Name: 可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶ蛍光標識RNAを用いたアフリカツメガエル卵母細胞におけるRNA局在の可視化法。共焦点顕微鏡で生細胞内のRNA動態をリアルタイムに観察し、RNA輸送メカニズムの解明に貢献します。

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RNAの局在に関する私たちの仕事は、KLMにNIH（R01GM071049）からの助成金によってサポートされています。

パート1：蛍光標識mRNAの転写。 <ol><li> RNAの局在化の要素や他の関連配列を含むプラスミドDNAを線形化し、DEPC処理H 2 Oでの1μg/μLで再懸濁します。 DNAテンプレートは、T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼによる転写のための上流のプロモーター部位を持っている必要があります。 </li><li>滅菌1.5mlチューブに下記の試薬を追加します。 <table><tbody><tr><td> A. 10X送信バッファ（M＆Mを参照） </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> B. 20Xキャップ/ NTPミックス（M＆Mを参照） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> C. 1mMののAlexa Fluor ® 546から14 - UTP（Invitrogen社） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> D. UTP、[α- 32 P]（1μCiの/μL）（パーキンエルマー） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> E. DEPC - H 2 O </td><td> 11μlの</td></tr><tr><td> F. 0.2 M DTT </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> G. RNasin（プロメガ社製） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> H.リニアテンプレートDNA </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> I. RNAポリメラーゼ（プロメガ） </td><td> 1μL </td></tr></tbody></table></li><li>静かに試薬を混合し、（10秒。微量遠心機で）短時間遠心します。 </li><li>フルオロフォアの光退色を防ぐためにアルミホイルでチューブをカバーし、37℃で2〜4時間インキュベートする。 </li><li>鋳型DNAを分解するために1μlの1 mg / mLのRNaseフリーのDNase（プロメガ）を追加します。 </li><li> 37℃で15分間インキュベーション℃に</li><li>反応を停止するには79μlの20 mMのEDTA（pH 8.0）を追加します。 </li><li> "入力"して保存とラベルを別々のチューブに1μlを取り外します。 </li><li>全長のmRNAを排除しながら取り込まれなかったヌクレオチドを​​含んでなる1ミリリットルG50カラムを介してスピンの反応（材料と方法を参照）、。 </li><li>エタノール沈殿によりRNAを濃縮する。 <ol class="lalpha"><li> 250μlの100％エタノール、10μlの7M CH 3 COONH 4、1μlのキャリアRNA（酵母tRNA、10μg/μLの）または1μlのグリコーゲン（20 mg / ml）を追加。 </li><li>よく混ぜ、-80℃で&gt; 30分間または15分間ドライアイス上で固体になるまで凍結する。 </li><li> 15分、上清をデカント用遠心機で最高速度で回転する。 </li><li> 75％エタノール150μlで洗浄する。 </li><li>遠心、上清をデカントで最高速度で3分間スピン。 </li><li> 37℃で3分間のペレットを乾燥させ、すべてのエタノールが蒸発していることを保証する。 </li></ol></li><li> 11μlのDEPC - H 2 Oに再懸濁し、"組み込まれた"とラベルを別々のチューブに1μlを削除します。 </li><li>パーセントの混入を決定し、50 nMの（計算のための材料と方法を参照）にRNAを希釈する。 </li><li> RNAは凍結/融解を避けるために、単一の使用のために、5μlのアリコートで凍結する必要があり、-80℃で数週間保存することができます</li></ol>第2部：マイクロインジェクションのための準備。 <ol><li> RNAの調製： RNA（50 nm）のアリコートを解凍し、70℃RNAを変性° Cを3〜5分間。任意の粒子を除去し、氷の上に保つために最高速度で室温の遠心機で10分間スピン。 </li><li>卵母細胞の準備： <ol class="lalpha"><li>外科的にアフリカツメガエルの雌（ナスコ）から卵巣を摘出する。 </li><li>コラゲナーゼ溶液25 mlを入れた50 mlコニカルチューブにアフリカツメガエルの卵巣のトリム部分（材料と方法を参照）。 </li><li> 15分間18℃で穏やかに振盪、または卵母細胞まで目に見えて卵巣から分離されています。バッチの変動にバッチに起因する、コラゲナーゼ処理時間が異なる場合がありますとdefoliculationを確保するために目視検査によって慎重に監視する必要があります。 </li><li>卵母細胞が、管に定着液を除去し、MBSHバッファ（材料と方法を参照）で卵母細胞を洗浄することができます。 </li><li> 3回の洗浄の合計のためにさらに2回洗浄を繰り返します。この卵母細胞の単離プロトコルは、Cohenら、2009年にはその詳細と似ています。 </li><li>標準的な解剖顕微鏡下MBSHバッファに手動でソートステージIII / IVの卵母細胞（デュモン、1972）。 IV期の卵母細胞は、顔料とわずかに大きく、斑点のある間III期の卵母細胞は、完全に不透明ですが白です。わずかに透明な卵母細胞は、完全に色素沈着や展示偏光顔料の分布が古すぎることは若すぎると卵母細胞です。 </li></ol></li><li>針の準備： 〜0.05 mmの外径に針を引いて、ベベル。 （私たちは、ドラモンド科学3.5インチ毛細血管（オーダー＃3 - 000 - 203 - G / X）、サッターインストゥルメント（株）マイクロピペットプラーとWPI社bevellerを使用してください。） </li></ol>パート3：マイクロインジェクション<ol><li>注入あたり2 NLを提供するDEPC - H 2 Oで針をキャリブレーション。我々は、フロントガス駆動型マイクロインジェクターを（材料と方法を参照）を使用して、私たちの針をロードし、マイクロメータを使用してドロップサイズを校正する。 </li><li>針にRNAをロードする。 </li><li> MBSHバッファーを含有する注射剤の皿にソートされた卵母細胞を置きます。私たちは、黒い発泡ゴムの層で皿の上に顕微注入する。薄い卵母細胞は白backgrouでよく目立つND。 </li><li>慎重には50nMでのRNAの2 NLで各卵母細胞を注入する。 </li><li> 、RNA追放するDEPC - H 2 Oで針をすすぎ、および注入のために、次のRNAをロードする。 </li></ol>パート4：卵の文化<ol><li>滅菌24ウェルプレート（シグマアルドリッチ社）のウェルにおける場所の卵。ウェルあたり千卵母細胞への我々は、文化まで。 </li><li>バッファを削除し、400μlのO ocyte C ulture M ediumと交換してください（OCM、材料と方法を参照してください）ウェル当たり。培養中に湿潤環境を維持するためにぬれたペーパータオルで気密プラスチック容器内の培養プレートを配置。 </li><li> 18℃で8〜48時間までの間の時間ポイントのために卵母細胞をインキュベートする。 </li></ol>パート5：卵母細胞の固定、脱水とストレージ<ol><li>ガラスバイアルに卵母細胞の生存、デッド卵母細胞と場所を整理する。我々は日常的に&gt; 90％の生存率を観察。 </li><li> 20分間MEMFA固定剤（材料と方法を参照）と岩の場所は、卵母細胞。アルミホイルで覆うことにより、光から卵母細胞を保護する。 </li><li>固定液を除去し、MBSH等量のバッファーと置き換えることにより、卵母細胞を洗浄してください。 2回の洗浄の合計のためにもう一度この洗浄を繰り返します。 </li><li>無水メタノール中に卵母細胞を洗う。 <ol class="lalpha"><li>ボリュームの半分を削除し、メタノールで交換してください。 </li><li>二度""手順を繰り返します。 </li><li>ソリューションのすべてを削除する、メタノールで交換してください。 </li><li>メタノール洗浄を繰り返します。 </li></ol></li><li>卵母細胞は、画像への準備ができるまで-20℃で保存することができます。 </li></ol>パート6：共焦点顕微鏡によるイメージングRNAの局在<ol><li>イメージングの前に、撮像面をカバーするガラス底FluoroDish（WPI社）にマレーのクリアミディアム（2:1安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）を追加します。 </li><li>慎重に転送されるメタノールの量を最小限に抑え、メタノールからFluoroDishに卵母細胞を移す。 </li><li>倒立型共焦点顕微鏡でのイメージ（我々が正常にツァイスLSM510とライカTCS SP2を使用している）。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：蛍光標識転写産物のマイクロインジェクションによる細胞内RNAの局在の可視化A.以下のマイクロインジェクションは、のAlexa Fluor 546で標識されたRNAは、最初は核に限定されているB.は、培養8時間後、蛍光標識されたコントロールRNAが均一に見ることができます。卵母細胞の細胞質に分布する。C.は、しかし、輸送用機械を採用する配列を含む蛍光標識したRNAは卵母細胞の植物極（下部に向かって）への細胞内局在性の過程で見ることができます。スケールバー= 50μmの。

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

実験動物を用いた実験は、ブラウン大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

ここでは、 アフリカツメガエルの卵母細胞におけるmRNAの局在を可視化するためのプロトコルを提示している。蛍光標識RNA転写物を使用して、このメソッドは、以前にジゴキシゲニン標識転写産物を得て、より簡単かつ迅速にその場ベースのアプローチよりもよりも、対ノイズ比の高い信号（モウリーとメルトン、1992、ガウトリューら、1997）があります。この方法を使用して、我々は、RNA配列の変異をエンジニアリングし、急速に生体機能のためにテストすることができます。さらに、追加のアレクサ- UTPのフルオロフォアを使用することにより、複数のRNA種が同一の卵母細胞で可視化することができる。我々は、理由488nmの波長範囲における自家蛍光のAlexa ® 488 - 5 - UTPと比較して、 アフリカツメガエルの卵母細胞でのAlexa Fluor ® 546から14 - UTPは優れた結果を示すことを発見したが、2つのRNAの二重像はそれにもかかわらず可能です（ガニオンをとモウリー、2009）。また、この手法は、タンパク質の共局在を検出するための免疫染色のプロトコルと組み合わせて、...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Txバッファ <ul><li class="none"> 60mMのMgCl 2の </li><li class="none"> 400mMのトリス- HCl（pH7.5）で</li><li class="none"> 20 mMのスペルミジン塩酸</li></ul> 20倍キャップ/ NTPミックス <ul><li class="none"> 10mMのCTP </li><li class="none"> 10 mMのATP </li><li class="none"> 9mmのUTP </li><li class="none"> 2mMのGTP </li><li class="none"> 20 mMのG（PPP）Gキャップアナログ（ニューイングランドバイオラボ） </li></ul> G - 50カラム <ul><li class="none"> 100ミリリットル脱イオンH 2 Oの水和物5グラムセファデックスG - 50ビーズ（シグマアルドリッチ） 30分間DEPC -扱います。とオートクレーブ。室温で不完全な在庫を保管してください。ご使用の前に、以下のRNaseフリーのソリューションを追加します。 </li><li class="none"> 0.5ミリリットルの0.2 M EDTA </li><li class="none"> 1mlのMトリスpH8.0 </li><li class="none"> 0.5ミリリットル20％SDS </li><li class="none"> 4℃で完全なG - 50ソリューションを保存する</li><li class="none">取り外して廃棄プランジャーを3 mlのシリンジ（BD Biosciences社）から、15 mlのコニカルチューブ（コーニング）にシリンジの注射筒を配置。グラスウール（ペニーの半分のサイズ約プラグ）の少量の注射器を差し込みます。 </li><li class="none">渦巻き完全なG - 50ビーズを再懸濁させるソリューション。 </li><li class="none">空の列に2ミリリットルG - 50溶液を加える。 </li><li class="none">卓上遠心機で1,000 × gで1分間スピン。 </li><li class="none">各カラムに200μlのDEPC処理脱イオンH 2 Oを追加。スピン。 </li><li class="none"> 3回の洗浄の合計のためにさらに2回洗浄を繰り返します。 </li><li class="none">新鮮な15 mlコニカルチューブにシリンジバレルを取り外します。 </li></ul> コラゲナーゼ溶液 <ul><li class="none"> クロストリジウムヒストリ （シグマアルドリッチ）から75mgのコラゲナーゼ</li><li class="none"> 25ミリリットルの0.1 M KPO 3 +液（pH7.4） </li></ul> MBSHバッファ <ul><li class="none"> 88 mM NaClを</li><li class="none"> 1 mMの塩化カリウム</li><li class="none"> 2.4mmのNaHCO 3を </li><li class="none"> 0.82 mMのMgSO 4を X 7H 2 O </li><li class="none"> 0.33 mMのカルシウム（NO 3）2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0.41 mMのCaCl 2を X · 6H 2 O </li><li class="none"> 10mMのHEPES（pH7.6）で</li></ul> 卵母細胞の培養液 <ul><li class="none"> 50パーセントL15培地</li><li class="none"> 15mMのHEPES（pH7.6）で</li><li class="none"> 1 mg / mLのインスリン</li><li class="none"> 100 mg / mlのゲンタマイシン</li><li class="none"> 50 U / mlのナイスタチン</li><li class="none"> 50 U / mlペニシリン</li><li class="none"> 50 mg / mlストレプトマイシン</li></ul> MEMFAソリューション <ul><li class="none"> 0.1 MのMOPS（pH7.4）に</li><li class="none"> 2mMのEGTA </li><li class="none"> 1 mMのMgSO 4を </li><li class="none"> 3.7％ホルムアルデヒド</li></ul> コンピューティングRNAの収量 <ul><li class="none"> &quot;入力&quot;と標準シンチレーションカウンターを使用して、&quot;法人&quot;のサンプルでCPMを決定します。 </li><li class="none">設立=（&quot;法人&quot;）/（10 ×&quot;入力&quot;） </li><li class="none">典型的な取り込み値は〜0.03と0.10の範囲です。 </li><li class="none">別のポリメラーゼの最大理論収量： T7、T3、SP6 - 2.64μgの</li><li class="none"> μg単位反応収率=（使用されるポリメラーゼの最大収率）X（取り込み） </li><li class="none"> 50nMの=（μgのRNA）/ 320 /（拠点におけるRNAの長さ）にRNAを希釈する/（5 × -8） </li><li class="none">反応は、通常利回り〜50 nmでRNAの50〜100μL。 </li></ul>

可視化rnaの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNAの局在は、細胞極性の確立に保存されたメカニズムです。 VG1 mRNAはアフリカツメガエルの卵母細胞と空間的にVG1蛋白質の遺伝子発現を制限する行為の植物極に局在化する。この方法でVG1分布の厳密な制御は、発生中の胚の適切な胚層の仕様が必要です。 mRNAの3&#39;UTRのRNA配列の要素は、VG1ローカライズ要素（VLE）は必須と直接輸送するのに十分です。 in vivoで VG1 mRNAの認識と輸送を調べるため、我々は、単純な視覚的な読み出しを経由してトランスファクター向けトランスポートメカニズムの広範な分析を可能にするイメージング技術を開発した。 RNAの局在を可視化するために、我々は、蛍光標識VLEのRNAを合成し、個々の卵母細胞にその写しを顕微注入する。注入されたRNAの輸送を可能にするために卵母細胞の培養後、卵母細胞は、前の共焦点顕微鏡によるイメージングに固定し、脱水です。 mRNAの局在パターンの可視化は、RNAのトランスポートの完全な経路を監視し、シス作用転写内の要素とVLEに結合するトランス作用因子のためにRNAの輸送を指示するの役割を識別するための読み出しを提供する（ルイスら、2008、 Messittら、2008）。我々は、追加のRNAやタンパク質（ギャニオンとモウリー、2009年、Messittら、2008）との共局在を介し​​てこの手法を拡張しており、モーター蛋白質の崩壊と細胞骨格との組み合わせで（Messittら、2008）プローブにmRNAの局在のメカニズム。

の可視化<em&gt; in vivoで</em&gt; RNAのトランスポートは、蛍光標識RNA転写物のマイクロインジェクションによってに行われます<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞、共焦点顕微鏡に続く。

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA局在化は、細胞極性を確立するための保存されたメカニズムである。Vg1 mRNAはアフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞の植物極に局在し、Vg1タンパク質の遺伝子発現を空間的に制限する役割を果たす。このようにVg1の分布を厳密に制御することは、発生中の胚において胚葉を適切に分化させるために必要である。mRNAの3' UTRにあるRNA配列要素であるVg1局在化要素（VLE）が、輸送を誘導するために必要かつ十分な条件となる。生体内でVg1 mRNAの認識と輸送を研究するため、我々は、単純な視覚的読み出しによってトランス因子による輸送メカニズムを広範に分析できるイメージング技術を開発した。RNAの局在化を可視化するために、蛍光標識したVLE RNAを合成し、この転写物を個々の卵母細胞に微量注入する。注入されたRNAが輸送されるまで卵母細胞を培養した後、共焦点顕微鏡でイメージングを行う前に、卵母細胞を固定および脱水させる。mRNAの局在パターンの可視化により、RNA輸送の完全な経路をモニタリングし、転写物内のシス作用要素およびVLEに結合するトランス作用因子がRNA輸送の誘導において果たす役割を特定するための読み出しが可能となる（Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008）。我々は、この技術をさらに拡張し、他のRNAやタンパク質との共局在化（Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008）、およびモータータンパク質や細胞骨格の破壊（Messitt et al., 2008）と組み合わせることで、mRNA局在化の根底にあるメカニズムを探索してきた。

本手順では、蛍光標識したRNA転写物をXenopus oocytesに注入し、その局在をモニタリングします。まず、RNAを蛍光ヌクレオチドで標識します。in vitro転写反応の後、RNAをマイクロインジェクション装置にロードします。卵母細胞をインジェクションディッシュに配置し、慎重にマイクロインジェクションを行います。最後に、共焦点顕微鏡でイメージングを行う前に、RNAの局在化が起こるように卵母細胞を培養します。こんにちは。ブラウン大学分子生物学・細胞生物学・生化学科のKimberly Mallory博士の研究室に所属しているJames Gagnanです。本日は、Xenopus卵母細胞におけるサブセルラーなRNA局在を可視化する手順について解説します。私たちの研究室では、脊椎動物の初期発生過程におけるRNA局在に必要なRNA構造およびタンパク質因子の研究にこの手法を用いています。それでは始めましょう。この手順を開始するには、付属の書面プロトコルに記載されている通り、放射性および蛍光の両方で標識されたmRNAを転写します。テンプレートDNAを分解するためにDNaseを加え、次にEDTAを加えて反応を停止させます。G 50カラムを用いてスピンし、未反応のヌクレオチドおよびその他の低分子を除去します。次に、エタノール沈殿によってRNAを濃縮し、洗浄して再懸濁します。シンチレーション計数法で濃度を測定した後、RNAを50 nMに希釈し、5 µLずつ分注して-80 °Cで保存します。マイクロインジェクションの準備ができたら、ラベル化されたRNAの1アリコートを解凍し、70 °Cで5分間変性させます。次に、室温のマイクロ遠心機を用いて最大速度で10分間遠心分離し、粒子状物質を除去して氷上に保持します。続いて、卵母細胞を単離するため、Xenopus laevisの卵巣の断片を、3 mg/mLの溶液25 mLが入った50 mLコニカルチューブに入れます。pH 7.4の0.1 Mリン酸カリウム緩衝液に含まれるコラゲナーゼ。バッチ間の変動があるため、18 °Cで穏やかに振盪してください。コラゲナーゼ処理時間は変動する可能性があるため、目視検査による慎重なモニタリングが必要です。脱葉を確実に行うため、卵母細胞が卵巣から明らかに分離するまで、あるいは15分間、振盪を続けてください。その後、卵母細胞をコニカルチューブの底に沈殿させます。溶液を除去し、MBSHバッファーで置換します。この操作を繰り返し、合計3回洗浄してください。次に、標準的な光学顕微鏡下で、ステージ3から4のCYTESとMBSHバッファーを分取します。ステージ3のcytesは完全に不透明ですが白色です。一方、ステージ4のcytesはわずかに大きく、色素の斑点が見られます。わずかに透明な卵母細胞は若すぎ、完全に色素沈着しているか、または色素分布に極性が見られる卵母細胞は成熟しすぎています。最後に、3.5インチのキャピラリーを延伸および面取りし、外径約0.05 mmの針を作成して、マイクロインジェクション用の針を準備します。mRNA、卵母細胞、および針の準備が整いましたら、マイクロインジェクションに進みます。まず、1回の注入あたり2 nmを投与するように、脱イオン水を用いて針の校正を行います。ガス制御式マイクロインジェクターを使用して針に充填し、マイクロメーターを用いて液滴サイズを校正します。校正後、注入するRNAを針にフロントロードします。次に、選別した卵母細胞をMBSH緩衝液が入った注入用ディッシュに配置します。このディッシュには黒色のフォームラバーの層が含まれています。白い卵細胞は黒い背景に対して非常によく見えます。次に、50 nanomolarのRNAを2 liters、各卵細胞に慎重に注入してください。各卵細胞への注入は必ず1回のみとし、注入完了後は針に詰まりがないか定期的に確認してください。残りのRNAを排出し、針を脱イオン水で洗浄してから、次に注入するRNAをロードします。注入後、注入済みの卵母細胞を滅菌済みの24ウェルプレートのウェルに移します。1ウェルあたり最大1,000個の卵母細胞を培養することが可能です。バッファーを除去し、1ウェルあたり400 µLのocyte培養培地と交換します。次に、培養中の湿度を維持するため、濡れたペーパータオルを入れたプラスチック容器に培養プレートを入れ、18 °Cで8時間から48時間の範囲の所定の期間、卵母細胞をインキュベートします。注入した卵母細胞のインキュベーション後、顕微鏡観察用の準備を行うことができます。死滅した卵母細胞を取り除き、生存している卵母細胞をガラスバイアルに入れる。通常、90%以上の卵母細胞の生存が観察される。バッファーをM-E-M-F-A固定液に交換し、細胞を20分間揺盪させる。固定期間の終了後、固定中の卵母細胞を日光から保護してください。固定液を除去し、等量のMBSHバッファーに置換することで卵母細胞を洗浄します。この洗浄をもう一度繰り返し、合計2回洗浄してください。次に、卵母細胞を無水メタノールで洗浄します。まず、液量の半分を取り除き、メタノールで置換します。この操作をさらに2回繰り返します。これらの洗浄後、溶液をすべて取り除き、メタノールに置換します。このメタノール洗浄をもう一度繰り返します。固定および脱水した卵母細胞は、イメージングの準備が整うまで-20 °Cで保存できます。イメージングの前に、ガラスボトムのWPIフルオロディッシュにMarie's clearing mediumを加え、イメージング表面を覆います。メタノールからフルオロディッシュへ、転送されるメタノールの量を最小限に抑えながら、慎重に卵母細胞を移します。倒立共焦点顕微鏡を用いて卵母細胞をイメージングします。Zeiss LSM 510およびLeica TCS SPの両方で良好な結果が得られます。ここで、マイクロインジェクション直後の細胞内RNA局在の代表的な画像を示します。蛍光標識したコントロールを8時間培養した後、核内に蛍光RNAが観察されます。RNAが卵細胞の細胞質に均一に分布している様子が確認できます。しかし、輸送装置をリクルートする配列を含む蛍光標識RNAは、卵細胞の植物極へと細胞内局在化する過程にあることが分かります。ここまで、蛍光標識RNAを卵細胞にマイクロインジェクションし、共焦点顕微鏡でRNAの局在化を観察する方法について説明しました。この手順を行う際は、培養液へのRNA混入を防ぐためにDEPC処理済みの溶液を使用し、抗生物質を含むOCMで卵母細胞を培養し、可能な限り卵母細胞を日光から遮光して光退色を防ぐことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています...

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。...

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

個々のGFPタグ付きタンパク質または構造体の自家蛍光ライブイメージングのためのプロトコル...

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

我々は、未受精卵の集合を記述する...

の生産<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em微小管関連RNAを識別するために、&gt;卵抽出

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

再現性をもって RNA の単一分子蛍光 in-situ 個々 卵母細胞における Mrna の数字をカウントするには、交配 (RNA 魚) 非付着性のセルの最適化を行った。卵子採取、トラン...

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus...

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。...

アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。...

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

我々は、初期胚発生における単一細胞における受精ゲノム活性化中の新生転写を可視化する方法を記述します。...

初期胚の単一細胞における接合ゲノム活性化の可視化

学ぶ蛍光標識RNAを用いたアフリカツメガエル卵母細胞におけるRNA局在の可視化法。共焦点顕微鏡で生細胞内のRNA動態をリアルタイムに観察し、RNA輸送メカニズムの解明に貢献します。

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

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