CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化
August 4th, 2016
このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。
この手順の全体的な目標は、単一細胞レベルでの細胞増殖とタンパク質発現パターンを3次元で視覚化し、皮膚の解剖学的構造と病理を正確に評価することです。この方法は、細胞および分子メカニズムが表皮の発達と再生をどのように制御するか、また、これらのメカニズムが皮膚疾患中にどのように摂動されるかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、全層皮膚生検の個々の細胞を前例のない精度で3次元で視覚化するための技術的に単純なプロトコルであることです。
また、この方法は、全皮膚サンプル中の表皮と真皮との間の相互作用の調査を容易にします。一般に、この方法に不慣れな研究者は、毛包に損傷を与えることなく小さな平らな皮膚生検を準備するのに少し苦労するかもしれません。この手順を実演するのは、UNSWオーストラリアの発達再生皮膚科ユニットの博士課程の学生であるBettyMaclariosです。
まず、トリマーを使用して安楽死させたマウスの首から毛を剃り、皮膚を傷つけないように注意します。次に、70%エタノールとPBSで皮膚を除染します。次に、鉗子で背側の首の皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して背側のマウスの皮膚の約1.5 x 4 cmの領域を取り除きます。
次に、サンプルの前方後方の向きをメモしながら、濾紙の上で皮膚の真皮面を下にして平らにし、解剖した皮膚の周りの紙を切り取ります。最適なイメージングのためには、皮膚サンプルを平らに保ち、毛包の向きを一定にする必要があります。サンプルを適切な前後位置に維持するために、長方形の生検で皮膚片を濾紙に固定します。
新たに調製した4%PFAとPBSを充填した15mLチューブにサンプルを移します。次に、濾紙にしっかりと固定されたら、標本を新しいPBSの15 mLチューブに移し、5分間の洗浄を2回行います。皮膚生検をクリアするには、2回目の洗浄後、鋭利なカミソリの刃を使用して組織を約0.2 x 0.5 cmの小片に切断し、サンプルの長辺がサンプルの前方後方向に沿って切断されるように注意します。
毛包の向きと平行に生検の側面に沿って切断することも、毛包の広範な損傷を回避するのに役立ちます。彼らは、新しい15mLチューブに新たに調製された立方体1清澄溶液5mLに生検を沈め、チューブを摂氏37度のハイブリダイゼーションオーブンの回転プラットフォームに置きます。組織片が透明になったら、生検を4mLのPBSで37°Cで6時間4回洗浄し、続いて37°Cで4時間37°Cで洗浄します1体積あたり20%重量のスクロースとPBSで
洗浄します。インキュベーションの終わりに、各サンプルを最適な切断温度の化合物で個々の15 mLチューブに80°Cで一晩凍結し、抗体浸透に対する組織の透過性を高めます。翌朝、適切な抗体と目的の重要な色素で皮膚サンプルを染色します。次に、試料を2mLチューブに入れた新たに調製した立方体2清浄溶液1 mLにインキュベートし、摂氏37度のオーブンで24時間、組織の屈折率を均一にします。
組織が透明な位置にあるとき、個々のガラスカバーの長辺に沿った生検は、毛包の成長方向がカバースリップ表面と平行になるようにスリップします。組織の上に立方体2溶液を1滴垂らします。1 mL x 2 cmの青い鋲を2枚カバースリップに置き、次に2枚目のカバースリップで生検を覆います。
次に、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡ステージに置き、組織を光経路に移動します。適切な光源と標準的な落射蛍光フィルターを使用して、サンプルをスキャンして蛍光染色された関心領域を特定し、関心領域の蛍光共焦点画像を取得します。この方法を用いて、成体野生型マウスの皮膚背側皮膚厚生検を解明し、基底ケラチノサイトマーカーであるケラチン14に対する抗体で染色することができる。
ダッピー陽性核はサンプル全体に見られ、真皮乳頭などの解剖学的特徴の一部を鑑賞することができます。K14の染色は、濾胞間表皮の1細胞の厚さの基底層で明らかです。毛包の皮脂腺と外根鞘、および毛包の膨らみ領域で検出されたK14発現のレベルが低い二次毛胚の輪郭を描きます。
増殖する細胞の全層を視覚化するために、成体野生型マウスの休止期における背側皮膚生検を明らかにおよび染色することができ、実証されているように、基底濾胞間表皮および峡部における増殖性ケラチノサイトの存在を明らかにすることができますが、毛包の膨らみ領域には存在しません。成体野生型マウスの抗原における皮脂腺全層背側皮膚生検を解明し染色することで、毛包の峡部における皮脂腺の検出を容易にすることができます。表皮やトランスジェニック動物の形態変化を可視化するために、全層背側皮膚生検を解明し染色することで、毛包間表皮の過形成や、K14標識細胞塊が真皮近位に広がる異常な毛包を明らかにし、拡大したトランスジェニック幹細胞集団を表すことができます。
このビデオを見れば、皮膚サンプルを調製して明確にする方法、およびタンパク質発現パターンを単一細胞の分解能で3次元で視覚化する方法を十分に理解できるはずです。この方法は簡単に実行でき、比較的安全で安価な試薬を使用します。将来的には、この方法との適合性についてより多くの抗体が試験され、この分析を拡張して、より多くのタンパク質や特定の種類の関心を視覚化できるようになります。
ライトシート顕微鏡などの他のイメージング方法を使用して、より大きな皮膚サンプルの皮膚の解剖学的構造およびタンパク質発現パターンを3次元で視覚化することができます。この技術の開発後、皮膚科学の分野の研究者が、皮膚の恒常性、遺伝子組み換えマウスモデル、および皮膚疾患のモデルの1つで、真皮と表皮の間の細胞および分子の相互作用を探求する道を開くでしょう。
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概要
この報告書は、全層マウスの皮膚生検を明瞭化し、タンパク質発現パターンと増殖細胞を3Dで単一細胞分解能で可視化することを可能にするCUBICプロトコルを説明しています。この方法は、特に遺伝子変異マウス系統の皮膚解剖学と病理の正確な評価を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 皮膚科学
- 細胞生物学
背景
- 表皮発生における細胞および分子メカニズムの理解。
- 皮膚疾患と再生プロセスの調査。
- 正確な皮膚生検分析の重要性。
- 毛包を傷つけずに皮膚サンプルを準備する際の課題。
研究の目的
- 3Dで細胞増殖とタンパク質発現を可視化する。
- 皮膚の解剖学と病理を正確に評価する。
- 表皮と真皮の相互作用を探求する。
使用した方法
- 組織明瞭化のためのCUBICプロトコル。
- 3D可視化技術。
- 単一細胞分解能分析。
- マウスモデルからの全層皮膚生検。
主要な結果
- 皮膚生検における個々の細胞の成功的な可視化。
- タンパク質発現パターンの理解の向上。
- 異常な表皮表現型への洞察。
- 皮膚疾患研究の促進。
結論
- CUBICプロトコルは、皮膚分析のためのシンプルかつ効果的な方法です。
- 皮膚細胞相互作用の可視化において比類のない正確さを提供します。
- この技術は皮膚科学と再生医療の研究を進歩させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The CUBIC protocol enables high-resolution 3D visualization of protein expression and cellular dynamics in full-thickness skin biopsies, supporting mechanistic de-risking in dermatology target validation. By providing single-cell resolution data on epidermal stem/progenitor populations and their interactions with the dermis, the method enhances predictive confidence in preclinical models of skin regeneration and disease. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses and reducing biological ambiguity in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell dynamics in intact tissue architecture.
- Scientific Value: Supports functional target validation through spatial mapping of proliferation (Ki67) and sebocyte differentiation (Nile Red) in genetically modified models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by quantifying abnormal epidermal phenotypes and stromal interactions in 3D without sectioning artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving epidermal-dermal architecture and appendage integrity.
- Operational Value: Enables reproducible quantitative outputs for protein expression and cell proliferation across conditions, supporting assay scalability.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a clear, intact tissue platform for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by visualizing hyperplasia, abnormal follicle morphology, and stem cell mass expansion in transgenic models.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through correlative analysis of K14, Ki67, and sebocyte markers with phenotypic outcomes.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into epidermal-dermal crosstalk during homeostasis and perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, enabling iterative assessment of skin-specific biological responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving spatial expression patterns of keratinocytes, proliferating cells, and sebocytes in intact skin.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized clearing and staining of full-thickness biopsies with consistent follicle orientation.
- Analytics: Generates quantitative 3D readouts on protein expression and cell density that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving disease-relevant epidermal and dermal structures for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing platform applicable across wild-type, mutant, and treatment-induced skin models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epidermal regeneration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a simple, solvent-based clearing protocol compatible with conventional confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of on-target and off-target epidermal effects in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on stem cell dynamics and sebaceous gland function in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunofluorescence staining to preserve epidermal appendages during biopsy preparation.
- Depends on access to a hybridization oven, rotating platform, and confocal microscope with standard epifluorescence filters for 3D imaging.
- Necessitates cross-team standardization of biopsy orientation and clearing duration to ensure consistent refractive index matching and imaging quality.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to thicker human skin explants or alternative mammalian models due to lipid and collagen content.
- Involves practical limitations related to the duration of clearing and washing steps, which may extend timelines for high-throughput screening applications.
