、2番目のキャリブレーションポイントを特定してマークします。このキャリブレーションを適切なステージリストに適用してください。これにより、プレート上のすべての観察位置を自動的に検出できるようになります。ステージを血液を含むチャネルのひとつに移動させ、BioFlex montageソフトウェアで露光時間やゲインなどの画像キャプチャパラメータを設定します。目的のボタンをクリックして、適切なワークフローを開始します。これにより、フロープロトコルと画像取得が同時に開始されます。実験の終了後、プレートをBIOFLU 1000ワークステーションから取り出し、施設のガイドラインに従って廃棄してください。BioFluxシステムのコラーゲンコーティングされたマイクロ流体チャネルを使用します。未処理の対照血液サンプルでは、時間の経過とともに激しい血栓形成が観察されます。対照的に、コーティングされていないチャネルでは血栓形成は観察されません。最近行われたある実験では、コントロール条件下での凝集体の平均サイズは2000 µm²でした。GP IIb3aは、コラーゲンへの接着によって活性化されると、血小板間の相互作用と凝集の安定化を強力に媒介します。ここに示すように、せん断曝露の1時間前に抗GP IIb3a抗体でインキュベートした後では、血栓サイズの減少および血栓形成頻度の減少が観察されます。通常、10 dyne cm⁻²において用量依存的な反応が観察され、この特定の阻害剤のIC₅₀値は17 nanomolarでした。抗体なしコントロールと比較したこのドナーの最大抑制率は、10 dyne cm⁻²で11%でした。また、最大200 dyne cm⁻²または5,000 s⁻¹までの全血実験に使用可能な48ウェル高せん断プレートも利用可能です。以上で、生理学的に妥当な血管生物学実験を行うためのマイクロ流体フローチャネルの使用方法について説明しました。このプロトコルを実施する際は、適切なバッファーでコラーゲンを希釈することを忘れないでください。気泡の混入を防ぐため、常に正しいピペッティング技術を用い、常に研究室のバイオセーフティ規定に従ってください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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