マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しましたインビトロ

この実験の全体的な目標は、in vitro で血小板輸血を模倣し、コラーゲンの止血を使用して、流体力学的な流れとリアルタイムの顕微鏡法でテストすることです。血小板減少症の患者は、保存された血小板濃縮物で治療されます。.私たちの方法は、血栓症と止血の分野における主要な質問に答えるのに役立つことを目的としており、特にそのような保存された血小板濃縮物の品質と機能に重点を置いています。

この技術の付加価値は、血流を模倣するため、参加細胞や生体分子に対するレオロジーの影響を考慮に入れることです。現在の方法では、血小板のコラーゲンへの結合を評価しています。ただし、アテローム性動脈硬化性プラーク、内皮細胞、またはフォン・ヴィレブランド因子やフィブリノーゲンなどの特定のマトリックスタンパク質など、他の接着組織にも適用できます。

バイオチップの準備から始めます。コラーゲンストックをメーカーの等張性グルコース溶液で1〜20にボルテックスして希釈し、最終濃度が50マイクログラム/ミリリットルになるようにします。次に、0.8マイクロリットルを新しい使い捨てバイオチップのレーンにピペット

チップの一方の端にあるすべてのレーンを埋め、これをアウトレットエンドとしてマークします。次に、チップを検査して、各レーンが溶液で5/6満たされ、気泡がないことを確認します。次に、チップを摂氏4度で4時間または一晩、加湿して密閉した容器でインキュベートします。

その後、ブロッキングバッファーをレーンのもう一方の端にピペッティングして、コード化されたチャンネルをブロックします。次に、レーンごとに 12 cm の長さのチューブをカットし、各長さのチューブにピンを取り付けて、バイオチップに取り付けられるようにします。チューブの長さをシリンジとコネクタからの蒸留水ですすいでください。

次に、ブロッキングバッファーで飽和させ、加湿容器に少なくとも1時間密封します。次に、ポンプとマニホールドを準備します。まず、ポンプとマニホールドを蒸留水ですすぎ、気泡を取り除きます。

次に、バイオチップを自動顕微鏡ステージに取り付けます。長さの一方の端をHBSで満たされた1.5ミリリットルのチューブに入れ、もう一方の端をバイオチップインレットに取り付けます。マニホールドピンをバイオチップの出口に入れます。

次に、ポンプを使用してシステムをHBSですすぎます。したがって、残っているブロッキングバッファーまたは接着不良のコラーゲンは除去されます。これでフローチャンバーの準備は完了です。

健康なボランティアからの最近の採血を円錐形の遠心チューブにプールすることから始めます。サンプルを250で約15分間回転 Gs.Do、緩く詰まった下相を乱すため、ブレーキを使用しないでください。多血小板血漿とバフィーコートを取り外して廃棄します。.

血小板をできるだけ少なく含む詰められた赤血球を保存して、再構成された血液を作ります。次に、4ミリリットルのAB型プラズマを摂氏37度で5分20秒間解凍し始めます。その間、自動血液分析装置を使用して、調製されたパック赤血球のヘマトクリット値を決定します。

次に、全血の再構成に用いる血小板濃縮物を調製した血液バンクの血小板濃度を求める。40%ヘマトクリット値、およびマイクロリットルあたり250, 000血小板を含む再構成血液1ミリリットルに必要な量を計算します。次に、クリップされたピペットチップを使用して、必要な量の赤血球、血漿、および血小板濃縮物を目的の濃度に移し、最終容量を1ミリリットルに移します。

再構成した血液を穏やかな逆転で混合し、全血球計算を行います。次に、カルセインAMを含む準備された微量遠心チューブを入手し、それに再構成された血液を1ミリリットル加えます。穏やかな反転を使用して血液を染料と混合します。

次に、再構成した血液を摂氏37度で5分間インキュベートします。ソフトウェアで、灌流レーンの対象領域を選択します。レーンの下部に付着したコラーゲン繊維に100倍の倍率で注目します。

理想的には、位相コントラストまたは微分干渉コントラストを使用します。[選択したタイル領域に現在の Z を設定] オプションを選択して、選択した Z 位置をデジタル固定します。灌流前の光学的焦点は、エナメルブラストのコラーゲンにあるべきですが、これは難しい場合があります。

別の方法として、顕微鏡の焦点を最初に付着した血小板に設定する方法があります。次に、サンプルを穏やかに混合し、バイオチップの隣に置きます。次に、観察されたレーンに接続されたチューブを再構成された血液に入れます。

次に、ポンプを制御するソフトウェアを使用して、1平方センチメートルあたり50ダインの圧力を加えて血液サンプルをレーンに移動し、実験を開始します。実験中は、15秒ごとに5分間画像を記録します。画像解析ソフトウェアを使用して血栓増殖速度を決定します。

この場合、Zen 2012が利用されます。まず、プラグインの画像解析を開いて、血小板の表面被覆率を決定します。analyze interactiveタブで蛍光閾値を設定し、付着した血小板から得られる正のシグナルと相関するピクセル強度を定義します。

次に、create tables を使用して、各時点の正の信号の表面積のリストを含むスプレッドシートを自動的に生成します。これらのスプレッドシートを XML 形式で保存し、スプレッドシート プログラムで開いてさらに計算します。各時点で、選択したオブジェクトの合計表面積を計算し、この値を覆われている表面の割合として表します。

次に、灌流時間の関数としてデータをプロットし、線形回帰によって傾きを計算します。これは、その特定の実験条件の血栓成長速度をモデル化します。3つの同一の再構成全血サンプルをコラーゲンコーティング表面に同時に灌流しました。

その結果、変動係数は 8.7% となり、テストの比較においてアッセイ内およびラボ内の変動が許容できることを示唆しています。輸血は、血液を欠損した成分で再構成することによりシミュレートされました。血小板濃度を減少させながら、いくつかの再構成を行った。

予想通り、血小板数が少ないほど、灌流時間の関数としての接着が減少しました。次に、採血後および灌流中の温度低下の影響を調査しました。血栓は、血液が室温に冷却されると、よりゆっくりと形成されることがわかりました。

研究全体を通して摂氏37度に保たれたサンプルと比較すると。循環中、血小板は、壁の純粋なストレスがかかる状況で血管の損傷部位に結合します。予想通り、マイクロ流体フローチャンバー内の純速度を変えると、血小板の総接着性が変化しました。

これらの条件は、血栓の成長速度も変化させます。このビデオを見た後、再構成された血液を使用してマイクロ流体フローチャンバー実験を行い、保存された血小板濃縮物の品質と機能をテストする方法を十分に理解しているはずです。この手法は、約7時間で完了します。

マイクロ流体フローチャンバー実験は、血小板輸血の分野の研究者が、提供、調製、および保存変数の影響を調査するための道を開きました。関連する例の1つは、病原体の不活性化です。ここでは、1つの実験対象を例に挙げました。

しかし、カルシウム濃度、シアーストレス、表面コーティングのばらつきは、さまざまな研究課題に対処するために使用できます。この手順と同様に、マイクロ流体フローチャンバー内の他の測定を実行して、追加の質問に答えることができます。例えば、蓄積された血小板の性能は、流れ上の凝固に