Name: CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶCUBICプロトコルによるマウス全層皮膚の透明化と単一細胞解像度でのタンパク質発現可視化法。3Dで皮膚の解剖と病理を正確に評価し、遺伝子改変マウス系統の研究に活用できます。

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私たちは、動物実験でのサポートのためにオーストラリアのバイオ資源（ガーヴァン研究所、オーストラリア）、生物資源センター（UNSWオーストラリア）とアニマルケア＆倫理委員会に感謝します。この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（プロジェクト無償APP1062720）によってサポートされていました。博士セザールP.カナレスはCONICYT-Becasチリの奨学金（＃72101076）の受取人です。氏Bassem AkladiosはUNSWオーストラリアによって大学国際大学院賞を受賞です。

倫理文：動物を対象とするすべての手順は、承認されたACECプロト​​コル13 / 64Bの下UNSWオーストラリアでの動物管理倫理委員会（ACEC）のガイドラインに従ってください。 透明なマウスの皮膚組織の作製注：この研究で使用した全てのマウスは、C57BL / 6遺伝的背景にありました<ol><li>マウスの皮膚組織のコレクション。 <ol><li>人道的に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。 </li><li>慎重に肌を巻かないように注意しながらトリマーに関連する皮膚領域から毛を取り除きます。 </li><li>洗浄皮膚は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の70％エタノールで除染します。 </li><li>鉗子で背首の皮膚を持ち上げ、ハサミで切開を行います。 </li><li>背側マウスの皮膚（約1.5×4センチ）の大面積を解剖。 </li><li>ろ紙上の皮膚真皮側を下に平らにし、サンプルの前後の向きをメモします。 </li><li>トライPBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で満たされた15mlチューブ内のM個のフィルタ切開皮膚の周りに紙、および場所。 </li><li> 4℃で冷蔵庫で一晩、室温で1時間、修正、または。 </li><li> 15ミリリットルチューブ内のPBSで洗浄皮膚2×5分。 注：以下の（1.1.10 - 1.1.12）は、組織の長期保存のためのオプションのステップです。 </li><li>室温で1時間の洗浄工程の間に15mlチューブ中のエタノール（25％、50％、70％）の濃度の増加に伴って、PBS中の切開皮膚を脱水。 </li><li>さらに使用するまで4℃で15 mlのチューブで、PBS中の70％エタノール中で脱水肌を保管してください。 </li><li> 4時間クリアする前に、室温で1時間の洗浄工程の間に15mlチューブ中のエタノール濃度（70％、50％、25％、0％）に減少してPBSで皮膚組織を再水和します。 </li></ol></li><li>マウスの皮膚生検をクリア<ol><li> 3.85グラムの尿素3.85グラムのN、N、N &#39;、N&#39;を溶解させることによってCUBIC1クリア溶液を調製70°C - 60に設定されたヒータに蒸留水を5.38ミリリットル中-tetrakis（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン。ホットスターラーを使用してください。 </li><li>それがクリアされ、室温まで冷却した後、溶液にポリエチレングリコールモノPイソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100 2.31グラム加えます。 </li><li>概略寸法0.2×0.5センチ生検に鋭利なカミソリの刃を持つマウスの皮膚をカットし、15mlチューブ内CUBIC1クリア溶液5mlに水没。毛包の可視化を最適化するために、生検の長辺は、サンプルの前後方向に沿って切断されていることを確認してください。 </li><li> 37℃でのハイブリダイゼーションオーブンで回転台に置きます。 </li><li> 7日後に決済ソリューションを変更します。使用前に、新鮮なCUBIC1溶液を調製します。 </li><li> 7日後の組織の透明性を確認してください。必要に応じて組織が完全に透明になるまで、CUBIC1クリア溶液中で生検を残します。 </li><li>皮膚生検が透明になったら、CUBIC1溶液を除去し、37℃で6時間、組織を4回洗浄するために1×PBSの4ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃で4時間、15ミリリットルチューブにPBS中/ vスクロースワット20％に皮膚組織を洗浄します。 </li><li> -80℃の冷凍庫で一晩15mlチューブに培地最適な切削温度（OCT）化合物を取り付ける際に組織を凍結します。 注：この手順は以降の抗体の浸透のための生検の透過性を増加します。 </li></ol></li></ol> 2.免疫蛍光染色<ol><li> 3時間 - 2室温まで）1.2.9から組織を解凍します。 </li><li> 10月の化合物を除去するため、室温で8時間、5mlのPBSで15ミリリットルチューブ内を洗浄する組織。 </li><li> 37でシェーカー上で3日間PBST（PBS + 0.1％トリトンX100）で100：2 mlチューブに移し生検、および両方が1に希釈し、1ミリリットルのウサギ抗Keratin14またはウサギ抗Ki67抗体で組織をインキュベートCオーブンを°。 </li><li> 15mlチューブに移し生検、AND 37℃のオーブン中でシェーカー上PBST 5ml中に6時間、組織を4回洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルチューブに移し生検は、1希釈した二次抗体をAlexa594抗ウサギ1ミリリットルを追加します。PBSTで100を、37℃のオーブンでシェーカー上で3日間インキュベートします。 </li><li> 15mlチューブに移し生検、および、37℃のオーブンでシェーカー上PBSTの5ミリリットルで6時間、組織4回洗浄します。 </li><li> PBST中で、37℃のオーブン中でシェーカー上で一晩インキュベート。2 mlチューブに移し生検を1mlの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、核対比染色溶液（千1）を加えます。 </li><li> DAPIの対比溶液を除去し、37℃のオーブンでシェーカー上で6時間、組織を4回洗浄するために2ミリリットルチューブにPBSTの1ミリリットルを追加します。 注：オプションのステップ：生検は、少なくとも3週間、0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS中で暗所に保存することができます。 </li></ol> 3.ナイルレッド染色<ol><li> 1M最終濃度にジメチルスルホキシド（DMSO）中のナイルレッド粉末を溶解しますグラム/ミリリットル</li><li> 1μg/ mlの最終濃度に1mlのPBSに1μlのナイルレッド溶液を加えます。 </li><li> 2室温まで）1.2.9から組織を解凍 - 3時間、室温で8時間、5ミリリットルのPBSで洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルチューブに生検を移し、室温で2.5時間、1ミリリットルナイルレッド染色液に組織を浸します。 </li><li>室温で30分間、1ミリリットルPBSTで4回を2ミリリットルチューブ内の皮膚生検を洗ってください。 </li><li> 2ミリリットルチューブからPBST溶液を除去し、DAPI核対比染色溶液（1：1,000）の1ミリリットルを追加PBST中、室温で一晩インキュベートします。 </li><li> DAPIの対比溶液を除去し、室温で6時間、皮膚組織を4回洗浄するために2ミリリットルチューブにPBSTの1ミリリットルを追加します。 注：オプションのステップ：生検は、少なくとも3週間、0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS中で暗所に保存することができます。 </li></ol> 4.イメージング<ol><li> 50が含まれているCUBIC2決済ソリューションを、準備％スクロース、25％（w / v）の尿素、10％（w / v）の（w / v）の2,2 &#39;、2&#39; &#39; - nitrilotriethanol、および0.1％（v / v）のトリトンX-100。 </li><li> 37℃のオーブンで24時間シェーカーで2ミリリットルチューブで1ミリリットルCUBIC2溶液中の皮膚組織をインキュベートします。このステップでは、組織の屈折率を均等になります。 </li><li>組織の透明性を確認してください。それが明確になったら、カバーガラス上にその長辺全体の皮膚生検（0.2×0.5センチ）の位置、毛包の長さ方向がカバーガラス面に平行なものであること（＃1 24×60 mm）の 注：オプションのステップ：抗体染色された生検材料は、約7日間CUBIC2溶液中で保存することができます。ナイルレッド染色生検は最大1日のCUBIC2溶液中に保存することができ、できるだけ早く画像化されるべきです。 </li><li>イメージング室を準備し（ 図1） F（ブルータック、生地を再生したり、類似の、および2カバースリップ（24×50 mm）の：イメージングチャンバーの製造のために必要な消耗品は次のとおりです。注意してくださいigureの1A）。 <ol><li>ブルータックの2つの薄いストリップ（直径約1ミリメートル×2センチ）、および2つのカバースリップ（ 図1B）を準備します。 </li><li>皮膚生検（ 図1C）のための十分なスペースを可能にする、1つのカバースリップ上にブルータックストリップを配置します。 4.4.3） </li><li> CUBIC2溶液の液滴（ 図1C）でカバースリップ上のストリップ間に皮膚生検を置きます。 </li><li>第二のカバーガラス（ 図1D）との皮膚生検をカバーしています。 </li></ol></li><li>共焦点顕微鏡のステージ上に取り付けられた皮膚生検とイメージング室を配置し、光経路に組織を動かします。 </li><li>関心の蛍光染色された領域を同定するために、水銀やハロゲン光源と、標準的な落射蛍光フィルターを用いて、試料（ 例えば、DAPI / GFP / CY3 / CY5）をスキャンします。 </li><li> 10X及び20X対物レンズを使用して目的の画像領域（NA 0.75）および標準共焦点蛍光イメージング技術（ 例えば 、DAと）620 nmの - PI染色したサンプルを、405nmレーザーを照射し、425の間の蛍光シグナルを収集 - 475 nmのを、およびAlexaフルーア594またはナイルレッド染色したサンプルを用いて561 nmのレーザーを照射し、570との間に蛍光信号を収集します。 </li><li>顕微鏡Zスタック画像収集ソフトウェアを使用して関心のある各領域の画像のZスタックを生成する（ 例えば 、下記のようにソフトウェア4.13を撮像NIS要素を使用して）。 <ol><li>最適なレーザーパワーとPMT HVを確認/オフセット設定は、サンプルの蛍光を収集するために選択されています。 </li><li> 「取得コントロール」から「ND取得」ツールバーを開きます。 </li><li> （他のすべてのタブが選択されていないであることを確認） &quot;Zシリーズの設定」タブを選択します。 </li><li>ライブスキャン中、サンプルの上部に焦点を当て、「トップ」ボタンを押してください。 </li><li>サンプルの底に焦点を当て、「下」ボタンを押してください。 </li><li>入力に必要なステップサイズ（またはプレスに最適化ステップサイズボタン）。 </li><li>プレssの「今すぐ実行」ボタンを押します。 </li><li>個々のTIFF画像スタック（画像Z-スタックあたり1蛍光色素）として得られたZ-スタックを保存します。 </li></ol></li><li> 3D解析ソフトウェアを使用して、目的の3Dボリュームの領域を再構成する画像のZスタックを使用する（ 例えば 、下記のようにIMARIS x64の7.2.3を使用して）。 <ol><li>解析ソフトウェアを起動します。 </li><li> 3Dボリューム生成のためのツールバーのボタンを「サーパス」を選択します。 </li><li>最初の色画像Zスタックを開きます（ 例えば 、DAPI）。 </li><li>追加のカラーチャンネル、蛍光色素ごとに一つのチャネルを追加するには、「チャンネルを追加」ツールを使用します。したがって、DAPIおよびアレクサフルオロ594蛍光色素の両方を含む試料は、2つのチャネルを必要とします。 </li><li>上記4.7で決定されるように、正しいピクセル（ボクセル）の寸法（XYZ）を設定するには、「画像のプロパティ」ツールを使用してください。 </li><li> （ 例えば、赤、青、アレクサフルオロ594チャンネルにDAPIチャネルを設定する）必要に応じて、チャネルの色を変更するには、「表示調整」ツールを使用してください。 </li><li> POへ画像ウィンドウ内の3Dボリュームをジション、必要に応じてクリックしてドラッグボリュームするコンピュータのマウスを使用します。 </li><li> 3D画像のスクリーンショットを生成するために、ツールバーの「スナップショット」ツールを使用してください。 </li><li> 3Dの試料回転の映画を生成するために、ツールバーの「アニメーション」ツールを使用してください。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li>
<li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li>
<li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secret+life+of+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li>
<li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+skin+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li>
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<li>Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+controls+stem%2Fprogenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li>
<li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li>
<li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Kinet%22%5BJournal%5D)">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li>
<li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li>
<li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749(2014).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

皮膚の発達および恒常性を制御する調節機構は、最も一般的には、皮膚の形態、細胞集団またはタンパク質発現の唯一の制限認識を可能にする、抗体を用いて組織切片、組織学的染色又はラベリングを用いて2次元で研究されています。多くの方法は、表皮全体マウント10-13で3次元的に単細胞解像度における細胞およびタンパク質の空間的組織の視覚化を改善するために開発されてきました。これらのいくつかは、しかし、特に毛深い皮膚を使用して技術的に困難であり、多くの場合、毛嚢の組織の損傷および破壊をもたらす真皮から表皮を分離することを伴います。また、表皮と真皮の分離は、胚発生および組織恒常性の間にそれらの間に発生する細胞および分子間相互作用を研究損ないます。 「フラットマウントアプローチ」全厚マウス別の方法であります皮膚を切開し、免疫染色し、その後、免疫蛍光信号14を維持しながら、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール（BBBA）を使用して明らかにされています。この方法は、真皮から表皮の技術的に困難な分離を必要としません。しか...

皮膚は私たちの生存に必須です。それは3つの主要な層の外側表皮、真皮および皮下組織で構成されています。表皮は非常に再生組織です。それは主にケラチノサイトからなる扁平重層上皮です。ケラチノサイトは基底層で生まれ、差別化しながら、基底上層を通って上方に移動し、最終的に彼らは彼らの出生後約一ヶ月外側角質層に流されているされています。表皮は、毛包や皮脂腺などの付属の数を開発しています。毛包はまた、人生1を通して循環方式で再生します。表皮の再生能力は、毛包間表皮と毛包2の基底層に位置している幹細胞および前駆細胞の存在によって有効になっています。 多くのシグナル伝達経路は、表皮の開発と再生に関与しています。これらのいくつかは、内に発生しますこのようなヘッジホッグ経路などの表皮のみ、。他のシグナル伝達事象は、真皮と表皮3との間で行われます。例えば、真皮からのWntシグナルは、毛包の発達のために重要であると考えられ、それらは毛包バルジ幹/前駆細胞の増殖および毛包の成長4を活性化する成長期の開始時に真皮乳頭によって分泌されます。より良い彼らは、皮膚癌などの再生皮膚病に撹乱することができる方法を理解するために、表皮の開発と再生を制御する細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。 この記事では、Cのリアを説明し、Uは、 私はカクテルやC omputational分析全体の皮膚の準備をマウントし、共焦点顕微鏡により単一細胞の解像度で3次元でのタンパク質発現パターンを可視化明確にする（CUBIC）プロトコル5-7を maging Bの雨をnobstructed。キュービック法は、皮膚を浸漬することを含みます2アミノアルコールベースの​​化学カクテルで組織。これらのソリューションは、単一細胞の解像度で免疫検出を可能にする、透明およびタンパク質が無傷組織を残して、皮膚試料の屈折率を調整します。 このCUBICプロトコルを使用して、毛包間表皮および毛包における基礎および増殖性ケラチノサイト集団は完全な抗Keratin14を使用して、野生型マウスの厚さの皮膚生検（K14）および抗Ki67の抗体で画像化しました。野生型皮膚生検における皮脂腺も、ナイルレッド染色を用いて可視化しました。最後に、野生型および過形成YAP2-5SA-ΔCの皮膚生検における基底ケラチノサイト集団が8を比較しました。 このCUBICプロトコルは、単一細胞の解像度で全層皮膚生検におけるタンパク質発現の視覚的評価を可能にし、遺伝的に改変されたの皮膚における表皮解剖学と形態学的欠陥を理解する重要なツールですマウスは、表皮の発達と再生の基礎となる細胞および分子機構を調査します。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96% (未変性)</td><td>Chem-supply</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>ナイルレッド</td><td>シグマ-アルドリッチ&nbsp;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>ロシュ</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-テトラキス (2-ヒドロキシプロピル) エチレンジアミン</td><td>メルクミリポア</td><td>821940</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール モノ-p-イソオクチルフェニルエーテル</td><td>メルクミリポア</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>メルクミリポア</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>最適切断温度 (OCT) 化合物</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>抗ケラチン14抗体</td><td>コーヴァンス</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ki67 抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチウサギ アレクサ 594</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ A21207</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマ - アルドリッチ&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr>尿<tr><td>素</td><td>メルクミリポア</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;,2&prime;'-ニトリロトリエタノール</td><td>メルクミリポア</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Nikon A1 - 共焦点顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>cruZer6 フェイストリマー</td><td>ブラウン</td><td>cruZer6 フェイス</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>438456</tr></tbody></table>

cubicプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

皮膚は私たちの生存に必須です。外側の表皮層は、毛包と汗腺のように私たちの体、および表皮付属のほとんどをカバーする重層扁平上皮である毛包間表皮、から構成されています。表皮は、生涯を通じておよび傷害に応答して再生を受けます。これは、しっかりと、表皮内および表皮と真皮の間の積極的な複数の調節機構によって調節されているK14発現基底表皮幹細胞/前駆細胞集団で有効になっています。この記事では、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、K14のタンパク質発現パターンを可視化するための簡単​​な方法を説明し、Ki67には増殖細胞を標識し、ナイルレッドは、3Dでの単一細胞の解像度で皮脂細胞、およびDAPI核の標識標識。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価と定量化を可能にします。 CUBICプロトコルは番目です単一細胞の解像度で全層皮膚生検における分子と細胞の相互作用を調査する日付に利用可能な電子最良の方法。

大人の野生型マウスの全層背部皮膚生検を基底ケラチノサイトマーカーKeratin14（K14）に結合する抗体で染色し、明らかにした、そして核はDAPI染色溶液（ 図2およびムービー1）で対比染色しました。 DAPI陽性の核は、サンプル（ 図2A、C）を通して見えた、とK14染色は、毛包間表皮の1セル厚の基底層に独占的に見えた、と皮脂腺（黒アスタリスク）、の外毛根鞘を概説します毛包は、セカンダリヘア細菌（ 図2B、C）には、先に9を発表しました 。 K14染色強度は毛包間表皮、遠位毛包と二次毛の細菌（白アスタリスク）で高く、それは、毛包（ 図2C中のBu）のバルジ領域では比較的低かったです。真皮乳頭はまた、明らかにvisiblましたDAPI標識（ 図2Cの矢印）を介して電子。 大人の野...

このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

本手順の全体的な目的は、単一細胞レベルでの細胞増殖とタンパク質発現パターンを三次元的に可視化し、皮膚の解剖学的構造および病理学的状態を正確に評価することです。この手法は、細胞および分子メカニズムがどのように表皮の発達と再生を制御しているか、また、皮膚疾患においてこれらのメカニズムがどのように乱されるかという重要な疑問を解明するのに役立ちます。本技法の主な利点は、全層皮膚生検における個々の細胞を、かつてない精度で三次元的に可視化できる技術的に簡便なプロトコルであることです。この手法は、完全な皮膚サンプルにおける表皮と真皮の相互作用の調査にも有用です。一般的に、この手法に慣れていない研究者は、毛包を損傷させずに小さな平坦な皮膚生検試料を調製することに多少苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、UNSW Australiaの発生・再生皮膚科学ユニットの博士課程学生であるBetty Maclariosが行います。まず、トリマーを用いて安楽死させたマウスの首の毛を剃り、皮膚を傷つけないように注意します。次に、70% ethanolとPBSで皮膚を洗浄します。続いて、ピンセットで首背側の皮膚を持ち上げ、ハサミを使用してマウスの背側皮膚を約1.5 by 4 cmの範囲で切り出します。次に、サンプルの前後方向を記録しながら、皮膚の真皮側を下にしてフィルターペーパー上に平らに置き、切り出した皮膚の周囲のペーパーをトリミングします。最適なイメージングのためには、皮膚サンプルを平らに保ち、毛包の方向を一定にする必要があります。サンプルを適切な前後方向に維持するため、フィルターペーパー上で皮膚片を長方形の生検試料として固定します。サンプルを、新しく調製した4% PFAおよびPBSを満たした15 mLチューブに移します。その後、フィルターペーパーにしっかりと固定されたことを確認し、検体を新しいPBS入りの15 mLチューブに移し、5分間の洗浄を2回行います。皮膚生検組織を透過させるため、2回目の洗浄後、鋭利なカミソリを用いて組織を約0.2 by 0.5 cmの大きさに切断します。その際、サンプルの長い辺がサンプルの前後方向に沿って切断されるように注意してください。生検組織の側面に沿って、毛包の方向に平行に切断することも、広範な毛包の損傷を避けるのに役立ちます。次に、生検組織を新しい15 mLチューブに入れた、新しく調製した5 mLのCubic One透明化溶液に浸し、そのチューブを37 °Cのハイブリダイゼーションオーブン内の回転プラットフォームに設置します。組織片が透明になったら、37 °Cで4 mLのPBSを用いて6時間の洗浄を4回行い、続いて20% w/v sucrose含有PBSを用いて37 °Cで4時間の洗浄を行います。インキュベーション終了後、抗体の組織浸透性を高めるため、各サンプルを個別の15 mLチューブに入れ、OCTコンパウンド（最適凍結切断温度化合物）とともに-80℃で一晩凍結させます。翌朝、皮膚サンプルを目的の適切な抗体およびバイタル染色液で染色します。その後、組織の屈折率を均一にするため、新鮮に調製した1 mLのCuBE 2透明化溶液と共に2 mLチューブに入れ、37℃のオーブン内にあるシェーカーで24時間インキュベートします。組織が透明になったら、毛包の成長方向がカバーガラスの表面と平行になるように、個々のガラスカバースリップの長い辺に沿って生検試料を配置します。組織の上にCubic 2溶液を1滴滴下します。カバースリップ上に1 mL × 2 cmのブルータックを2本置き、その後、生検試料を2枚目のカバースリップで覆います。次に、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡のステージ上に配置し、組織を光路に移動させます。適切な光源と標準的なエピ蛍光フィルターを用いてサンプルをスキャンし、蛍光染色された関心領域を特定した後、その関心領域の共焦点蛍光画像を取得します。この方法を用いることで、成体野生型マウスの背部皮膚生検組織の厚みを維持したまま透明化し、基底角化細胞マーカーであるkeratin 14に対する抗体で染色することが可能です。サンプル全体にDAPI陽性核が観察され、真皮乳頭などの解剖学的特徴を確認することができます。K14染色は、毛包間表皮の1細胞層からなる基底層に認められます。また、皮脂腺、毛包の外根鞘、および二次毛芽の輪郭が染まっており、毛包のバルジ領域ではK14の発現レベルが低いことが検出されます。増殖細胞を可視化するため、成体野生型マウスの休止期の背部皮膚全層生検組織を、実演通りに透明化および染色します。これにより、基底層の毛包間表皮および毛包の峡部（isthmus）には増殖中の角化細胞が存在し、バルジ領域には存在しないことが明らかになります。皮脂腺を可視化するため、成体野生型マウスの休止期の背部皮膚全層生検組織を透明化および染色し、毛包の峡部領域における皮脂腺の検出を容易にします。表皮の形態変化およびトランスジェニック動物を可視化するため、背部皮膚全層生検組織を透明化および染色します。これにより、毛包間表皮の過形成と、K14標識細胞塊が真皮に向かって近位に伸展した異常な毛包が認められ、これは拡大したトランスジェニック幹細胞集団を表しています。このビデオを視聴することで、皮膚サンプルの調製と透明化の方法、および単一細胞レベルの解像度でタンパク質発現パターンを三次元的に可視化する方法について、十分に理解することができます。この手法は実施が簡単であり、比較的安全で安価な試薬を使用します。将来的には、さらに多くの抗体の本手法への適合性を検証することで、より多くのタンパク質や特定の関心領域の可視化へとこの解析を拡張することが可能です。より大きな皮膚サンプルの皮膚解剖学的構造およびタンパク質発現パターンを3次元で可視化するために、ライトシート顕微鏡などの他のイメージング法を用いることができます。この手法の開発により、皮膚科分野の研究者が、皮膚の恒常性における真皮と表皮の間の細胞および分子レベルの相互作用を、遺伝子改変マウスモデルおよび我々の皮膚疾患モデルの一つにおいて探索する道が開かれるでしょう。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

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質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキシング(TB/TB)マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。...

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組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

反復漂白拡張多重性(IBEX)と市販のヌクレオチド標識アッセイ(Click-iT...

組織サンプル中の皮膚細胞の表現型と増殖状態を評価するためのハイスループットイメージングおよび分析ワークフロー

学ぶCUBICプロトコルによるマウス全層皮膚の透明化と単一細胞解像度でのタンパク質発現可視化法。3Dで皮膚の解剖と病理を正確に評価し、遺伝子改変マウス系統の研究に活用できます。

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

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