CUBICベースのタンパク質発現の可視化:全層マウス皮膚生検におけるタンパク質発現を可視化する手順

- 皮膚は、さまざまな細胞集団が複数の層に配置された複雑な器官です。組織清算に基づく3次元イメージング技術であるCUBICは、皮膚全生検を使用してこれらの皮膚細胞内のタンパク質発現パターンを視覚化するのに役立ちます。安楽死させたマウスを採取し、その背側の首の部分から毛を取り除くことから始めます。皮を切除し、細かく切ります。

ピースをCUBIC1清澄溶液に浸し、インキュベートします。皮膚細胞は、光散乱を引き起こす発色団と脂質の存在により、不透明です。CUBIC溶液中の化学物質はこれらの分子を除去し、光散乱を減らし、組織を透明にします。

次に、皮膚細胞に発現する標的細胞内タンパク質に特異的に結合する目的の一次抗体で組織を処理します。さらに、タンパク質-一次抗体複合体に結合する蛍光標識二次抗体で処理します。核を染色するDNA結合色素で組織を対比染色します。

最後に、サンプルをCUBIC2溶液に浸します。この溶液は、組織内の光散乱をさらに低減し、イメージングの透明性を高めます。共焦点顕微鏡で観察し、3次元サンプル中の蛍光標識された関心領域を視覚化します。次のプロトコルでは、CUBICプロトコルを使用したホールマウント皮膚生検におけるケラチノサイト増殖マーカーの発現を視覚化できます。

- まず、安楽死させたマウスの首からトリマーを使用して毛を剃り、皮膚を傷つけないように注意します。次に、PBSの70%エタノールで皮膚を除染します。次に、鉗子で背側の首の皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して背側のマウスの皮膚の約1.5 x 4センチメートルの領域を取り除きます。次に、真皮を下にして皮膚を濾紙の上に平らにし、サンプルの前後の向きをメモし、解剖した皮膚の周りの紙を切り取ります。

- 最適なイメージングのためには、皮膚サンプルは平らで、毛包の向きが一貫している必要があります。サンプルを適切な前後の位置に維持するために、長方形の生検で皮膚片を濾紙に固定します。

- サンプルを、新たに調製したPBS中の4%PFAで満たされた15ミリリットルチューブに移します。次に、濾紙にしっかりと固定したら、標本を新しい15ミリリットルのPBSチューブに移し、5分間の洗浄を2回行います。

2回目の洗浄後に皮膚生検をクリアするには、鋭利なカミソリの刃を使用して組織を約0.2 x 0.5 cmの小片に切断し、サンプルの長辺がサンプルの前後方向に沿って切断されるように注意します。

- 生検の長辺を毛包の向きと平行に切断することも、毛包の広範な損傷を防ぐのに役立ちます。

- 次に、生検を新たに調製したCUBIC1清浄溶液の5ミリリットルに新しい15ミリリットルのチューブに浸し、チューブを摂氏37度のハイブリダイゼーションオーブンの回転プラットフォームに置きます。組織片が透明になったら、生検を4ミリリットルのPBSで37°Cで6時間4回洗浄し、続いてPBSのスクロース容量あたり20%の重量で4時間37°Cで洗浄します。

インキュベーションの終了時に、各サンプルを個々の15ミリリットルチューブ内の最適な切断温度の化合物でマイナス80°Cで一晩凍結し、抗体浸透に対する組織の透過性を高めます。

翌朝、適切な抗体と目的のバイタル色素で皮膚サンプルを染色します。次に、試料を2ミリリットルのチューブに入れた1ミリリットルの新しく調製したCUBIC2清澄溶液で、摂氏37度のオーブンで摂氏37度のオーブンで24時間インキュベートします。

組織が透明な場合は、毛包の成長方向がカバースリップ表面と平行になるように、個々のガラスカバースリップの長い辺に沿って生検を配置します。CUBIC2溶液を1滴垂らします。1 mm x 2 cm の青い鋲のストリップを 2 枚、カバー スリップに置きます。次に、生検を2枚目のカバースリップで覆います。

次に、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡ステージに置き、組織を光経路に移動します。適切な光源と標準的な落射蛍光フィルターを使用してサンプルをスキャンし、蛍光染色された関心領域を同定します。次に、関心領域の蛍光共焦点画像を取得します。