Flashは、E12.5マウス脳の凍結とCryosectioning

こんにちは。カリフォルニア大学アーバイン校のEd Maki研究室のSpencer Curleyです。今回はクライオセクショニング（凍結切片作成）の方法について実演します。まず、一般的に使用される以下の試薬を用います。埋設剤（埋込剤）として使用するのは、OCT（Optimal Cutting Temperature compound）です。

これは透明な溶液で、非常に粘度が高く、組織を固定しながら向きを調整でき、その後凍結させることができます。最終的に水溶性であるため、どのような染色手順においても除去することが可能です。そこで、組織をモールドに埋入します。これらのクライオモールド生検容器には、さまざまなサイズがあります。

マウスの胚組織を使用するため、ここではこの小型のモールドを使用します。組織は液体窒素で急速凍結させます。まず、こちらのタンクからこの保護真空フラスコに液体窒素を満たします。

組織を急速冷凍する前に、「凍結保護」と呼ばれる処理を行う必要があります。そうしないと、冷凍そのものによって組織が破壊されてしまいます。具体的には、組織を30% sucrose溶液に一晩浸し、沈ませます。さらに時間がかかっても問題ありませんが、必ず組織が沈むまで浸してください。

ご覧のように、胚齢12.5日のマウスの頭部はスクロース溶液に沈んでおり、凍結の準備が整っています。それでは、組織を操作しやすくするため、スクロース溶液に入っている組織をより大きなディッシュに移します。次に、OCTを少量取り、蓋の上に置いて傾斜させた35 mmディッシュに注ぎます。

OCTが深さを出すために端に溜まるため、ここでは、鋭利である必要がなく、また他のピンセットを台無しにしたくないため、あえて先の丸い古いピンセットを使用しています。ピンセットを用いて、これらの頭部のうち1つを非常にゆっくりと持ち上げ、最初のOCTバスに入れます。

胚をOCTでコーティングします。これにより、組織をより良好かつ均一に凍結させることができます。組織の周囲にスクロースが残留したり、気泡が入ったりしないようにしてください。

気泡が入らないように十分に注意してください。OCTを頭部の周囲と下でゆっくりとかき混ぜ、頭部をOCTの中で動かしながら、クライオモールドを満たすまでの数秒間そのままにしておきます。それでは、ここから気泡が入らないように注意しながら、クライオモールドにOCTを注ぎます。

そして、モールドの上端まで満たします。お気づきの通り、モールドにラベルを貼っていますので、凍結後でも向きがわかるようになっています。

OCTが凍結すると白くなり、組織が見えなくなります。そのため、クライオモールドには必ず油性マジックでラベルを貼ってください。

実際、OCTの中に気泡が入ってしまったので、ピンセットを使って縁から押し出します。気泡があると組織の凍結に影響が出るため、避ける必要があります。それでは、このディッシュから、モールドに入っているOCTの中へ頭部を移します。

組織をディッシュから慎重に持ち上げ、モールドに静かに配置します。次に、顕微鏡へと移動して組織の方向を調整します。ここにクライオモールドに入れた組織がありますので、顕微鏡で観察しながら方向を合わせます。

このマウスの頭部を冠状断で切断します。そのため、冠状断切片を作成するためにクライオスタット内で適切に配置できるよう、向きを調整する必要があります。ここでも、この先端が丸いピンセットを使用します。ご覧の通り、ここに気泡があるため、できる限りこれらを取り除きます。

しかし、これらの小さな気泡は問題ありません。小さな気泡については、特に影響は見られませんでした。避けるべきなのは大きな気泡です。

ですので、できる限り慎重にずらして出していきます。また、気泡の発生を防ぐため、ピンセットはこまめに拭き取ってください。さて、ラベルを確認していただくと、上側に「T」、左側に「F」とあります。これは、頭頂部を上に、顔面を左側にするという意味です。

そうすることで、冠状断（コロナール断面）を作成する際にどの面から切断すべきかが分かり、組織を軽く押し出すことができます。また、この操作で気泡が入ってしまうことがありますが、組織と一緒に凍結されないよう、気泡を押し出して取り除く必要があります。気泡が残っていると、凍結時に組織内で不均一な凍結が起こる可能性があるため、好ましくありません。

急速冷凍の目的は、すべてを同時に凍結させることです。また、クライオスタットで組織を切断する際、ブレードがOCTや組織ではなく気泡に入り込むと、引っ掛かりや裂け目が生じ、組織が破壊されたり損傷したりすることがあります。そのため、どのような状況でも気泡の混入は絶対に避けなければなりません。

特に大きな組織についてです。ですので、ここで向きを調整しています。この組織は24時間固定されているため、操作してもかなり安定しています。

他の組織は少し柔らかい場合があるため、非常に慎重に扱う必要があります。まず、顔を左に向け、頭頂部を上に配置して顕微鏡下にセットしたら、他の方向の平面においても正しく配置されているかを確認します。そのため、キューブのすべての面をリフトして確認し、正しい向きであることを確かめます。

わずかに下向きに傾いているのが見えますので、ピンセットで持ち上げる必要があります。いいですね。これにはかなりの練習が必要です。よし、うまくいきました。

それでは、こちらに移動して、液体窒素で凍結させます。組織がクライオモールドの中で適切に配置されましたので、このディッシュに液体窒素を注ぎます。これは組織培養用の一般的なプラスチック製ペトリ皿で、上端まで満たします。

かなり早く蒸発します。ピンセットを使ってクライオモールドを下げます。ご覧の通り、底辺のリップ部分を実際に曲げてあります。

これにより、間違いなくより適切な取り扱いが可能になります。これを凍結させます。組織とOCTが凍結するにつれて、色は不透明な白に変化します。

完了すると、全体が白くなります。その後、凍結させた組織を速やかに-80°Cのフリーザーに入れて保存します。組織が浸からないように保持してください。

したがって、液体窒素の表面にのみ浸かるように非常に注意して保持してください。これで凍結しました。-80°Cのフリーザーに移す前に、そのまま数秒間保持します。

それでは、これを-80°Cに移動させます。-80°Cから組織を取り出し、こちらのクライオスタットに設置しました。チャンバー内は実際に-24°Cまで下がっています。

組織を薄切し始める前に、30分から1時間ほど放置して平衡化させる必要があります。そうしないと、組織が脆くなりすぎます。クライオスタットは機種によって異なりますが、ここではこの装置の基本的な機能について説明します。

ここではLeica CM 30 50 sを使用します。この装置は、試料自体のための独立した冷却ユニットを備えており、それが大きな利点となっています。試料の温度を設定することができ、組織の種類によって、切片作成に適した温度が異なるためです。

組織を最初にセットする際、いくつかの調整を行う必要があります。これらの調整方法は、すべてのクライオスタットで同様です。電子的に操作するものもあれば、手動で操作するものもあります。

例えば、クライオスタットのアームを後退させるか、前進させて、刃から離したり近づけたりして位置を調整する必要があります。これは、速く、あるいはゆっくりと行うことができます。また、こちらのプラスおよびマイナスボタンで、切片の厚さを設定できます。

中央にあるボタンで、トリミングまたは切片の厚さを選択します。次に、デジタルディスプレイの横にあるボタンを押し、上下の矢印を使用して温度を調整することで、チャンバーまたは試料自体の温度を設定します。なお、当研究室で凍結切片を作成する際は、FisherブランドのSuperfrost Plus顕微鏡スライドを使用しています。

組織が処理中に剥がれないよう、接着剤がコーティングされています。セクショニング中に組織が少し柔らかいと感じることがあり、ブレードに当たって組織が凝集する場合などがその兆候となります。これを解決するために、FisherブランドのSuper Friendly Freezeを使用することができます。

これは組織を急速凍結させるもので、組織に向けてトリガーを押すと、組織が柔らかすぎる場合に素早く再凍結させることができます。切片作成のために組織をチャックに固定する前に、装置のいくつかの箇所について簡単に説明します。ここが実際にブレードを装着する場所で、この金属プレートで固定されています。

このアームを引き上げることで、必要に応じてブレードを取り外したり交換したりすることができます。しっかりと固定されていることを確認してください。ただし、ブレンドを締めすぎないように注意してください。締めすぎると、ブレードが歪む原因となります。

切片を作成すると、組織の厚さが一定でないことに気づくはずです。そのため、このアームを完全に下まで下げないようにしてください。ブレード自体の高さとほぼ同じ位置に合わせるようにします。

これは、切片作成中に調整が必要になる可能性があるもう一つの項目です。アンチロールプレートと呼ばれます。これはこちらのホルダーに装着するガラス板で、こちらのバネ付きネジを使用して調整できます。

基本的には、これを前後に動かします。そうすることで、組織や切片が平らに保たれ、スライドグラスに貼付することができます。また、切片作成中に調整したい点として、刃の実際に切断を行っている位置もあります。

調整方法は簡単で、このレバーを持ち上げれば、装置全体を左右にスライドさせることができます。これは、組織がブレードの特定の箇所に引っかかっていることに気づいた場合や、ブレードが高価であるため節約したい場合にのみ使用します。このように前後に動かすことで、適切で清潔な領域を見つけることができます。

調整可能なもう一つの項目は、切断角度です。こちら側面（見えない位置にあります）に3つの異なるポジションがあります。通常は中央のポジションを使用し、もう一方のレバーを持ち上げて調整します。

また、この装置は上下に動かすことができます。通常は常に中央に保持しますので、今回はそのままにしておきます。

こちらにあるのがクライオスタットのヘッドです。ここでは、切片を作成する際に凍結組織標本を保持します。これは上下に可動し、ブレードに向かって前進します。

基本的には、ここに組織をチャックに取り付けます。チャックをヘッドに装着して固定し、背面にあるノブを使用して角度を調整することで、より直線的に切断できるようにします。それでは、組織をチャックに取り付けます。まずOCTを一層加えますが、それがすぐに凍結すると平坦な層にならないため、チャックは室温に保つようにしてください。

そして、こちらの装置を使用します。これはヒートエクストラクター（熱抽出器）と呼ばれるものです。実際には、OCTが凍結する際に平坦にするために使用されます。まず、室温のチェックを取り出し、このホルダーにセットします。

OCTバブルを少量取ります。ここでは後で押し出されるため、量は重要ではありません。少 amount、多くは必要ありませんので、少量だけ加えてください。

ヒートエクストラクターを取り出し、そのままそこに設置します。数秒間待ちます。すると、OCTが平らに広がっているのが確認できます。

組織を用意しましたので、OCT（最適埋込剤）の正確な位置をマークします。OCTの上に点を打ち、位置を示します。このように、上部に青い点でマークしました。

それでは、組織ブロックを型から取り出します。型の背面を軽く押すことで取り出すことができます。背面にそっと力を加え、手のひらに押し出しますが、ここでも融解させないように注意してください。そのため、すぐに（冷凍庫に）戻します。

このように、青い印を付けた組織ブロックを確認できます。これにより、ここが胚の頭部の頂端であることがわかります。今回は冠状断面を作成するため、顔面部分で切断します。

次に、OCTの大きな液滴をもう一滴加えます。すべてが冷えているため、迅速に作業する必要があります。組織を取り出し、すでに作られたOCTの層の中央に、平らに密着するように配置します。このまま1〜2分ほどかけて凍結させます。

これで凍結が完了しました。チャックに装着した組織をヘッドにセットし、できるだけまっすぐに合わせてから、しっかりと締め付けます。

ブレードのちょうど前に配置し、そこからゆっくりと進めます。これには数秒かかる場合があります。次に、ブレードの平らなエッジを使用して、組織の微細な位置調整を行います。エッジを確認しながら、組織を上下に動かし、端が正確に揃っているかを確認します。

もしそうでなければ、このように見える可能性があります。もちろん大げさに表現していますが、ここでブレードに対して直線的に当たっていないのがわかります。そのため、最大限に直線的になると感じるまで、調整を繰り返します。

これで十分だと思います。したがって、組織が刃に対して真っ直ぐに切断されることを確認するために、あらゆる角度から確認し、刃の端を指標にしてそれを判断します。上方と側面から確認していますが、組織の状態は非常に良好に見えます。

多くの調整を行う必要はありませんが、もし調整が必要な場合は、ヘッドの背面にあるノブを使用します。これらのノブを左または右に回すことで、微調整ができることがわかります。現状では十分に見えています。

現在、組織を前進させています。まだ刃に接していないため、切断はされていません。組織はOCTの中に深く包埋されています。

そのため、組織に到達するまで数分かかる場合があります。速すぎるとOCTや組織に引っかかって割れる可能性があるため避けなければなりませんが、一方で遅すぎても時間がかかりすぎてしまいます。この装置には、より厚いセクションでトリミングを行うことができる便利な機能があり、これを利用することで作業速度を上げることが可能です。

現在、OCTを切り進めており、少し速度を落としています。まだ組織には達していませんが、この段階でセクショニングがどのように進むかを確認します。多くの要因によって、組織のセクショニングの結果が非常に良くなることもあれば、非常に悪くなることもあります。

このクライオスタットで最も頻繁に起こると感じているのは、組織が実際には少し冷えすぎていることです。温度を下げましたが、それでもまだ少し低すぎるようです。その結果、ブレードが組織やOCTの中でチャタリングを起こしてしまいます。

すると、OCTの中に小さな水平線のような線が入ります。そこで私は、親指でOCTの端を軽く触れて滑らせるようにし、短時間で緩やかに温めます。そうして切片を作成すると、状態が大幅に改善され、チャタリングが止まることがわかりました。

したがって、組織の切削に移る前に、これらの点を確認します。刃が組織を通過する際、OCTに引っかかり、あるいは亀裂が生じていることに気づきました。そのため、まず最初に行うことの一つが刃の交換です。

この刃がどのくらいの期間使用されていたか、また私の前に誰が使用したか不透明であるため、新しい刃に交換します。言うまでもなく、これらの刃は非常に鋭いため、注意が必要です。次にアンチロールプレートを調整します。底面にあるバネ付きのネジを下に伸ばして操作することで、プレートを内側または外側に移動させることができます。

組織に到達するまで十分に切り出しと薄切を行いました。あいにく、OCTコンパウンドのブロックに亀裂が入っています。これは頻繁に起こることで、残念ながら完全に防ぐことはできませんが、対処する方法はあります。もし亀裂が組織まで及んでいた場合は、サンプルを廃棄するか、可能な限り回収を試みる必要があります。

このケースでは、亀裂は組織の上にあるようです。そこで、クライオスタット内で冷却されたカミソリの刃を使用します。

OCTブロックの上部にあるひび割れた部分を切り落とします。ここでも、親指を使ってOCTブロックの表面を温めます。そして、ここに見える通り、ひびが入っている箇所をカットしていきます。

そこで、組織が付いている部分を取り出し、残りのOCT（埋め込み剤）のうち、ひび割れた部分は取り除きました。次に、冷却したカミソリの刃を使用して、そのひび割れた部分をトリミングします。刃を非常に真っ直ぐに入れ、両手を使って刃に均等に圧力をかける必要があります。

そして、刃をOCTに対して前後に揺らします。ゆっくりと前後に揺らしながらOCTを切り込み、ひび割れた部分を除去していきます。

それでは、余分なOCTを取り除いてカットしていきます。よし、これでいいでしょう。次に、頭部を少し後退させます。エッジができてしまったため、ブレードに引っかかる可能性があり、もしそうなるとOCTと組織が剥がれてしまい、サンプルが台無しになる恐れがあるからです。

後退させたので、再び組織の中に戻るために少し前進させる必要があります。これで亀裂が修正できているはずです。さて、組織に戻りました。どうやら修正できたようです。

これにより、OCTに亀裂がなくなったため、切片の採取が格段に容易になります。それでは、目的の組織部位まで進めます。ちょうど今、表面に達したところですので、この胚の脳組織まで進めたいと思います。

これらは十分に大きいため、目的とする構造を実際に観察することが可能です。言い忘れていましたが、セクションをキャプチャするごとに、これらのブラシを使用してブレードを清掃しています。この大きなブラシは、単にエリアを清掃し、余分なOCTを取り除くためのものです。

また、これらのより細い筆を使用して、コールドプレート上の切片を操作し、キャプチャする際の位置を調整します。同様に、これらも冷やしたままにしておくことで、OCTが溶けて筆に付着するのを防ぎます。それでは、組織をキャプチャするために、まず親指でOCTと組織を温めます。

あらかじめラベルを貼っておいたスライドを1枚取り出します。スライドを下向きに保持しますが、やり方は人それぞれです。私は右手で、スライドを下に向けた状態で右上端を持つようにしています。

次に、左親指を支点にしてプレートに対して垂直に下げ、切片を採取します。OCT化合物と組織がスライドガラス上で実際に融解し、そのまま固定されます。まず、親指で組織をゆっくりと温めて切断し、スライドガラスを手に取り、右手で右端を保持しながらプレートを動かし、垂直に下げて融解させます。

組織に折り畳みや気泡がなく、良好な状態であることを確認します。そして、脳全体を切り出すまでこの操作を繰り返します。現在、解剖用顕微鏡で切片を確認し、状態が良いことをチェックしています。ご覧のように、切片の上部に前脳が確認でき、すべて非常に良好な状態です。

これらの凍結切片は、in situ ハイブリダイゼーションなどの用途に使用できます。また、基本的な組織学的検討として、H&E染色を行うこともあります。さらに、免疫蛍光染色や、それに類する多くのアッセイを実施することも可能です。

私の場合、これらの切片はin situ hybridizationのために固定および処理されました。したがって、次はその操作を行います。