治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト
2018年4月20日
療法の評価を目指して私たち頭頸部扁平上皮癌細胞株に対する実験的治療レジメンの現在の規格をテストすることができる回転楕円体に基づく、三次元の in vitroモデルの進化について述べる感受性と将来的に人体標本からの一次電池に抵抗。
このin vitro法の全体的な目標は、頭頸部扁平上皮がんに対する現在の標準治療レジメンまたは実験的治療レジメンの試験を可能にする三次元細胞培養スフェロイドを作製することです。この方法は、放射線または化学療法を受けたときの頭頸部がん細胞の3次元腫瘍増殖を理解するのに役立ちます。原発腫瘍細胞の取り扱いは難しく、必ずしも信頼性の高い3次元スフェロイド形成につながるとは限らないことは言うまでもありません。
手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるSabina Schwenk-Ziegerです。腫瘍標本の初代細胞を使用しながら、標本を適切な無菌表面に置き、無菌の使い捨てメスで非常に小さな断片に完全に切断します。一次組織を十分に機械的に分離した後、コラゲナーゼ1および2を含むバイアルに移し、摂氏37度で1時間インキュベートします。
次に、70マイクロメートルのFalcon細胞ストレーナーで混合物をふるいにかけ、懸濁液をHBSSで洗浄します。分離に成功し、その後洗浄した後、100万個から200万個の細胞を含む懸濁液をT75細胞培養フラスコに移し、摂氏37度で最大10日間サブコンフルエントに増殖します。顕微鏡下で、腫瘍細胞の増殖を確認します。
培養中の細胞を数えます。凹面の丸い底を持つ超低接着96ウェルプレートを使用して、5, 000の初代腫瘍細胞、または中間細胞株の1, 000〜2,000細胞を、200〜300マイクロリットルの培地にウェルに播種します。次に、細胞を摂氏37度で培養します。
メディア交換は 1 日おきに行います。メディア交換中にピペットで回転楕円体を吸引しないように注意してください。スフェロイドを3次元のスフェロイド形状の細胞コングロマリットが観察されるまで培養します。
不規則または複数のスフェロイドが形成されているウェルは、さらなる調査から除外することに注意してください。その後、培地を化学療法薬および/またはモノクローナル抗体を所望の濃度で含有する培地に変更します。シスプラチンを2.5マイクロモル、5マイクロモル、または10マイクロモルの濃度で、または5-フルオロウラシルを30マイクロモルで添加します。
この手順では、グラフィックソフトウェアを使用して、6日目、10日目、16日目のデジタル写真記録後に回転楕円体のサイズを測定します。プレートを520gで2.5分間遠心分離した後、上清を除去します。次に、細胞を1x PBSで洗浄し、プレートを再度遠心分離し、続いて上清を除去します。
次に、100マイクロリットルの酵素細胞剥離溶液を各バイアルに加えて、スフェロイドを溶解させます。その後、プレートを摂氏37度で8分間インキュベートします。顕微鏡下でスフェロイドがうまく溶解することを確認します。
100マイクロリットルのDMEMを追加します。次に、プレートを520gで2.5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、細胞を100マイクロリットルのDMEMに懸濁します。
その後、必要に応じて、市販の比色増殖アッセイを実施し、ELISAリーダーでアッセイを読み取ります。すべての細胞株は、サイズと読み出し時間が異なる信頼性の高いスフェロイドを生成することができました。初代細胞は、超低接着プレートで再現性のあるスフェロイドを形成しました。
Ki-67染色は、培養の周辺部が中央細胞よりもはるかに高い増殖速度を示し、壊死性コアを示すことが多い固形粘膜腫瘍の栄養分布を模倣していることを明らかにしました。ここでは、いくつかの化学療法と放射線療法がスフェロイドサイズに及ぼす影響について説明します。シスプラチンによる治療前に2つの灰色の放射線を照射すると、シスプラチン単独と比較してスフェロイドサイズが大幅に減少します。.
ヒト初代細胞からスフェロイドを作製することがさらに確立されれば、治療試験の概念が実現できるようになったのです。スフェロイドは腫瘍生検後に生成され、その後、分子特性と治療感受性についてテストされます。私たちは、細胞株と初代ヒト腫瘍細胞の両方について、細胞懸濁液から再現性のあるスフェロイドを生成するためのプロトコルを確立することができました。
このマルチモーダルアッセイは、グループ間の小さな違いを特定するのに十分な感度を備えています。将来的には、このアッセイを使用して、まず、標準的および実験的治療プロトコルに対する個々の反応を評価することができます。次に、新鮮な標本から腫瘍細胞をさらに特徴付けます。
そして第三に、治療反応を分子パターンに相関させます。初代細胞の使用とスフェロイドの作製により、個々の治療反応を研究するための費用対効果の高いアッセイと組み合わせて、in vivo腫瘍増殖のできるだけ多くの特性を保存することができます。
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概要
本記事では、頭頸部扁平上皮癌における治療感受性と耐性を評価するために設計された、スフェロイドベースの三次元in vitroモデルについて解説します。本手法は、放射線治療および化学療法に対する腫瘍増殖の反応への理解を深めることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 細胞生物学
背景
- 頭頸部扁平上皮癌は、治療が困難な癌種です。
- 現在の治療法の有効性は、症例によってばらつきがあることが多いです。
- 三次元細胞培養モデルを用いることで、in vivo の条件をより適切に模倣できます。
- 初代腫瘍細胞の取り扱いには、大きな困難が伴います。
研究目的
- 治療法の検証に向けた信頼性の高いin vitroモデルを構築する。
- 標準的な治療計画および試験的な治療計画の有効性を評価する。
- ヒト一次細胞を用いた今後の研究を促進する。
使用された手法
- 三次元細胞培養スフェロイドの作製。
- 組織解離のためのコラゲナーゼの使用。
- 原発腫瘍細胞を37 °Cでインキュベート。
- 治療条件下での腫瘍増殖の評価。
主な結果
- 原発性腫瘍細胞からのスフェロイド形成の成功。
- 頭頸部がん細胞の増殖パターンの解明。
- 制御された環境における治療反応の評価。
- 得られた知見に基づく治療戦略の向上の可能性。
結論
- 開発されたモデルは、今後の研究において有望である。
- 治療耐性を理解することは、より良い治療結果につながる可能性がある。
- 手法を洗練させるためには、さらなる研究が必要である。
よくあるご質問
業界における重要性
このスフェロイドベースの3D細胞培養モデルは、頭頸部扁平上皮癌の薬剤開発における予測的な前臨床システムの不可欠なニーズに対応するものです。原発腫瘍細胞を用いた標準化された治療感受性試験を可能にすることで、本アッセイはメカニズムのリスク低減およびトランスレーショナルなバイオマーカーの探索を支援します。このアプローチは、初期探索およびリード化合物同定段階におけるgo/no-go決定に寄与する定量的で再現性のあるリードアウトを提供し、ポートフォリオの優先順位付けを強化します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 生体内での腫瘍構造を模倣した、疾患に関連する3Dシステムにおいて、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値： 処置後のスフェロイドのサイズおよび生存率の定量測定を通じて、機能的なターゲット検証をサポートする。
- 予測的価値： 細胞株および一次検体間における治療反応の変動性を評価するためのデータを生成し、メカニズム上のリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：超低接着プレートを用いて標準化されたハイスループットなスフェロイド形成を実現し、一貫性のある化合物スクリーニングを可能にする。
- 運用的価値：定義されたエンドポイント（スフェロイドのサイズ、生存率）に基づいた、化学放射線療法および免疫療法のレジメンに対する再現性のある曝露を可能にする。
- 拡張性：96ウェルフォーマットに対応しており、アッセイの標準化およびクロスファンクショナルなワークフローへの統合をサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的連続性：ヒト原発腫瘍細胞を使用することで、患者固有の腫瘍特性を維持し、臨床的な奏効予測への関連性を高めます。
- メカニズムによるリスク低減：治療奏効を分子パターン（例：Ki-67染色）と相関させることができ、耐性メカニズムの特定が可能です。
- 前臨床モデル：in vivo研究に先立ち、標準的および実験的なレジメンを評価するための、費用対効果が高く再現性のあるシステムを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特に固形がんを対象としたオンコロジープログラムに有用です。
- 探索生物学：治療負荷条件下における腫瘍成長ダイナミクスおよび微小環境の相互作用に関する仮説検証を促進します。
- スクリーニング：シスプラチン、5-FU、または放射線照射の組み合わせに曝露した後、定量的な再現性のある出力（スフェロイドのサイズ、生存率）を提供します。
- 分析：デジタル写真による記録と、ダウンストリームアッセイのための酵素解離を用いることで、治療群の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：スフェロイドの反応を、原検体から得られた増殖マーカーおよび分子プロファイルと関連付けることで、バイオマーカーの整合性をサポートします。
- 企業での再利用：さまざまな腫瘍型や治療法に適応可能な、標準化され品質管理されたアッセイプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：固形腫瘍に見られる栄養勾配と増殖の不均一性をモデル化することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：標準化された分散、播種、および培地交換プロトコルにより、再現性を確保します。
- 戦略的価値：患者由来モデルにおける治療感受性の早期評価を可能にし、生物学的な脱落を減少させます。
- ポートフォリオへの影響：リソースを大量に消費する研究の前に、奏効例と非奏効例を特定することで、リスク調整後の推進判断に情報を与えます。
実施上の考慮事項
- 原発腫瘍組織の取り扱いおよび酵素的解離技術に関する専門知識が必要である。
- スフェロイドのモニタリングには、超低接着プレートと倒立顕微鏡が必要である。
- ピペッティング時のスフェロイドの破壊を防ぐため、培地交換の標準化されたワークフローが必要となる。
- 堅牢性を確保するため、多様なHNSCC細胞株および原発検体を用いた検証が必要である。
- 原発細胞のスフェロイド形成効率にはばらつきがあるため、不規則な構造体を除外する基準を設ける必要がある。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Processing the Tumor Specimen
1:39
Seeding the Cells on Ultra-low Adhesion Cell Culture Plates and Exposing Spheroids to Multimodal Standard or Experimental Tumor Therapy
2:52
Assessment of Spheroid Size and Extent of Cellular Proliferation for Assay Read-out
4:08
Results: Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
5:12
Conclusion
