C.エレガンス割球解剖:卵殻を取り出して胚細胞を解離する方法

- この解剖には、卵とほぼ同じ幅の開口部を持つマイクロピペットと2倍の幅のマイクロピペットの2つを使用し、それらの間の迅速な移動を容易にするためにウェルに整理された一連の溶液を使用します。

まず、成体の雌雄同体を卵塩溶液に入れます。これは、胚が破裂するのを防ぐために浸透圧的にバランスが取れています。ワームを半分に切って、発生中の胚を解放します。

次に、2細胞期の胚を同定します。これらの細胞は、受精卵の分裂によって形成される割球です。開口部が大きいマイクロピペットを使用して、胚を次亜塩素酸塩溶液である漂白剤に移すと、保護卵殻が分解され始めます。

わずか40〜55秒後、胚をシェルトン増殖培地(SGM)に移します。各胚をSGMの2つのウェルで短時間洗浄し、漂白剤の痕跡をすべて取り除いてから、3番目のウェルに入れます。

次に、小さいマイクロピペットを使用して胚を繰り返しピペッティングし、機械的な力で卵殻を取り除き、割球を露出させます。胚を静かにピペットで動かし続け、個々の割球細胞を分離します。次のプロトコルでは、この手法が実際に動作しているのを見ていきます。

- マイクロキャピラリーの両端を10マイクロリットルの容量で右手と左手で持ちます。マイクロキャピラリーを両端に向かって引っ張って張力をかけ、キャピラリーの中心をバーナーの上に持ってきて、手で引っ張る2つのキャピラリーを作ります。

解剖顕微鏡の下で、鉗子で手で引っ張った毛細血管の先端を切り取ります。2つの先端開口部のサイズを、C.エレガンスの胚の短軸の長さの約2倍と1倍にします。

引っ張ったキャピラリーをマウスピペッティング装置に取り付けます。45マイクロリットルの卵塩溶液をマルチウェルスライドのウェルにピペットで移します。

5〜10匹の成虫のC.エレガンスを井戸に置きます。初期のC.エレガンスの胚を得るためには、C.エレガンスの体の左右に2本の針を配置し、針を互いにスライドさせて成虫を細かく切ります。

卵塩溶液を含むウェルの隣のウェルに45マイクロリットルの次亜塩素酸塩溶液をピペットで移し、45マイクロリットルのシェルトン増殖培地を後続の3つのウェルにピペットで移します。1細胞期および初期の2細胞期の胚を、より大きな開口部の口ピペットで次亜塩素酸溶液に移し、40〜55秒間待ちます。

胚をシェルトンの成長培地で次の3つのウェルに移し、最初の2つのウェルのそれぞれで1〜2秒かけて洗浄します。開口部が小さい手描きのキャピラリーを使用して、卵殻除去のために胚を慎重にピペッティングを繰り返します。

その後、手描きの毛細血管で連続的にピペットを動かし、2細胞期の胚割球を分離します。

- 卵殻除去後、破裂を防ぐために胚を上下にピペッティングする力を最小限に抑えてください。