可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

この手順では、RNAを蛍光標識しました。転写産物はXUS Cytesに注入され、その局在が監視されます。まず、RNAを蛍光ヌクレオチドで標識します。

in vitro転写反応では、次にRNAをマイクロインジェクション装置にロードします。卵子を注射皿に載せ、丁寧にマイクロインジェクションします。最後に、卵子を培養して、共焦点顕微鏡でイメージングする前にRNAの局在化を行えます。

こんにちは、ブラウン大学の分子生物学・細胞生物学・生化学部のキンバリー・マロリー博士の研究室のジェームズ・ギャグナンです。本日は、Xap卵子における細胞内RNAの局在を可視化する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、脊椎動物の初期発生におけるRNAの局在に必要なRNAの構造とタンパク質因子を研究しています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、添付の書面によるプロトコルに記載されているように、放射性および蛍光標識されたmRNAを転写します。DSを添加してテンプレートDNAを分解し、EDTAを添加して反応を停止します。

取り込まれていないヌクレオチドやその他の低分子を、G 50カラムで遠心して除去します。次に、RNAをエタノール沈殿によって濃縮し、洗浄して再懸濁します。シンチレーション計数により濃度を決定した後、RNAを50ナノモルに希釈し、マイナス80°Cで5マイクロリットルのアリコートで保存します。

マイクロインジェクションを行う準備ができたら、標識されたRNAのEloquaを70°Cで5分間解凍します。その後、室温のマイクロ遠心分離機で最高速度で10分間回転し、微粒子を除去して氷上に保管します。次に、xapポストラヴ卵巣の細胞トリムピースを、1ミリリットルあたり3ミリグラムの25ミリリットルを含む50ミリリットルの円錐形の2つに分離します。

pH 7.4 の 0.1 モルリン酸カリウム緩衝液中のコラゲナーゼ。バッチ間の変動により、摂氏18度で静かに振ってください。コラゲナーゼの治療時間は異なる場合があり、目視検査を通じて注意深く監視する必要があります。

落葉を確実にするために、卵母細胞が卵巣から目に見える形で分離するまで15分間振とうし続けるために、卵母細胞が円錐管の底に落ち着くのを待ちます。溶液を取り外し、MBSHバッファと交換します。これを繰り返し、さらに2回洗って合計3回洗います。

次に、ステージ3から4のCYTESおよびMBSHバッファーを標準的な光学顕微鏡で手動で選別します。ステージ3の細胞は完全に不透明ですが、白です。一方、ステージ4の細胞はわずかに大きく、色素が斑点があります。

わずかに透明な細胞は若すぎ、完全に色素沈着している細胞や偏光した色素分布を示す細胞は古すぎます。最後に、3.5インチのキャピラリーを引っ張って面取りし、外径約0.05ミリメートルの針を作製して、マイクロインジェクション用の針を準備します。mRNAの卵子と針の準備ができたので、マイクロインジェクションに進みます。

まず、注射液で針をキャリブレーションし、注射1回あたり2ナノメートルの注入を行います。前線。ガス制御マイクロインジェクターを使用して針をロードし、キャリブレーション後にマイクロメーターを使用して液滴サイズをキャリブレーションします キャリブレーションは、針に注入するRNAをフロントロードします。次に、選別した卵子を注射皿に置きます MBSHバッファーでは、皿には黒い発泡ゴムの層が含まれています。

白いサイトは黒い背景に対してよく目立ちます。次に、各卵子に50ナノモルで2リットルのRNAを慎重に注入します。各卵子は一度だけ注入し、注入が完了したら定期的に針の詰まりをチェックしてください。

残りのRNAを排出し、針をデシ水ですすぎ、次のRNAを注入用にロードします。注射後、注入した細胞を滅菌済みの24ウェルプレートのウェルに最大1,000個移します。CYTESはウェルごとに培養できます。

バッファーを取り外し、ウェルあたり400マイクロリットルの細胞培養培地と交換します。次に、培養プレートを湿ったペーパータオルでプラスチック容器に入れて、培養中に湿った環境を維持し、卵子を摂氏18度でインキュベーションします。これは、所望のインキュベーション期間から8時間から48時間後の時間です。卵子は、注入された卵子のインキュベーション後に顕微鏡検査用に調製することができます。

死んだ卵子を選別し、生き残った卵子をガラス瓶に入れます。卵子の90%を超える生存が日常的に観察されています。バッファーをM-E-M-F-A固定液に交換し、細胞を20分間揺とうします。

固定期間終了後、固定中は卵子を日光から保護してください。固定液を取り除き、等量のMBSHバッファーと交換して卵子を洗浄します。この洗浄をもう一度繰り返して、合計2回の洗浄を行います。

次に、卵母細胞を無水メタノールに洗浄します。まず、ボリュームの半分を取り除き、メタノールに置き換えます。これをさらに2回繰り返します。

これらの洗浄後、すべての溶液を取り除き、メタノールと交換します。このメタノール洗浄をもう一度繰り返します。固定卵子と脱水卵子は、画像化の準備が整うまで摂氏マイナス20度で保存できます。

イメージングする前に、ガラス底のWPIフルオロ皿にMarie's Clearingメディウムを加えて、イメージング面を覆います。メタノールからフルオロ皿に卵子を慎重に移し、メタノールの転送量を最小限に抑え、倒立共焦点顕微鏡で卵子を画像化すると、Zeiss LSM five 10とaica TCSs Pの両方で良好な結果が得られます。次に、マイクロインジェクション直後の細胞内RNA局在の代表的な画像をいくつか示します:蛍光標識コントロールの培養8時間後に核内で蛍光RNAが見られます。

RNAは卵母細胞の細胞質に均一に分布しているのがわかります。しかし、輸送機構を動員する配列を含む蛍光標識されたRNAは、卵母細胞の植物極への細胞内局在の過程で見ることができます。蛍光標識されたRNAをzapサイトへのマイクロインプットと、共焦点顕微鏡によるRNAの局在観察の方法を紹介しました。

この手順を行うときは、デシ処理された溶液を使用して、培養物へのRNA汚染、抗生物質を含むOCM内の細胞、および光の漂白を避けるために可能な限り日光から細胞を保護することが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。