比較 in vivoで研究アフリカツメガエル

この手順の全体的な目的は、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）において、抗原特異的なCD8 T細胞応答を促進するヒートショックプロテインGP96の進化的な保存能を研究することです。まず、腹腔洗浄によって腹腔白血球を採取します。次に、インキュベーションと洗浄の後、マイナー抗原および腫瘍抗原をシャペロンする腫瘍由来のGP96で腹腔白血球をパルスします。

腫瘍または副次的組織適合性抗原に対する感作を行うため、腹腔白血球をナイーブ個体のカエルに腹腔内投与して養子移入します。手順の第3段階では、感作したカエルに皮膚移植または腫瘍チャレンジを行い、皮膚移植片の拒絶反応または腫瘍の出現の開始をモニタリングします。手順の最終段階では、末梢血を採取し、皮膚拒絶反応および抗腫瘍応答に関与するT細胞の特性評価を行います。

最終的に、皮膚移植アッセイおよび腫瘍チャレンジアッセイを通じて、それぞれGP 96でプライミングされたカエルにおける皮膚移植拒絶反応の有意な加速と、腫瘍出現の遅延を示す結果を得ることができます。こんにちは、ロチェスター大学医療センター微生物学・免疫学部のJacque Robert博士の研究室のChristina Koskaです。同じくRiver博士の研究室のTanya Cruzです。

本日は、腹腔白血球の養子移殖によるクローンカエルのプライミング、それに続く皮膚移植および腫瘍移植アッセイの手順をご紹介します。さらに、これらの動物から末梢血を採取する方法についても説明します。私たちは、ヒートショックプロテインGP 96がXenopusにおいて抗原特異的なCD4+ T細胞を促進する能力を調査し、関与する細胞型を研究するために、研究室でこの手順を用いています。

それでは、開始しましょう。本実験で使用するカエルは、ロチェスター大学の飼育コロニーから得られたアイソジェニッククローンです。採取のための腹腔白血球（PLs）を誘導するには、25ゲージの5/8インチ針を用いて、麻酔をかけたカエルの腹腔内に加熱殺菌したE. coli調製液を注入します。注入から3日後、腹腔洗浄によってPLsを採取します。

この手順を開始するために、麻酔をかけたカエルの腹部を少量の70%ethanolで消毒します。次に、18ゲージ1.5の針を用いて、滅菌済みの両生類用リン酸緩衝生理食塩水（または室温で予熱したPBS）5 mLを腹腔内に注入します。針を抜き、注入した緩衝液が体腔内の液体と均一に混ざり合うように、カエルを1分間軽くマッサージします。

次に、シリンジを装着していない新しい18ゲージ1.5インチの針をカエルの腹腔に挿入します。血管を避けながら、針の背面から滴下する腹腔液を清潔な50 milliliterコニカルチューブに回収します。plsを採取した後、最初に注入した液量をできる限り回収するようにしてください。

カエルを浅い水の入った容器に入れ、目が覚めるまで待ち、その後ケージに戻します。plsを回収したら、4°Cで1000 RPMにて10分間遠心分離し、上清を除去してresusします。plsを冷えたA PBSに懸濁します。

再懸濁したplsを1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに移します。PLSをGP 96でパルス処理します。適切な量のGP 96をplsに加え、ピペッティングで混合し、氷上で1時間インキュベートします。1時間後、

細胞を14,000 RPMで1分間遠心分離します。未結合のGP 96を除去するため、上清を取り除きます。冷えたA PBSを加え、再懸濁します。

PLS遠心分離を再度停止します。最終洗浄後にG 96の残留がないことを確認するため、Sを冷えたA-P-B-S-Aで計3回洗浄します。ナイーブなLG sixレシピエントにPLSを養子移入させるため、PBS 300 µLあたり5×10⁵ PLSの濃度でパルスPLSを再懸濁します。

動物1匹につき300 µLのパルスPLSを腹腔内投与します。カエルは、次に説明する皮膚移植または腫瘍チャレンジ実験の少なくとも3日前にプライミングを行う必要があります。移植用の皮膚は、麻酔をかけたLG 15ドナーカエルから採取します。

ハサミを使用して、銀色に見える腹部皮膚である腹側の皮膚を小さく切り出して除去します。移植片を扱う際は、ARIにより4つの色素細胞が存在することに注意してください。組織の操作を最小限に抑えることが極めて重要です。過度な操作は移植片の損傷を招くためです。

ピンセットで皮膚を非常に優しく保持し、冷えた PBS が入ったペトリ皿に移します。ペトリ皿を冷やしたままにします。皮膚を新しいガラススライドの上に置き、カミソリを使用して、個々の移植片を 5 mm × 5 mm の大きさに切り出します。

皮膚をLG sixレシピエントのカエルに移植するため、断片を氷上のPBSに保持します。まず、麻酔をかけたレシピエントの背側皮膚に小さな切開を加えます。次に、5 mm × 5 mmの移植片を、銀色の面を上にして皮膚下に挿入します。

移植片にあるハサミやピンセットの痕は、移植片の拒絶反応とはみなされないため、必ず記録しておいてください。24時間後にスコアリングを開始する際、移植片を覆っている宿主の皮膚の一部を取り除く必要があります。ハサミを使用して移植片の周囲を窓状に切り抜き、移植片が明確に観察できるようにしてください。

ドナー皮膚に触れたり、出血させたりしないよう注意してください。すぐにスケッチを作成し、移植片のスコアリングを開始します。皮膚移植。

拒絶反応は、移植皮膚上のaridolの破壊率によって判定します。ステレオ顕微鏡下で2〜3日ごとに移植片を確認してください。移植用の腫瘍細胞を調製し、腫瘍培養培地を用いて、300 µLあたり5 × 10⁵ cellsの密度で懸濁させます。

動物の背側の片側に皮下注射で細胞を移植します。カエル1匹につき、300 µLの容量で5×10⁵個の細胞を注入します。腫瘍のチャレンジ後、2〜3週間以内に腫瘍の増殖が始まります。

腫瘍の初期の外観を確認してください。キャリパーを用いて腫瘍の寸法を測定し、カエルから血液白血球を採取するまで、2〜3日ごとにその体積を記録します。パステールパイペットを火で引いて、ガラス針を作製してください。

実体顕微鏡下でピペットの先端を鋭利にした後、ピペットを吸引用プラスチックチューブに接続します。採血を開始するには、麻酔をかけたカエルの後肢の上部の皮膚を切開し、跗骨背静脈を露出させます。ガラス針に、氷冷した 1 to 2 mL の PBS plus heparin 溶液を満たします。

次に、ガラス針を静脈に挿入し、口でゆっくりと吸引して採血を開始します。平均的なサイズのカエル1匹から1～2 mLの血液を採取できます。カエルの脚に作った小さな切開創を縫合する必要はありません。

傷口は1週間以内に治癒します。移植から12日後の皮膚移植片拒絶反応の実体顕微鏡解析の結果をここに示します。MHCが同一なLG sixドナーから皮膚移植を受けたLG sixクローンカエルでは、拒絶反応は見られませんでした。

アスタリスクは、拒絶反応によるものではないマーカー鉗子を示しています。対照的に、MHC不一致の外部ドナーから皮膚移植を受けたLG 6クローンカエルでは、80%の拒絶反応が見られます。どちらの画像においても、矢印は、拒絶反応のない健全な移植組織を示す銀色の虹彩細胞（iridophores）および色素細胞（pigmented cells）を指しています。

次の実験では、陰性対照としてのPBS、大腸菌培養液から精製した組換えGP 96、または15 zero腫瘍組織細胞から精製したGP 96のいずれかをLG 15にパルスしました。その後、これらをLG 15の成体レシピエントに養子移入し、3日後に生きた15 zero腫瘍細胞を皮下注射により移植しました。チャレンジ後、最初に腫瘍が出現した日数を記録し、腫瘍サイズを定期的に測定しました。これらのグラフにおいて、各曲線は1匹のカエルの腫瘍増殖のキネティクスを表しています。結果として、0.5 µgまたは1 µgのGP 96でプライミングした動物では、対照群と比較して腫瘍の出現が有意に遅延したことが示されました。したがって、GP 96はXenopusにおける腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを促進します。

以上で、皮膚移植および腫瘍移植アッセイを用いて、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）におけるGP 96がマイナー抗原と腫瘍抗原の両方を提示する能力を探索する方法について説明しました。この手順を行う際は、血管が損傷している場合に腹腔洗浄液を回収しないことが重要です。なぜなら、回収される細胞の大部分がマクロファージではなく赤血球になるためです。また、皮膚移植片を操作する際は、組織をピンセットで強く挟まないように注意し、損傷を避けることが重要です。

以上です。洗浄へのご協力ありがとうございました。実験の成功をお祈りしています。