Name: マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しましたインビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶマイクロ流体チャンバーを用いた再構成血液による止血評価法。コラーゲン上での血小板機能をリアルタイム顕微鏡で観察し、輸血用血小板製剤の品質と機能を評価する技術を解説します。

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このプロトコルは、ヒト試料の研究のための制度倫理指針に従っており、インフォームドコンセントは、関係する全てのドナーから得られました。ここに記載された実験の承認は、アントワープ大学病院の施設内倫理委員会から入手しました。 注：指定しない限り、温度表示は、常に室温です。 1.準備フローチャンバーのセットアップ<ol><li>レーン、チューブおよびピンの準備<ol><li>渦激しくコラーゲン懸濁液および50μg/ mlの最終濃度になるように、プロバイダにより供給された等張グルコース溶液で1/20に希釈します。 注：私たちは、主にI型線維の構成された、ウマ腱コラーゲンを使用します。ウマコラーゲンI型はしばしば「HORM「コラーゲンと呼ばれ、歴史的なだけでなく、生物学的な理由の両方のためのアッセイ9のこのタイプの黄金の標準です。ヒトIII型コラーゲンを使用することもできるが、目eはあまりよくコートをフィブリルおよび血小板応答は、強力ではありません。他のコーティング表面は、例えばフォン・ヴィレブランド因子（VWF）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン-1、またはこれらの16の組み合わせのために、使用することができます。 </li><li>プロバイダーのコンテナから新しい使い捨てバイオチップを取ります。ここで使用されるバイオチップの寸法はミリメートル3で0.4Wのx 0.1Hのx 20Lです。 </li><li>ピペットの出口としてチップとマークの一端のマイクロ流体バイオチップのレーン（複数可）に0.8μlの。レーンが1.1.1で調製した塗布溶液を含有するコ​​ラーゲンと5/6日に満たされていることを確認します。気泡がないことを確認してください。 注：チャンネルは、部分的に（説明を参照）、チャネルの入口にコラーゲン線維の蓄積を回避するためにコーティングされています。 </li><li>加湿と密閉容器内の4時間または一晩4℃でインキュベートします。 </li><li> / v）のウシ血清アルブミンwは（ブロッキング緩衝液（1.0％をピペットでコーティングされたチャネルを遮断他端とマークで、D、0.1％（w / v）のグルコース、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）の緩衝化生理食塩水（/ v）の塩化ナトリウム、pH7.4のW、0.9％（HBS）で入口として。車線が完全に空気の泡を避けブロッキング緩衝液で満たされていることを確認します。 </li><li>同じサイズ（12センチ）でチューブをカットします。レーンあたり1を使用し、ピンで各チューブを接続します。例えば、二重に実行する二つの条件を比較した実験では、4チューブストレッチと4本のピンを用意する必要があります。 </li><li>シリンジと26 Gの針または添付コネクタを使用して蒸留水でチューブを洗浄します。 </li><li>ブロッキング緩衝液でチューブを飽和。 1時間の最小値のため、閉鎖し、加湿容器に保管してください。 </li></ol></li><li>ポンプとマニホールドの準備<ol><li>ポンプを洗浄し、蒸留水でマニホールド、気泡を除去。 </li><li>出口で固定10μlのチップを用いたバイオチップレーン（複数可）のうち、ブロッキング緩衝液を吸引します。の表面を清掃してください精密無料ワイプほこりや変性アルコールによるバイオチップは、プリントやほこりを除去します。 </li><li>自動化された顕微鏡ステージ上のバイオチップを修正しました。複数のレーンが1回の実行で同時に使用されている場合は、バイオチップコンセントに8レーンマニホールドスプリッタを接続します。 注：8レーンマニホールドスプリッタは、ポンプやバイオチップに接続されたハードウェアの一部（ 図S1）です。これは、添付のソフトウェアで操作者が定義することができるバイオチップ又はレーンの組み合わせ（8個）のレーンすべての動作が利用できることができます。 </li><li>バイオチップの入口でそれらを修正するためにチューブでピンを使用してください。 HBSで満たされた1.5ミリリットルコニカル試験管に（ピンなし）チューブのもう一方の端を置きます。バッファおよび不十分な付着コラーゲンをブロックし、残りを除去するために、ポンプを使用して、1ミリリットルのHBSですべてのチューブとその接続されたレーンをすすぎます。 </li></ol></li></ol>血液試料の調製<ol><li>コレクションとの分離健康なボランティアからの新鮮な全血。17 <ol><li>抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む真空チューブ内の血液の最初のミリリットルを収集し、排他的に自動血液分析器を用いて完全血球算定（CBC）のために、このサンプルを使用しています。 </li><li>避難チューブを用いて、適切な抗凝固剤で血液量を収集します。フィブリン形成が研究プロトコールおよびクエン酸ナトリウムの一部ではない場合がある場合、フローチャンバー実験のための標準的な抗凝固剤は、ヘパリンまたはヒルジンです。 注：ヘパリンは、結果に記載のすべての実験のための抗凝固剤として使用しました。 注：血液の量は、実行される実験の数に依存します。 3車線のため、約1管（7ミリリットル）。 </li><li>回転子保留中の血液の再構成にチューブを入れます。 注：このアッセイは、瀉血の3時間以内に完了する必要があります。 </li><li>多血小板血漿を準備するために250グラムで15分間遠心分離（PRP）。ゆるく充填されたペレットの乱れを防止するために遠心ブレークを使用しないでください。 <ol><li>複数のチューブが収集された場合には、単一の円錐形遠心分離管に血液をプールします。 注：遠心分離は、PRPの収量および差動セル「汚染」に応じて、よりゆっくりと以下の長い行うことができる好ましいです。 </li></ol></li><li>削除して、いくつかの血小板が充填された赤血球を得たPRPと軟膜を捨てます。 我々の手中に平均1μl当たり13±5×10 3パック赤血球画分中の血小板数がある（平均±SD、n個= 12）：注意してください。 </li></ol></li><li>血液再構成<ol><li> 5分および4ミリリットルあたり20秒、37℃で解凍血液型AB（アカゲザルD負）プラズマ。 </li><li>自動血液分析装置を用いて、2.1.5で製造した濃縮赤血球のヘマトクリットを決定します。 </li><li>血液バンクに血小板濃度を決定するには、濃縮血小板股関節を用意しましたtは、上記赤血球画分を再構成するために使用されます。 </li><li> 1ミリリットルのサンプルで40％のヘマトクリットおよび250×10 3血小板/μLをもたらすパックされた赤血球と血小板濃縮物の体積を計算します。 注：細胞の他の標的力価は、試験プロトコルに応じて、任意に設定することができます。 </li><li>転送がクリップピペットチップを使用し、1mlのサンプル容量に達するまで、血小板濃縮物を加える新しいチューブに赤血球と血漿を充填しました。 注：プラズマは血栓形成率に大きな影響を持っているので、研究の変数に応じて、血漿分画は、全ての再構成のサンプルで同じでなければなりません。例えば、異なるドナーから、または別の抗凝固剤で撮影を繰り返し凍結融解または血漿は、結果に影響を与えることができます。 </li><li>静かに反転させて再構成された血液を混ぜ、CBCを行います。 </li><li>血小板画分の量が置換された「ブランク」対照試料を調製し0.9％の同じ体積CBCを使用して再構成された血液中の内因性血小板（ すなわち、非血液バンク血小板）の濃度を決定するために水中で（M / v）の塩化ナトリウム。 </li></ol></li><li>ラベリング<ol><li>ピペットで1ミリリットル1μlの5 mMのカルセインAM（5μM最終濃度）を含有する試験管に血液を再構成しました。 注：他の細胞の色素14を使用することができます。 </li><li>転倒混和し。 </li><li>使用前に37℃で5分間インキュベートします。 </li></ol></li></ol> 3.灌流アッセイ<ol><li>レーンの底に付着したコラーゲン繊維上の目的に焦点を当てます。理想的には、この焦点を当て戦略の位相差や微分干渉コントラスト（DIC）の設定を使用します。デジタルで選択されたZ-位置を固定するための実験ソフトウェアで「選択されたタイル領域に設定されている現在のZ]を選択します。 </li><li>メートルの試験ソフトウエアでレーン（XY）に関心領域（ROI）を選択します実験中に記録されますicroscope。 注：ROIは任意に灌流レーン内で選択した任意の表面積することができます。そのように、これは比較的小さくても、その領域の可変流量プロファイルの副作用を回避するために、近い車線の入口及び出口に血栓形成を分析しないことが望ましいです。 ROIの表面積は、血小板の有意な数を含むか、または信号の平滑化を可能にするために血栓べきです。このプロトコルでは、ROIは2センチ車線の中央に0.62ミリメートル2の結果3等しいサイズのサイドバイサイド画像のデジタルでステッチ集合体です。 </li><li>自動化されたステージ上でバイオチップの隣に、これらを反転して位置によって穏やかにサンプルを混ぜます。 </li><li>再構成された血液サンプルを含む試験管内のバイオチップの入口に接続されたチューブを置きます。 </li><li> （希望として、または他のせん断応力）試験管にリンクされ、これらのチャネルを50ダイン/ cm 2のポンプを起動しますポンプのソフトウェアを使用して再構成した血液サンプルを含みます。 注：他のせん断応力を使用することができます。 </li><li>レコード画像顕微鏡の取得と実験ソフトウェアを使用してリアルタイムで5分ごとに15秒。 注：他の時系列が、実験のセットアップに応じて使用することができます。 注：私たちは、一般的に100倍の倍率（10倍対物レンズと10倍レンズ）を使用しますが、より高い（または低い）倍率が簡単に代替として使用することができます。 </li></ol> 4.ウォッシュアウト<ol><li>すべてのチューブの出口に取り付けられ、次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）、0.5％（v / v）を、水で最終​​的に0.1 MのNaOH、続いて蒸留水を用いてマルチチャンネルマニホールドまたはポンプに接続さを洗い流します。有害廃棄物のバイオチップの入口に固定チューブを捨てます。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>画像解析ソフトで血栓成長速度を決定します。次のコマンドはZEN2012に特異的です。 <ol&gt; <li>血小板の表面被覆率を決定するために、プラグインの画像解析を開きます 。 </li><li>正の信号と相関画素強度を定義するためのインタラクティブなタブを分析 、 すなわち付着血小板または付着血小板中の蛍光閾値を設定します。 </li><li>自動的に選択された閾値との間の信号を有する画素を含むもの「オブジェクト」の（μm2の中の）独立した表面領域を含むことになるスプレッドシートを生成するために、 表の作成 ​​に使用します。これは、各時点で行われます。 注：蛍光閾値を選んだしたら、解析ソフトウェアは自動的に基準を満たす視野に「オブジェクト」を検出します。これらのオブジェクトは、血栓、小さな血小板凝集または単一の血小板であり、画素数をカバーします。すべてのオブジェクトは、別々のスプレッドシートに記載されています。 </li><li> xml形式でこれらのスプレッドシートを保存し、スプレッドシートプログラムで開きますさらなる計算のために。 </li><li>合計して、選択したオブジェクトの合計表面積とは、測定フィールド（μmの2）の総面積で結果を分けます。これは、相対的な表面被覆率（％）を生じるであろう。毎回ポイントのためにそう。 </li><li>灌流時間の関数にこれらの表面被覆率をプロットし、線形回帰によって傾きを算出し、その特定の状態の血栓成長の速度論を得ました。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

マイクロ流体フローチャンバー実験は、血液の流れに血小板機能を調査するための優れたツールであり、実験的な文脈を変化させるインビトロでの止血を評価するために使用されます。貧しい施設間の標準化9にもかかわらず、我々は我々の研究室内実験変動が許容可能であることを示しています。これは確実に与えられた研究の範囲内（ペアリング）のサンプルを比較することができます。これは、血液バンク条件11における血小板貯蔵の有害な結果である血小板保存病変、のよく文書化現象を利用して検証しました。さらに、我々は最近、血液14,15の再構成以下のマイクロ流体フローチャンバー内のPCの血小板機能上の3つの利用可能な病原体不活化技術の影響を発表しました。 生物物理学的および-化学パラメータが20変化させたとき、血小板は異なる応答します。したがって、せん断応力、細胞数および細胞composiン、温度、コーティング、抗凝固剤と、より多くの要因が研究課題に応じて、このプロトコル内で変更することができます。このプロトコルは...

止血は制限された時空間コンテキスト1で細胞、タンパク質、イオンと組織の組み合わせと調整活動が必要です。制御されていない活動は、血液凝固に関連する疾患のスペクトルに出血や血栓症および罹患率や死亡率につながる可能性があります。マイクロ流体フローチャンバー実験は、 インビトロで止血を模倣困難な技術です。このアプローチは、血小板のための先導的な役割で止血に参加するプロセスの複雑な相互作用の調査を可能にします。 血管損傷後、血小板は血液の損失を防止するために、露出した内皮下マトリックス（糖）タンパク質に付​​着します。接着に続いて、血小板が最終的にフィブリンおよび事務所の結果によって安定化された血小板のネットワークの形成につながるシグナル伝達を自動およびパラクリンに応答して活性化し、骨材、血栓2を封止巻か。他のほとんどの血小板機能検査、experiとは異なり、フローチャンバーを持つメントは、アカウントへの血流の物理的パラメータ、したがって、参加した細胞や生体分子3,4上のレオロジーの影響を取ります。 チャンバー実験フロー止血（サブ）に影響の重要なパラメータを変化させることによって、止血および血栓症の中で画期的な洞察を生成した接着剤マトリックス、レオロジー及び流れプロファイル、細胞組成、毒素または薬物、イオン強度および多くの存在を含む処理されます。過去20年間では、大規模なサンプル容量（10〜ml）を必要とする低スループットフローチャンバー実験は、多くの場合、小さな平行板室からなり、制御された壁面せん断条件5で全血を灌流するための近代的な技術を含むマイクロ流体室に進化してきました。ハードウェアのセットアップを簡略化しており、以下（血液）のボリュームが必要とされる主な理由Microscalingが大幅に実験をよりアクセスし、versatiレンダリング、アッセイのスループットを増加していますル。例えば、小型の実験動物からの血液は、現在、動物を犠牲にすることなく使用することができます。遺伝的に改変されたマウスの血液サンプルは、このように止血を促進または阻害鍵分子の同定におよび新規の基本的な洞察6に支援しています。 専門の研究室は、多くの場合、まだソフトウェアによってblueprintedすることができリトグラフ金型に重合したポリジメチルシロキサン（PDMS）7からインスタンスのカスタムメイドのフローチャンバーを使用します。その結果、チャンバは、安価な使い捨てであり、容易に事後解析のために分解することができます。また、分岐点または鋭いターンを含む血管の基本的にはどのようなデザインは、コマンド上に構築することができます。この利点は、標準化は既にフローチャンバー実験と主要な問題であり、PDMSは、カスタムメイドの室がこれを支援していないので、その欠点です。この特定の問題、コーティング（条件）、蛍光プローブ、抗凝固剤、温度の上サンプリングと分析の間eratureと時間がすべての悪い8を標準化されています。これらの変数の標準化は、困難、それにもかかわらず、研究室間の結果の比較を可能にするために必要とされます。このトピックでは、生物レオロジー9,10に関する科学と標準化小委員会における血栓止血に関する国際社会の主要な対象です。 血小板濃縮物（PC）は、血小板減少症および/または出血を引き起こす様々な疾患に罹患している患者に輸血されています。しかし、PC中の血小板は、特に貯蔵時間11の関数で、脱感作することが知られており、劣化プロセスは、加齢および一般血小板貯蔵病変と呼ばに連結されました。時々 、このような血小板はかつて12輸血血液循環に復元することが主張されているが、これのための証拠は乏しいです。さらに、PCを構成する血小板の機能は、日常的にテストされていないため、このようなアッセイとの間の関係治療的または予防的有効性は13不明です。マイクロ流体フローチャンバーは、コレクションと発行間の操作のチェーンを最適化するために、PC内の血小板機能を調査するための手段を提供しています。それは我々が以前に14,15を公開しているし、ここに記載されているように、PCの直接（ペアリング）比較のための強力な研究ツールです。

<table><tbody><tr><td>BDバキュテナーチューブ(EDTA付き)&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer tube with Heparin</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer tube with Sodium Citrate</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin Blood tube</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>ホルダー付き採血針</td></tr><tr><td>ピペットチップ 100-1,000</td><td>グライナーバイオワン</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ 2-200</td><td>グライナーバイオワン</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ 1-10</td><td>エッペンドルフ</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 5 ml</td><td>スインポート</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 15 ml</td><td>グライナーバイオワン</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>円錐管 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>精密ワイプ</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Figure S1 A で 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>チューブ</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Figure S1 Bで「使い捨てチューブ」と名付け</td></tr>られた<tr><td>Vena8ニードル</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Figure S1Bで「ピン」バイオ</td></tr><tr><td>チップのシングルインレットケーブル用コネクタ</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-血栓</td><td>Figure S1 Bで「再利用可能なチューブ」と「スプリッター」と名付け</td></tr><tr><td>られた加湿ボックス</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア マイクロ流体ポンプ</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Native equine tendon collagen (type I) コラーゲンを希釈するための等張性グルコース溶液を補充</td></tr><tr><td>HEPES緩衝生理食塩水(HBS)</td><td></td><td>ハウス調製</td><td>10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝生理食塩水(0.9%(w / v)NaCl、pH 7.4)</td></tr>ハウス<tr><td>調製中の</td><td>ブロッキング緩衝液</td><td>ハウス調製中の</td><td>1.0%(w / v)ウシ血清アルブミンおよび0.1%(w / v)グルコースHBS</td></tr><tr><td>カルセインAM</td><td>分子プローブC1430</td><td></td><td></td></tr>漂<tr><td>白剤10%</td><td>ハウス</td><td>ハウスプレパレーション</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>インハウスプレパレーション</td> ハウス<td>プレパレーション</td><td></td></tr><tr><td>変性アルコール</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo ナノポンプ</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>マルチフロー8.Figure S1 Aで「ポンプ」と「マニホールド」</td></tr><tr><td>と名付けられた顕微鏡</td><td>colibri-LEDと高解像度CCDカメラ</td>を搭載した<td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td></tr><tr><td>ソフトウェア顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>血液分析装置</td><td>シスメックス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>血小板インキュベーター</td><td>ヘル</td><td>マーPF-48i</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーションウォーターバス</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ブランド</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>チューブローラー</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドッキング装置</td><td>テルモ BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>チューブ シーラー</td><td>テルモ BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

>jove_content<輸血用に準備された血小板は、保存中に徐々に止血機能を失います。血小板機能は、さまざまな(間接的な)in vitro実験を使用して調査できますが、これらのどれもマイクロ流体フローチャンバーほど包括的ではありません。このプロトコルでは、血小板減少性新鮮血液を保存された血液銀行血小板で再構成して、血小板輸血をシミュレートするために使用されます。次に、再構成されたサンプルを、露出した内皮下マトリックスタンパク質の止血を模倣するマイクロ流体フローチャンバーで灌流します。献血、輸送、成分分離、保管、病原体の不活性化の影響は、ペアの実験デザインで測定できます。これにより、血液成分の調製におけるあらゆる操作が止血に与える影響を確実に比較することができます。私たちの結果は、温度サイクル、せん断速度、血小板濃度、および保存期間が血小板機能に与える影響を示しています。結論として、このプロトコルは血液銀行の血小板の機能を分析し、これは最終的に瀉血、輸送、成分調製、保管、輸血などの処理チェーンの最適化に役立ちます。

アッセイ内変動を示すために、3つの同一の再構成された全血試料を、コラーゲン被覆された表面（ 図1）を介して同時に灌流しました。これは、8.7％の変動係数をもたらしました。この統計は、関連するサンプル間の信頼性の比較を可能にする許容可能なアッセイ内およびintralaboratory変化を示唆しています。 ここで説明する商業フローチャンバの入口は、測定チャンバに垂直であり、これは、その時点での代わりに層流のわずかに乱流を引き起こすことができます。特に抗凝固療法なしの実験では、これがために血液と固定化されたアゴニストの間に増加した接触時間の目詰まりの原因となります。詰まっ入口は、チャンバー内の下流の読み出しを混乱することができます。したがって、セットアップの一部がフローチャンバー（ 図2）を残しをコーティングすることにより最適化されました血小板アゴニストを欠い入口は、それによって一次および...

血小板輸血と止血は、血液貯蔵血小板の機能を調査するために、血液再構成とマイクロ流体フローチャンバーを使用してモデル化されました。このデータは、血小板蓄積病変がin vitroで止血に及ぼす影響を示しています。

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

この実験の全体的な目標は、in vitro で血小板輸血を模倣し、コラーゲンの止血を使用して、流体力学的な流れとリアルタイムの顕微鏡法でテストすることです。血小板減少症の患者は、保存された血小板濃縮物で治療されます。.私たちの方法は、血栓症と止血の分野における主要な質問に答えるのに役立つことを目的としており、特にそのような保存された血小板濃縮物の品質と機能に重点を置いています。この技術の付加価値は、血流を模倣するため、参加細胞や生体分子に対するレオロジーの影響を考慮に入れることです。現在の方法では、血小板のコラーゲンへの結合を評価しています。ただし、アテローム性動脈硬化性プラーク、内皮細胞、またはフォン・ヴィレブランド因子やフィブリノーゲンなどの特定のマトリックスタンパク質など、他の接着組織にも適用できます。バイオチップの準備から始めます。コラーゲンストックをメーカーの等張性グルコース溶液で1〜20にボルテックスして希釈し、最終濃度が50マイクログラム/ミリリットルになるようにします。次に、0.8マイクロリットルを新しい使い捨てバイオチップのレーンにピペットで入れます。チップの一方の端にあるすべてのレーンを埋め、これをアウトレットエンドとしてマークします。次に、チップを検査して、各レーンが溶液で5/6満たされ、気泡がないことを確認します。次に、チップを摂氏4度で4時間または一晩、加湿して密閉した容器でインキュベートします。その後、ブロッキングバッファーをレーンのもう一方の端にピペッティングして、コード化されたチャンネルをブロックします。次に、レーンごとに 12 cm の長さのチューブをカットし、各長さのチューブにピンを取り付けて、バイオチップに取り付けられるようにします。チューブの長さをシリンジとコネクタからの蒸留水ですすいでください。次に、ブロッキングバッファーで飽和させ、加湿容器に少なくとも1時間密封します。次に、ポンプとマニホールドを準備します。まず、ポンプとマニホールドを蒸留水ですすぎ、気泡を取り除きます。次に、バイオチップを自動顕微鏡ステージに取り付けます。長さの一方の端をHBSで満たされた1.5ミリリットルのチューブに入れ、もう一方の端をバイオチップインレットに取り付けます。マニホールドピンをバイオチップの出口に入れます。次に、ポンプを使用してシステムをHBSですすぎます。したがって、残っているブロッキングバッファーまたは接着不良のコラーゲンは除去されます。これでフローチャンバーの準備は完了です。健康なボランティアからの最近の採血を円錐形の遠心チューブにプールすることから始めます。サンプルを250で約15分間回転 Gs.Do、緩く詰まった下相を乱すため、ブレーキを使用しないでください。多血小板血漿とバフィーコートを取り外して廃棄します。.血小板をできるだけ少なく含む詰められた赤血球を保存して、再構成された血液を作ります。次に、4ミリリットルのAB型プラズマを摂氏37度で5分20秒間解凍し始めます。その間、自動血液分析装置を使用して、調製されたパック赤血球のヘマトクリット値を決定します。次に、全血の再構成に用いる血小板濃縮物を調製した血液バンクの血小板濃度を求める。40%ヘマトクリット値、およびマイクロリットルあたり250, 000血小板を含む再構成血液1ミリリットルに必要な量を計算します。次に、クリップされたピペットチップを使用して、必要な量の赤血球、血漿、および血小板濃縮物を目的の濃度に移し、最終容量を1ミリリットルに移します。再構成した血液を穏やかな逆転で混合し、全血球計算を行います。次に、カルセインAMを含む準備された微量遠心チューブを入手し、それに再構成された血液を1ミリリットル加えます。穏やかな反転を使用して血液を染料と混合します。次に、再構成した血液を摂氏37度で5分間インキュベートします。ソフトウェアで、灌流レーンの対象領域を選択します。レーンの下部に付着したコラーゲン繊維に100倍の倍率で注目します。理想的には、位相コントラストまたは微分干渉コントラストを使用します。[選択したタイル領域に現在の Z を設定] オプションを選択して、選択した Z 位置をデジタル固定します。灌流前の光学的焦点は、エナメルブラストのコラーゲンにあるべきですが、これは難しい場合があります。別の方法として、顕微鏡の焦点を最初に付着した血小板に設定する方法があります。次に、サンプルを穏やかに混合し、バイオチップの隣に置きます。次に、観察されたレーンに接続されたチューブを再構成された血液に入れます。次に、ポンプを制御するソフトウェアを使用して、1平方センチメートルあたり50ダインの圧力を加えて血液サンプルをレーンに移動し、実験を開始します。実験中は、15秒ごとに5分間画像を記録します。画像解析ソフトウェアを使用して血栓増殖速度を決定します。この場合、Zen 2012が利用されます。まず、プラグインの画像解析を開いて、血小板の表面被覆率を決定します。analyze interactiveタブで蛍光閾値を設定し、付着した血小板から得られる正のシグナルと相関するピクセル強度を定義します。次に、create tables を使用して、各時点の正の信号の表面積のリストを含むスプレッドシートを自動的に生成します。これらのスプレッドシートを XML 形式で保存し、スプレッドシート プログラムで開いてさらに計算します。各時点で、選択したオブジェクトの合計表面積を計算し、この値を覆われている表面の割合として表します。次に、灌流時間の関数としてデータをプロットし、線形回帰によって傾きを計算します。これは、その特定の実験条件の血栓成長速度をモデル化します。3つの同一の再構成全血サンプルをコラーゲンコーティング表面に同時に灌流しました。その結果、変動係数は 8.7% となり、テストの比較においてアッセイ内およびラボ内の変動が許容できることを示唆しています。輸血は、血液を欠損した成分で再構成することによりシミュレートされました。血小板濃度を減少させながら、いくつかの再構成を行った。予想通り、血小板数が少ないほど、灌流時間の関数としての接着が減少しました。次に、採血後および灌流中の温度低下の影響を調査しました。血栓は、血液が室温に冷却されると、よりゆっくりと形成されることがわかりました。研究全体を通して摂氏37度に保たれたサンプルと比較すると。循環中、血小板は、壁の純粋なストレスがかかる状況で血管の損傷部位に結合します。予想通り、マイクロ流体フローチャンバー内の純速度を変えると、血小板の総接着性が変化しました。これらの条件は、血栓の成長速度も変化させます。このビデオを見た後、再構成された血液を使用してマイクロ流体フローチャンバー実験を行い、保存された血小板濃縮物の品質と機能をテストする方法を十分に理解しているはずです。この手法は、約7時間で完了します。マイクロ流体フローチャンバー実験は、血小板輸血の分野の研究者が、提供、調製、および保存変数の影響を調査するための道を開きました。関連する例の1つは、病原体の不活性化です。ここでは、1つの実験対象を例に挙げました。しかし、カルシウム濃度、シアーストレス、表面コーティングのばらつきは、さまざまな研究課題に対処するために使用できます。この手順と同様に、マイクロ流体フローチャンバー内の他の測定を実行して、追加の質問に答えることができます。例えば、蓄積された血小板の性能は、流れ上の凝固に。

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。...

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

微小サイズのチャネル（&lt;30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この...

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。...

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。...

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。...

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

ここで示されているのは、標準化された体外血球ループモデルのプロトコルです。このモデルは、輸血チューブまたは血管ステントのヘモ適合性を試験することを可能にする ISO (国際標準化機構) 標準 10993-4...

血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

フロー下での血小板機能を評価し、マイクロ流体デバイスを使用してシミュレートされた止血蘇生法をモデル化でき、これは外傷および輸血医療に応用できます。...

血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

私たちは、異種腫瘍微小環境を再現し、マイクロ流体デバイスの作製及び操作のための手順を紹介...

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

誘電泳動（DEP）は、細胞を操作するために有効な方法である。プリント回路基板（PCB）は、マイクロ流体デバイス内に非接触で細胞操作のために、安価な再利用可能で効果的な電極を提供することができます。プリント基板上にカバーグラスを持つPDMSベースのマイクロ流体チャネルを組み合わせることで、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイス内でビーズと細胞操作と分離を示しています。...

誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

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の体系的な分析体外セルローリング

学ぶマイクロ流体チャンバーを用いた再構成血液による止血評価法。コラーゲン上での血小板機能をリアルタイム顕微鏡で観察し、輸血用血小板製剤の品質と機能を評価する技術を解説します。

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました

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