CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

この手順の全体的な目標は、単一細胞レベルでの細胞増殖とタンパク質発現パターンを3次元で視覚化し、皮膚の解剖学的構造と病理を正確に評価することです。この方法は、細胞および分子メカニズムが表皮の発達と再生をどのように制御するか、また、これらのメカニズムが皮膚疾患中にどのように摂動されるかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、全層皮膚生検の個々の細胞を前例のない精度で3次元で視覚化するための技術的に単純なプロトコルであることです。

また、この方法は、全皮膚サンプル中の表皮と真皮との間の相互作用の調査を容易にします。一般に、この方法に不慣れな研究者は、毛包に損傷を与えることなく小さな平らな皮膚生検を準備するのに少し苦労するかもしれません。この手順を実演するのは、UNSWオーストラリアの発達再生皮膚科ユニットの博士課程の学生であるBettyMaclariosです。

まず、トリマーを使用して安楽死させたマウスの首から毛を剃り、皮膚を傷つけないように注意します。次に、70%エタノールとPBSで皮膚を除染します。次に、鉗子で背側の首の皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して背側のマウスの皮膚の約1.5 x 4 cmの領域を取り除きます。

次に、サンプルの前方後方の向きをメモしながら、濾紙の上で皮膚の真皮面を下にして平らにし、解剖した皮膚の周りの紙を切り取ります。最適なイメージングのためには、皮膚サンプルを平らに保ち、毛包の向きを一定にする必要があります。サンプルを適切な前後位置に維持するために、長方形の生検で皮膚片を濾紙に固定します。

新たに調製した4%PFAとPBSを充填した15mLチューブにサンプルを移します。次に、濾紙にしっかりと固定されたら、標本を新しいPBSの15 mLチューブに移し、5分間の洗浄を2回行います。皮膚生検をクリアするには、2回目の洗浄後、鋭利なカミソリの刃を使用して組織を約0.2 x 0.5 cmの小片に切断し、サンプルの長辺がサンプルの前方後方向に沿って切断されるように注意します。

毛包の向きと平行に生検の側面に沿って切断することも、毛包の広範な損傷を回避するのに役立ちます。彼らは、新しい15mLチューブに新たに調製された立方体1清澄溶液5mLに生検を沈め、チューブを摂氏37度のハイブリダイゼーションオーブンの回転プラットフォームに置きます。組織片が透明になったら、生検を4mLのPBSで37°Cで6時間4回洗浄し、続いて37°Cで4時間37°Cで洗浄します1体積あたり20%重量のスクロースとPBSで

インキュベーションの終わりに、各サンプルを最適な切断温度の化合物で個々の15 mLチューブに80°Cで一晩凍結し、抗体浸透に対する組織の透過性を高めます。翌朝、適切な抗体と目的の重要な色素で皮膚サンプルを染色します。次に、試料を2mLチューブに入れた新たに調製した立方体2清浄溶液1 mLにインキュベートし、摂氏37度のオーブンで24時間、組織の屈折率を均一にします。

組織が透明な位置にあるとき、個々のガラスカバーの長辺に沿った生検は、毛包の成長方向がカバースリップ表面と平行になるようにスリップします。組織の上に立方体2溶液を1滴垂らします。1 mL x 2 cmの青い鋲を2枚カバースリップに置き、次に2枚目のカバースリップで生検を覆います。

次に、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡ステージに置き、組織を光経路に移動します。適切な光源と標準的な落射蛍光フィルターを使用して、サンプルをスキャンして蛍光染色された関心領域を特定し、関心領域の蛍光共焦点画像を取得します。この方法を用いて、成体野生型マウスの皮膚背側皮膚厚生検を解明し、基底ケラチノサイトマーカーであるケラチン14に対する抗体で染色することができる。

ダッピー陽性核はサンプル全体に見られ、真皮乳頭などの解剖学的特徴の一部を鑑賞することができます。K14の染色は、濾胞間表皮の1細胞の厚さの基底層で明らかです。毛包の皮脂腺と外根鞘、および毛包の膨らみ領域で検出されたK14発現のレベルが低い二次毛胚の輪郭を描きます。

する細胞の全層を視覚化するために、成体野生型マウスの休止期における背側皮膚生検を明らかにおよび染色することができ、実証されているように、基底濾胞間表皮および峡部における増殖性ケラチノサイトの存在を明らかにすることができますが、毛包の膨らみ領域には存在しません。成体野生型マウスの抗原における皮脂腺全層背側皮膚生検を解明し染色することで、毛包の峡部における皮脂腺の検出を容易にすることができます。表皮やトランスジェニック動物の形態変化を可視化するために、全層背側皮膚生検を解明し染色することで、毛包間表皮の過形成や、K14標識細胞塊が真皮近位に広がる異常な毛包を明らかにし、拡大したトランスジェニック幹細胞集団を表すことができます。

このビデオを見れば、皮膚サンプルを調製して明確にする方法、およびタンパク質発現パターンを単一細胞の分解能で3次元で視覚化する方法を十分に理解できるはずです。この方法は簡単に実行でき、比較的安全で安価な試薬を使用します。将来的には、この方法との適合性についてより多くの抗体が試験され、この分析を拡張して、より多くのタンパク質や特定の種類の関心を視覚化できるようになります。

ライトシート顕微鏡などの他のイメージング方法を使用して、より大きな皮膚サンプルの皮膚の解剖学的構造およびタンパク質発現パターンを3次元で視覚化することができます。この技術の開発後、皮膚科学の分野の研究者が、皮膚の恒常性、遺伝子組み換えマウスモデル、および皮膚疾患のモデルの1つで、真皮と表皮の間の細胞および分子の相互作用を探求する道を開くでしょう。