Flashは、E12.5マウス脳の凍結とCryosectioning

こんにちは、カリフォルニア大学アーバイン校のスペンサー・カーリーとエド・マキの研究室で、クライオセクショニングの方法を実演します。そのために、私はまずこれらの一般的に使用される試薬を使用します。私が使用する埋め込みコンパウンドまたは埋め込みメディアは、最適な切断温度のためにOCTと呼ばれます。

それは透明な解決策であり、非常に厚くて粘性があり、組織をうまく保持しながら組織を向き合わせることができ、その後凍結し、最終的には水溶性であるため、あらゆる種類の染色手順でそれを取り除くことができます。そこで、ティッシュを型に埋め込みます。これらのクライオモールド生検容器には、さまざまなサイズがあります。

ここでは、マウスの胚組織を作るため、この小さい型を使用します。ティッシュと液体窒素を急速冷凍します。そこでまず、この保護用真空フラスコに、ここのタンクから液体窒素を入れます。

組織を急速凍結する前に、組織を凍結保護する、さもなければ凍結自体が組織を破壊する。つまり、組織を30%ショ糖溶液に一晩沈めるのです。そして、それ以上かかる場合でも、組織が沈む限り、それは問題ありません。

そして、ご覧の通り、ビザの胚12.5日目のマウスの頭は、ショ糖溶液に沈んでいるので、冷凍する準備ができています。だから今、私は単にショ糖溶液にある組織をより大きな皿に注ぎ、組織を操作できるようにします。このOCTの一部を、実際に蓋の上に置かれているこの35ミリの皿に注ぎ、斜めに取り込むことができます。

そのため、OCTは深さのためにエッジに沿ってプールされます。だから私は単にあなたが鋭利である必要がない、そして鉗子の別のペアを台無しにしたくないという理由だけで、古い鈍い鉗子のペアを使用しています。そこで私は、それらを受け取り、これらの頭の一つを非常に優しく持ち上げて、OCTの最初の浴槽に入れます。

私はただOCTで胚をコーティングしたいだけです。これにより、組織の凍結がより良く、より均一になります。組織の周りにスクロースが残ったり、気泡が溜まったりするのは避けたいものです。

気泡は絶対に避けてください。そこで、OCTを頭の周りや下で優しくかき混ぜ、頭を動かし、OCTを通して動かし、クライオ型を埋める間、数秒間そのままにしています。だから今、私は再び気泡を避けて、クライオットでクライオットを充填するつもりです。

そして、私はそれを型の上部まで埋めるつもりです。そして、お気づきのように、私は型にラベルを付けました。だから、私はそれが凍結された後に私の向きを見ることができるでしょう。

OCTが凍結すると、OCTは白くなり、ティッシュが見えなくなります。したがって、あなたは間違いなく油性マーカーでラベルを付けたいです。それは、クライオモールドです。

実はOCTで泡が出てしまったので、鉗子を使って端から押し出します。それがあなたの組織や組織の凍結を妨げることは望ましくありません。だから今、私はこの皿から私の型にあるOCTにヘッドを移すつもりです。

皿から持ち上げて、とても優しく型に入れます。次に、顕微鏡に行き、そこで組織の向きを合わせます。ここにクライオ型のティッシュがあるので、スコープを覗いて向きを変えます。

私はこのマウスの頭を通して冠状切片を行うつもりです。そのため、コロナ切片のクライオスタットに配置できるように、向きを変える必要があります。だから、繰り返しになりますが、私はこれらの古い鈍い鉗子を使用しています、そして、あなたが見ることができるように、ここにいくつかの泡があり、私はそれらを取り除くために最善を尽くすつもりです。

しかし、これらの小さな泡は悪くありません。私はこれらの小さな泡で何も気づきませんでした。大きな泡は必要ないだけです。

だから、私はただできる限りそれらをすくい取り、間違いなく頻繁に鉗子を拭くつもりです。そして今、私のラベルをご覧いただけると、ここの上部にt、左にFがあります。それは、頭、頭のてっぺんが上になり、正面または顔が私の左側になることを示しています。

そうすれば、冠状切片のためにどの表面を切片にするかがわかり、組織をつまむだけです。また、気泡が発生することもありますが、それは単にティッシュと一緒に凍らないように押し出したいだけです。ですから、泡があるのは悪いことです、主に凍結しているとき、組織の泡があなたを不安定に凍結させる可能性があるためです。

急速冷凍の目的は、すべてを一度に凍結することです。また、組織やクライオスタットを切断する際に、ブレードがOCTや組織ではなく気泡を通過すると、引っ掛かったり裂けたりして、組織を破壊したり、壊れたりする可能性があります。だから、あなたは絶対にこれらの泡として絶対に避けたいです。

特に大きいものは。だから、私はまだここでそれを方向付けています。このティッシュは24時間固定されているので、私の操作にはかなり頑丈です。

他のティッシュは少し柔らかいかもしれないので、あなたはただとても優しくしたいだけです。したがって、顔を左に、頭のてっぺんを上にしてスコープの下に配置したら、他の向きの平面でも正しいことを確認する必要があります。そこで、立方体のすべての面を持ち上げて調べ、正しいことを確認します。

そして、少し下に角度がついているのがわかるので、鉗子で持ち上げるだけです。大丈夫です。そして、これには間違いなく多くの練習が必要です。なるほど、良さそうですね。

さて、ここを歩いて、液体窒素で凍らせます。さて、組織がクライオ型に適切に配置されたので、ここでこの皿に液体窒素を注ぎます。これは、上部まで組織培養用の通常のプラスチック製のペトリ皿です。

それはかなり速く蒸発します。鉗子を持って、クライオ型を下げます。そして、ご覧の通り、実は下唇を曲げてしまいました。

これにより、間違いなくより良い、より良いハンドリングが可能になります。冷凍します。そして、組織とOCTが凍結すると、白一色に変わります。

そして、完成すると、すべてが白くなります。そして、冷凍ティッシュをマイナス80度の冷凍庫にすばやく入れて保存する必要があります。あなたは、組織が水没しないようにそれを保持したいです。

ですから、液体窒素の上面に保持するためだけには非常に注意する必要があります。さて、これで冷凍です。マイナス80度に行く前に、さらに数秒間そのままにしてください。

さて、今度はマイナス80度まで下げます。そこで、マイナス80度からティッシュを取り出して、このクライオスタットに入れました。チャンバーは実際には摂氏マイナス24度まで下がっています。

現在、切片化を開始する前に、組織を約30分から1時間平衡化させる必要があります。そうでなければ、それはあまりにも脆いです。したがって、すべてのクライオ統計は異なりますが、ここではこのマシンに関する基本的なことのいくつかを指摘します。

そこで、ライカCM 30 50 sを使用します。これは、試料自体のための独立した冷却ユニットを備えているため、優れた機械であり、これは素晴らしい追加の利点です。試料の温度を設定することができ、組織ごとに異なる切断に必要な温度があります。

そのため、初めてティッシュをセットするときは、いくつかの調整を行う必要があります。そして、これらはすべてのクライオ統計で同様です。これらは電子機器であり、一部は手動操作です。

たとえば、クライオスタットのアームを引っ込めたり、前進させてブレードに近づけたり配置したりする必要があります。それは速くも遅くもできます。ここでは、このプラスまたはマイナスで、カットの厚さを設定できます。

また、トリムまたはセクションの厚さを選択しますが、これはここの中央のボタンで示されています。チャンバーまたは試料自体の温度をこのデジタルディスプレイの隣に設置するには、これを押して上矢印または下矢印を使用して温度を調整するだけです。ですから、私たちにとっては、クライオセクショニングを行うときは、これらのフィッシュフィッシャーブランドのスーパーフロストと顕微鏡スライドを使用します。

それらは、処理中の組織が剥がれないように、いくつかの接着剤でコーティングされています。切片化中に、組織が少し柔らかく見えることに気付くことがありますが、それはブレードに当たって束になった場合です。そして、それを修正するために使用できるのは、このフィッシャーブランドの超フレンドリーなフリーズです。

それは、ティッシュを瞬間凍結させ、それをティッシュに向けてトリガーを押すだけで、柔らかすぎる場合はティッシュをすぐに再凍結します。切片化のために組織をチャックに取り付ける前に、ここでマシン内のいくつかのものを簡単に紹介したいと思います。これが実際にブレードを装填する場所であり、ブレードはこの金属プレートで固定されています。

このアームを引き上げることで、必要に応じて実際にブレードを取り外したり交換したりすることができます。それが素晴らしくて安全であることを確認してください。ブレードを固定しすぎると、実際に歪んでしまいます。

そして、切片化では、組織の厚さが一貫していないことに気づくでしょう。だから、この腕を奥まで押し下げたくないのです。あなたはそれをただそれが何であるかに持って行きたいです、たとえブレード自体であっても。

これは、セクショニング中に調整する必要があるかもしれない別のことです。それはアンチロールプレートと呼ばれています。これは、このホルダーに収まるガラス片で、このバネ仕掛けのネジを使用して調整できます。

そして、基本的には前後に動かすのです。これにより、ティッシュや切片が平らに保たれ、スライドに取り付けることができます。セクショニング中に調整したいもう1つのことは、実際に切断を行っているブレード上の場所です。

では、どのように調整すればよいのでしょうか、つまり、このレバーを持ち上げるだけで、この装置全体を左右にスライドさせることができます。そして、あなたがあなたのティッシュがブレードの特定の部分に引っ掛かっていることに気付いた場合、またはブレードがかなり高価であるため、ブレードを節約したい場合にのみ、それを実際に使用します。だから、これを前後に動かすだけできれいな場所を見つけることができます。

もう一つ調整できるのは、カットの角度です。さて、ここの側面には見えませんが、3つの異なる位置があります。中央の位置を使用するだけで、この他のレバーを持ち上げて調整します。

そして、それも可能ですが、この仕掛けを上下させることができます。私たちは常にそれを真ん中に保ちます。だから、今はそれを維持するつもりです。

つまり、ここにあるのがクライオスタットのヘッドです。凍結組織標本が切片化されている間、実際に保持されます。上下に振り回し、刃に向かって進みます。

基本的には、このチャックにティッシュを取り付け、チャックをヘッドに入れて締め、後ろのノブで角度を調整してまっすぐにカットします。では、ティッシュをチャックに取り付けます。チャックを室温に保つのは、最初にOCTの層を追加するためであり、それがすぐに凍結しないようにするため、きれいな平らな層にしたいからです。

そして、ここではこの装置を、ヒートエクストラクターと呼ばれるものに使用します。実際には、OCTが凍結するときに平らにするために使用されます。そこで、まず私が行うことは、室温チェックを行い、それをこのホルダーに入れることです。

私のOCTバブルをいくつか取ります。ここでは関係ありません、なぜなら彼らは絞り出されるからです。aを少し追加するだけで、多くは必要ありません。

ヒートエクストラクターを手に取り、そこに座ってください。数秒待ちます。そして、OCTが素晴らしく平らであることがわかります。

さて、ティッシュが手に入ったので、実際のOCTをマークする必要があります。さて、OCTの位置を示すために、OCT上のポイントをマークします。そこで、上部に青い点をマークしました。

では、ティッシュの塊を型から取り出し、その裏側を押すだけでそれを行います。だから、背中を優しく押して、ただ手に押し込むだけなのですが、やはり、解凍してほしくないんです。だから、すぐに元に戻しました。

だから今、あなたは、ティッシュのブロックと、私がそれに付けた青いマークを見ることができます。だから、それが胚の頭のてっぺんだとわかっています。そして、これらは冠状切片であるため、顔を切開したいと思います。

そこで、私が何をするかというと、OCTAの大きな液滴をもう一滴追加しますが、すべてが寒いので、今すぐ迅速に行動する必要があります。そして、ティッシュを取って真ん中に置き、すでに作られたOCTのベッドに対して平らであることを確認します。さて、それを凍らせるだけで、1分か2分ほどかかります。

これで冷凍が終わりました。そして、チャックに取り付けられているティッシュを頭に取り、できるだけまっすぐにしてから締めます。それはできます、それは素晴らしくてタイトです。

ブレードのすぐ前に置き、次に進めますが、これには数秒かかる場合があります。さて、今度はブレードの平らな端を使って、ティッシュの細かい位置決めを実際に行います。だから、私はただ、私はただ、私は、エッジを見て、ティッシュを上下に振って、エッジが揃っていることを確認します。

もし彼らがそうしていなかったら、こんな風になっていたかもしれません。明らかに誇張していますが、ここでは、ブレードに対してまっすぐではないことがわかります。だから、できるだけまっすぐだと感じるまで、調整を続けるだけです。

それはかなり良いことだと思います。ですから、あらゆる角度から見て、ティッシュがブレードに対してまっすぐに切断され、ブレードの端を使用してそれを示します。だから、上を見て、横から見ていると、ティッシュは実際にはかなり良く見えます。

あまり調整する必要はありませんが、もし調整するなら、後頭部にあるノブを使うだけです。そして、それらを左に回したり右に回したりすることで、そのように微調整ができることがわかります。しかし、それはかなり良さそうです。

今、私は、実際に組織を前進させています。それは、刃に当たっていないので、まだ切れていないということです。組織はOCTの奥深くに埋め込まれています。

そのため、組織に到達するまでに数分かかる場合があります。速すぎるとOCTや組織に引っ掛かって割れる可能性があるため、あまり速く進むのは避けたいものですが、永遠に時間がかかる可能性があるため、遅すぎるのも避けたいものです。このマシンには、厚い部分でトリムを行うことができる便利な機能が1つあり、これによりより速く進むことができます。

だから今、私は実際に、OCTをカットしているので、少しペースを落としています。ですから、まだ組織にはたどり着いていませんが、これは切片がどのように進むかを評価する時間です。多くの変数が、あなた、あなたの組織切片化を本当にうまくいくか、または本当にひどく進む可能性があります。

このクライオスタットで最も頻繁に起こるのは、実際には組織が少し冷たすぎるということです。温度を下げたのですが、それでも少し寒すぎるようです。そして何が起こるかというと、ブレードは、組織を通して、またはOCTを通して、チャタリングします。

ですから、これらの小さな線、これらの水平線は、OCTを通じて取得されます。私がやっていることは、親指を取って、エッジを温め、OCTにそっと触れるだけでOCTを温め、親指を滑らせるだけで、それほど長くはしません。そして、それを切ってみると、彼らがずっと良く出て、おしゃべりが止まっていることに気づきました。

ですから、このようなことは、組織に到達する前に評価します。そこで、ブレードが組織を通過すると、実際にはOCTに引っ掛かりや亀裂が発生することに気づきました。ですから、私が最初に行うことの1つは、ブレードを交換することです。

このブレードがここにどのくらい置かれていて、私の前に誰が使っていたのかわからないので、新しいブレードを取り出すだけです。これらは明らかに非常に鋭いので、注意が必要です。そこで、アンチロールプレートを調整するのですが、底にバネ仕掛けのネジがあり、下に手を伸ばすだけで出し入れすることができます。

だから、私は十分に前進し、切片化したので、今では組織に夢中になっています。そして残念ながら、OCTのブロックには亀裂があり、これは頻繁に発生し、残念ながらそれを実際に制御することはできませんが、それを修正するためにできることはあります。亀裂が組織を貫通していた場合は、サンプルを廃棄するか、できる限りのことを回収しようとする必要があります。

この場合、亀裂は組織の上にあるようです。そこで、私がやろうとしていることは、クライオスタットに入っていたカミソリの刃を取ることです。それは、冷えています。

そして、OCTブロックの上部にあるひびの入った部分を切り取ってみます。そこで、もう一度、親指を使ってOCTブロックの面を加熱します。そして、セクションスルーを行いますが、ここで見ることができる場合は、ひびが入っています。

そこで、ティッシュと一緒にピースをはがし、次に投げたばかりのOCTの残りの部分、それはひびの入った部分でした。そこで、私がやろうとしていることは、冷やしたカミソリの刃を使ってそのひび割れた部分を切り落とそうとすることです。私は非常にまっすぐに入らなければならず、両手を使ってブレードに均等に圧力をかける必要があります。

そして、OCTに向かってブレードを前後に揺らします。だから、前後に揺れながら、OCTにゆっくりと切り込み

さて、この余分なOCTを取り除くことで削減します。次に、ブレードに引っかかる可能性のあるエッジを作成しているため、ヘッドを少し引っ込めます。そうなると、実際にOCTと組織が壊れてしまい、サンプルが台無しになる可能性があります。

だから引っ込めたので、組織に戻るにはもう少し進める必要があり、うまくいけば亀裂を修正できたと思います。さて、今、私はティッシュに戻ります。さて、それは私が見たようです、私はそれを修正しました。

そのため、OCTに亀裂が入ることがなくなり、セクションのキャプチャがはるかに簡単になります。では、ここからは、私が興味のある組織の部分に進みます。今、私は、ちょうど今、表面にぶつかっているところで、この胚の脳に入り込みたいと思っています。

これらは、私が興味を持っている構造を実際に見ることができるほど十分に大きいです。私はこれらのブラシを使用して、キャプチャする各セクションの間のブレードをきれいにしていることは言及しませんでした。この大きなものは、エリアを掃除し、余分なooc OCTを取り除くためだけのものです。

また、これらの細かいブラシを使用して、このコールドプレートに対してセクションを操作し、セクションにキャプチャするときに配置します。繰り返しになりますが、これらは冷たく保たれているため、OCTが溶けてブラシに付着することはありません。そこで、組織をキャプチャするために、まずOCTとティッシュを親指で加熱します。

そして、すでにラベルを付けたこれらのスライドの1つを取ります。私はそれを逆さまに持ちますが、これは人によってやり方が違います。しかし、私のやり方は、スライドが右手で下を向いているときに、この右上隅を保持するのが好きです。

次に、左手の親指をピボットポイントとして使用して、プレートに対してまっすぐ下に降りてセクションをキャプチャできるようにします。OCTと組織は実際にスライドに対して溶けて、それ自体が取り付けられます。そこで、まず親指でティッシュを温め、スライドをつかみ、右手で右角を持ち、プレートを動かし、まっすぐ下に下げて溶かします。

ティッシュを見て、折り目や気泡がなく、見栄えがすることを確認します。そして、脳全体を切開するまで、これを続けます。私は今、解剖スコープを通じてセクションを見て、それらが見栄えがよく、セクションの上部にある前脳が見え、すべてが非常にきれいに見えることを確認します。

これらのクライオ切片は、in situハイブリダイゼーションなどに使用できます。基本的な組織学、hおよびe染色を行うこともあります。また、免疫蛍光法も行うことができますし、そのようなアッセイは数多く行われています。

特に私にとっては、これらの切片はin situハイブリダイゼーションのために固定され、処理されました。というわけで、次はそういうことをやっていきます。