治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

このin vitro法の全体的な目標は、頭頸部扁平上皮がんに対する現在の標準治療レジメンまたは実験的治療レジメンの試験を可能にする三次元細胞培養スフェロイドを作製することです。この方法は、放射線または化学療法を受けたときの頭頸部がん細胞の3次元腫瘍増殖を理解するのに役立ちます。原発腫瘍細胞の取り扱いは難しく、必ずしも信頼性の高い3次元スフェロイド形成につながるとは限らないことは言うまでもありません。

手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるSabina Schwenk-Ziegerです。腫瘍標本の初代細胞を使用しながら、標本を適切な無菌表面に置き、無菌の使い捨てメスで非常に小さな断片に完全に切断します。一次組織を十分に機械的に分離した後、コラゲナーゼ1および2を含むバイアルに移し、摂氏37度で1時間インキュベートします。

次に、70マイクロメートルのFalcon細胞ストレーナーで混合物をふるいにかけ、懸濁液をHBSSで洗浄します。分離に成功し、その後洗浄した後、100万個から200万個の細胞を含む懸濁液をT75細胞培養フラスコに移し、摂氏37度で最大10日間サブコンフルエントに増殖します。顕微鏡下で、腫瘍細胞の増殖を確認します。

培養中の細胞を数えます。凹面の丸い底を持つ超低接着96ウェルプレートを使用して、5, 000の初代腫瘍細胞、または中間細胞株の1, 000〜2,000細胞を、200〜300マイクロリットルの培地にウェルに播種します。次に、細胞を摂氏37度で培養します。

メディア交換は 1 日おきに行います。メディア交換中にピペットで回転楕円体を吸引しないように注意してください。スフェロイドを3次元のスフェロイド形状の細胞コングロマリットが観察されるまで培養します。

不規則または複数のスフェロイドが形成されているウェルは、さらなる調査から除外することに注意してください。その後、培地を化学療法薬および/またはモノクローナル抗体を所望の濃度で含有する培地に変更します。シスプラチンを2.5マイクロモル、5マイクロモル、または10マイクロモルの濃度で、または5-フルオロウラシルを30マイクロモルで添加します。

この手順では、グラフィックソフトウェアを使用して、6日目、10日目、16日目のデジタル写真記録後に回転楕円体のサイズを測定します。プレートを520gで2.5分間遠心分離した後、上清を除去します。次に、細胞を1x PBSで洗浄し、プレートを再度遠心分離し、続いて上清を除去します。

次に、100マイクロリットルの酵素細胞剥離溶液を各バイアルに加えて、スフェロイドを溶解させます。その後、プレートを摂氏37度で8分間インキュベートします。顕微鏡下でスフェロイドがうまく溶解することを確認します。

100マイクロリットルのDMEMを追加します。次に、プレートを520gで2.5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、細胞を100マイクロリットルのDMEMに懸濁します。

その後、必要に応じて、市販の比色増殖アッセイを実施し、ELISAリーダーでアッセイを読み取ります。すべての細胞株は、サイズと読み出し時間が異なる信頼性の高いスフェロイドを生成することができました。初代細胞は、超低接着プレートで再現性のあるスフェロイドを形成しました。

Ki-67染色は、培養の周辺部が中央細胞よりもはるかに高い増殖速度を示し、壊死性コアを示すことが多い固形粘膜腫瘍の栄養分布を模倣していることを明らかにしました。ここでは、いくつかの化学療法と放射線療法がスフェロイドサイズに及ぼす影響について説明します。シスプラチンによる治療前に2つの灰色の放射線を照射すると、シスプラチン単独と比較してスフェロイドサイズが大幅に減少します。.

ヒト初代細胞からスフェロイドを作製することがさらに確立されれば、治療試験の概念が実現できるようになったのです。スフェロイドは腫瘍生検後に生成され、その後、分子特性と治療感受性についてテストされます。私たちは、細胞株と初代ヒト腫瘍細胞の両方について、細胞懸濁液から再現性のあるスフェロイドを生成するためのプロトコルを確立することができました。

このマルチモーダルアッセイは、グループ間の小さな違いを特定するのに十分な感度を備えています。将来的には、このアッセイを使用して、まず、標準的および実験的治療プロトコルに対する個々の反応を評価することができます。次に、新鮮な標本から腫瘍細胞をさらに特徴付けます。

そして第三に、治療反応を分子パターンに相関させます。初代細胞の使用とスフェロイドの作製により、個々の治療反応を研究するための費用対効果の高いアッセイと組み合わせて、in vivo腫瘍増殖のできるだけ多くの特性を保存することができます。