比較 in vivoで研究アフリカツメガエル

この手順の全体的な目標は、熱ショックタンパク質G 96の進化的保存能力を研究して、カエルのゼノプススリーブ内の抗原特異的CD 8 T細胞応答を促進することです。これは、最初に腹膜洗浄によって腹膜白血球を採取することによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、腹膜白血球に腫瘍由来の GP 96 をパルスし、インキュベーションと洗浄後にマイナー抗原と腫瘍抗原をシャペロンすることです。

腹膜白血球は、腹腔内注射によってナイーブなカエルに養子縁組され、これらのカエルを腫瘍またはマイナーな組織適合抗原に対してプライミングします。手順の3番目のステップは、皮膚移植または腫瘍がプライミングされたカエルに挑戦し、皮膚移植の開始、拒絶反応、または腫瘍の出現を監視することです。手順の最後のステップは、皮膚拒絶反応と抗腫瘍反応に関与するT細胞を特徴付けるための末梢血を採取することです。

最終的には、皮膚移植片の拒絶反応の有意な加速、ならびにGP 96プライミングされたカエルにおける腫瘍出現の遅延を、それぞれ皮膚移植および腫瘍チャレンジアッセイを通じて示す結果を得ることができる。こんにちは、ロチェスター大学医療センターの微生物学・免疫学部のジャック・ロバート博士の研究室に所属するクリスティーナ・コスカです。私もDr.Riverの研究室のターニャ・クルスです。

本日は、腹膜白血球の養子移植によるクローンカエルのプライミングと、それに続く皮膚移植と腫瘍移植のアッセイの手順をご紹介します。さらに、この動物から末梢血を採取する方法も紹介します。この手順を使用して、タンパク質GP 96を加熱してSallaの抗原特異的CDAT細胞を促進する能力を研究し、関与する細胞タイプを研究します。

では、始めましょう。私たちの実験で使用されたカエルは、ロチェスター大学の繁殖コロニーからのISO遺伝子クローンです。収穫のための腹膜白血球またはplsを誘発するには、25ゲージの58針を使用して、麻酔をかけたカエル腹腔内に熱で大腸菌の準備を殺しました注射の3日後plsは腹腔内洗浄によって収穫されます。

この手順を開始するには、麻酔をかけたカエルの腹部を少量の70%エタノールで消毒します。次に、18ゲージの1.5針を使用して、5ミリリットルの滅菌両生類リン酸緩衝生理食塩水、または戦前のPBSを室温で腹腔に注入します。針を取り外し、カエルを1分間優しくマッサージして、注入されたバッファーが体腔内の液体と等しくなることを確認します。

次に、注射器なしで新しい18ゲージ1.5針をカエルの腹部に挿入します。血管を避けながら、針の後ろから滴り落ちる腹水をきれいな50ミリリットルの円錐管に集めます。plsが収穫された後、最初に注入された量をできるだけ多く回収するようにしてください。

カエルを浅瀬の入った容器に入れて、目が覚めたらケージに戻すことができます。plsが収穫されたら、摂氏4度で10分間1000RPMで遠心分離し、sup、natant、resusを除去します。冷たくPBSでplsを吊るします。

再懸濁したplsを1.5ミリリットルのマイクロゴミチューブに移します。GP 96でPLSをパルスします。適量のGP 96をplsに加え、ピペッティングで混合し、1時間後に氷上で1時間インキュベートします。

細胞を14, 000 RPMで1分間遠心分離します。バインドされていないGP 96を削除するには、上清を取り除きます。冷やしたPBSを加えて復活させます。

PLS遠心分離機を再度一時停止します。Sを冷たいA-P-B-S-Aで合計3回洗浄し、最終洗浄後にG96が残っていないことを確認します。Resusは、パルスplsをPBSの300マイクロリットルあたり5 plsに10の5倍の濃度で懸濁し、plsを素朴なLG 6レシピエントに養子縁組に移します。

腹腔内注射 動物あたり300マイクロリットルのパルスpls。カエルは、次に紹介する皮膚移植または腫瘍チャレンジ実験の少なくとも3日前にプライミングする必要があります。移植用の皮膚は、麻酔をかけたLG15ドナーカエルから得られます。

はさみを使用して、銀色に見える腹部の皮膚である腹側の皮膚の小片を切り取ります。移植片を取り扱う際にARI4つの色素細胞が存在するため。組織の操作をできるだけ少なくすることが重要です。それは移植片の損傷を引き起こすからです。

鉗子で皮膚を非常に優しく保持し、冷たいPBSが入ったシャーレに入れます。ペトリ皿をつけたままにしておきます。新しいスライドガラスの上に皮膚を置き、かみそりを使用して個々の移植片を5ミリメートル×5ミリメートルの小片に切断します。

断片を氷上のPBSに保持して、LGの6レシピエントのカエルに皮膚を移植します。まず、麻酔をかけたレシピエントの背側の皮膚に小さな切開を行います。次に、5mm×5mmのグラフトを銀色の面を上にして皮下に挿入します。

移植片のハサミと鉗子のマーキングは、移植片の拒絶反応としてカウントされないため、必ず注意してください。24時間後にスコアリングが開始されたら、オーバーレイする宿主の皮膚の一部を移植片から取り除く必要があります。ハサミを使ってグラフトの周りの窓を切り取り、グラフトを自由に視覚化できるようにします。

ドナーの皮膚に触れたり、出血を誘発したりしないように注意してください。スケッチを撮って、すぐにグラフトの採点を開始します。皮膚移植。

拒絶反応は、移植された皮膚上のアリドールの破壊の割合によって決定されます。移植片は、実体顕微鏡下で2〜3日ごとにチェックする必要があります。蘇生によって移植のための腫瘍細胞を準備し、腫瘍培養培地にそれらを300マイクロリットルあたり5細胞の10倍の密度で懸濁します。

動物の背側の片側に皮下注射により細胞を移植します。300マイクロリットルの容量で5つの細胞に10の5倍がカエルあたり注入されます。腫瘍の増殖は、腫瘍チャレンジ後2〜3週間以内に始まります。

腫瘍の初期の外観に注意してください。キャリパーを使用して腫瘍の寸法を測定し、カエルから血液白血球を採取する前の2〜3日ごとにその体積を記録します。パスタの小道具を炎に引っ張ってガラス針を準備します。

実体顕微鏡でピペットの細い先端を研いだ後、ピペットを吸引プラスチックチューブに接続します。採血を開始するには、麻酔をかけたカエルの後足の上の皮膚を切開して、背足根静脈を露出させます。ガラス針に1〜2ミリリットルの氷冷PBSとヘパリン溶液を入れます。

次に、ガラス針を静脈に挿入し、口でゆっくりと吸引して採血を開始します。平均的なサイズのカエル1匹から1〜2ミリリットルの血液を得ることができます。カエルの足の小さな切開部は縫う必要はありません。

傷は一週間以内に治ります。移植後12日での皮膚移植片拒絶反応の立体顕微鏡分析の結果を以下に示します。MHCの同一LGシックスのドナーから皮膚移植を受けたLGシックスのクローンカエルは、拒絶反応を示しませんでした。

アスタリスクは、マーカー鉗子が拒絶反応によるものではないことを示します。対照的に、MHCの異なる異種近交系ドナーから皮膚移植を受けたLGの6クローンカエルは、80%の拒絶反応を示しています。どちらの画像でも、矢印は銀色の虹彩の4つの色素沈着細胞を示しており、健康な非拒絶移植組織を示しています。

この次の実験では、LG 15 plsを、大腸菌培養物から精製したネガティブコントロール組換えGP 96または15ゼロ腫瘍組織細胞から精製したGP 96としてPBSでパルス化し、その後LG 15成人レシピエントに養子として移植し、3日後に生きた15ゼロ腫瘍細胞を皮下注射腫瘍によって移植しましたチャレンジの数日後に最初に出現した腫瘍を監視し、腫瘍サイズを定期的に測定しました。これらのグラフは、各曲線が1匹のカエルの腫瘍増殖の動態を表しています。その結果、0.5マイクログラムまたは1マイクログラムのGP 96でプライミングされた動物は、対照群と比較して腫瘍の出現が有意に遅れたことが示されています。したがって、GP 96は、ゼノプスにおける腫瘍抗原の交差提示を容易にする。

そこで、皮膚移植と腫瘍移植アッセイにより、GP 96がカエルxapラビスのマイナー抗原と腫瘍抗原の両方を発現する能力を探索する方法を示しました。この手順を行うときは、マクロファージではなく赤血球内の細胞の大部分が損傷しているため、血管が損傷している場合は腹膜洗浄の収集を避けることを覚えておくことが重要です。また、皮膚移植片を操作する際には、損傷を避けるために、鉗子で組織を圧迫しないようにすることも重要です。

というわけで、これだけです。洗ってくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。