の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌と人間

次の実験の全体的な目標は、内在化細菌RIA 髄膜炎と細胞骨格タンパク質 Alpha Actinin の共局在のレベルを評価することです。これは、培養したヒト脳微小血管細胞に細菌を3〜8時間一晩培養して感染させ、細菌が標的細胞に侵入できるようにすることによって達成されます。第2のステップとして、細胞内細菌を含む細胞を洗浄、固定、浸透させ、感染した培養物を調製して、内在細菌と細胞内αアクチニンの免疫染色を行います。

共焦点イメージングと共局在ソフトウェアの適用に続いて、細胞内共局在の画像を観察し、OPCを発現するMeninga Crociおよび膜タンパク質が細胞内αアクチニンと特異的に相互作用できることを示す定量化された結果が得られます。こんにちは、ブリ大学細胞分子医学科のMata TI研究室のIsel Mariaです。今日は、細胞内細菌と細胞骨格タンパク質のcolのレベルの推定手順を示します。

当研究室では、この手順を用いて、自己膜タンパク質OPCを発現する菌糸体髄膜炎と細胞骨格タンパク質αアクチンとの相互作用を研究しています。それでは、始めましょう。この作業は、適切な安全実験室で行う必要があります。

免疫染色手順の2日前に、目的の細菌染色を脳の心臓注入に接種します。10%加熱された馬の血液を添加した寒天プレートは、免疫染色の前日に5%二酸化炭素雰囲気で摂氏37度で一晩成長します。10マイクロリットルの培養ループを使用して、一晩の細菌培養液を懸濁させます。

2ミリリットルのPBSBで、懸濁液を室温で5分間放置して、大きな細菌凝集体が沈殿するのを待ちます。次に、懸濁液の上部1ミリリットルをペレットを乱すことなく滅菌チューブに移し、細菌を可溶化し、細菌懸濁液の20マイクロリットルを含む2つのバイアルに1ミリリットルの1%SDS 0.1モル水酸化ナトリウムを加え、チューブを反転させて混合する。細菌数を推定するため。

溶液の吸光度を測定することにより、核酸含有量を測定します。216では、蟻は、ヒトの脳微小血管内皮細胞に感染するための感染培地中の必要な密度に細菌懸濁液を調整します。ヒト脳微小血管内皮細胞(H-B-M-E-C-A)を免疫染色の2日前に播種し、16mmガラスカバースリップを12ウェルプレートのウェルに配置し、HBME海を50%コンフルエンスで播種し、カバースリップに50%コンフルエンスでHBME海を播種し、翌日、5%二酸化炭素雰囲気中で摂氏37度で一晩インキュベートします。

私たちの研究室で新しく調製された細菌懸濁液を細胞に感染させます。標的細胞あたり200〜300コロニー形成単位の感染率が日常的に使用されています。感染期間の終わりに、5%二酸化炭素中で摂氏37度で3〜8時間インキュベートします。

PBSで細胞を3回洗浄し、室温で500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドを30〜45分間固定しますパラホルムアルデヒドを洗い流した後、PBSで希釈した0.1%Triton X 100で10分間インキュベートすることにより、パラアルデヒド固定細胞を透過します。最後に、サンプルをPBSで3回洗浄し、図のように免疫染色に進みます。次に、細胞内細菌とアクチニンのdforの染色を同時に行うことができます。

12ウェルプレートでは、透過性細胞を含むカバースリップを500マイクロリットルの3%B-S-A-P-B-S-Tで30〜60分間ブロックします。室温でPBS転写して洗浄した後、各カバースリップを12ウェルプレート内の新しいドライウェルにバクテリアとαアクチニンに対する一次抗体で同時に80〜100マイクロリットルのカバースリップ1枚あたり80〜100マイクロリットルの抗体をカバースリップの表面を覆うように注意深く追加すれば十分であり、室温で1時間インキュベートしてインキュベーションを終了し、 に200マイクロリットルのPBSを追加し、カバースリップをしっかりと持ち上げて、500マイクロリットルのPBSを含む新しいウェルに入れます5分後、ピペッティングでPBSを取り外し、新しいPBSを追加します。これを2回繰り返して、カバースリップを新しいドライウェルに移します。

次に、1%B-S-A-P-B-S-Tで希釈した異なる蛍光色素に結合した適切な二次抗体を添加し、インキュベーションの最後に室温で1時間インキュベートし、インキュベーションの最後に室温で1時間インキュベートし、前に示したように、DPIでDNAをDPIで5分間対比染色し、このインキュベーションの最後に、カバーをPBSで一度洗浄し、PBSで一度スリップした後、一滴のマウンティングでマウントします。ミディアムマウントのカバースリップは、観察の準備ができるまで暗闇に保管する必要があります。顕微鏡下では、倒立型エピ蛍光顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、免疫標識サンプルの画像を観察およびキャプチャします。

対物レンズにインマーサルを一滴垂らしてCLSM手順を開始し、試料のスライドカバーを置き、顕微鏡ステージに滑り降り、顕微鏡を視覚モードに設定し、顕微鏡の接眼レンズを使用して関心のある領域を見つけるために、ライカソフトウェアを使用する準備が整いました。XY zed 取得モードを選択します。共局在研究には、five 12 x five 12 形式を選択します。

解像度が高いほど、画像の精度が高くなります。次に、双方向Xモードを選択すると、スキャン速度が向上し、写真の漂白が減少します。シーケンシャルスキャンの設定を行います。

SEC関数をクリックし、行間を選択します。レーザービームは、二次抗体に結合した蛍光色素に従って選択してください。DPIの場合は4 0 5ナノメートル 4 88ナノメートル Alexa、Fluor 4 88および5 61ナノメートルの場合。

trixyの場合は、光電子増倍管1、2、3をそれぞれアクティブにします。Z スタックまたはシリーズの上下を設定します。次に、Zed ステップ サイズを 0.2 マイクロメートルに設定します。

RIA Menciusはディプロオキュスであり、各コーカスの直径は約0.5マイクロメートルであるため、Zステップサイズが0.2マイクロメートルの場合、各コーカスを少なくとも2回スキャンする確率が高まります。開始をクリックして信号対雑音比を改善するために、3のライン平均化を選択して最終的なスキャンパラメータを設定します。二重または三重に染色された画像は、異なる波長でシーケンシャルスキャンを行い、各チャネルのライン間モードを使用して異なる発色団間のクロストークを排除することによって取得されます。

2つの蛍光色素の共局在を示すには、オーバーレイ機能を選択して、選択したチャンネルを1つの画像にマージします。たとえば、Alexa 4 88 と trissy Fluor Chromes の共局在化がオーバーレイされた画像に黄色が表示される場合、共局在の可能性を視覚化するために必要な 2D 再構成は、最大投影関数を使用して Zed スタックまたはシリーズをコンパイルします。Zスタックまたはシリーズを取得した後、データを処理して直交画像を取得し、さまざまな要素の細胞内局在を視覚化します。

共局在の定量は、IMP provisionのVol Cityソフトウェアを使用して行われます。CLSM 画像を含むライブラリの作成を開始するには、トップ バーの画像から拡張フォーカスを選択します。このツールは、Zacksを2D画像に結合して分析します。

次に、COLOCALIZATION ツールを選択します。分析する 2 つのチャネルは、同じ色深度である必要があります。定量化する領域を選択します。

背景を削除するためのしきい値を設定します。[generate colocalization] を選択して、コローカライゼーション出力を作成します。コローカライゼーション統計は、以前に選択した関心領域に対して生成されます。

次に、マンダーの係数 R と ny を選択します。最後に、データ表示のためのExcelドキュメントに値をエクスポートまたは統計し、ここに8時間メニンガコックアイに感染したヒト脳内皮細胞の代表的な共焦点イメージング結果を示します。バクテリアの位置は赤で示されています。

アルファアクチニンの位置は緑色で示されていますが、矢印は細菌の周囲にアルファアクチニンの蓄積が高度に発生していると思われる領域を示しています。この重ね合わせ画像では、黄橙色が現れる領域がいくつかあり、髄膜occiとαアクチニンの共局在を示唆しています。この次の画像では、感染したH-B-M-E-C単層の光学解剖は、細胞の基部に位置する細胞内細菌の周りの共局在を示しています。

感染したH-B-M-E-C単層の3次元画像を処理したところ、頂端面の斜めの図では、赤色の矢印で示されたデュラント菌が赤色に染色されており、黄色の矢印で示されている内皮細胞の基底表面に向かっていくつかの細菌が位置しています。基部の位置がはっきりとオレンジ色、黄色であることは、このエンドンXZの断面でよりはっきりと見ることができます。これとは対照的に、アクチニン実験では、内在化細菌とメントンまたはアクチンのいずれかを標識した実験では、アクチンとの共局在は時折見られますが、H-B-M-E-C細胞での発酵との共局在はまれです。

前の実験で観察されたように、レチンは白い矢印で示されているいくつかの内在化された細菌の周りに集中していました。また、相対的な重複を得るためにデータを分析しました。係数Rは、マンダによれば、共局在IEの真の程度を表し、髄膜炎菌を発現するOPCに感染したH-B-M-E-Cにおけるαアクチニン、メンティングおよびアクチン全体の総画素数およびNY値と比較した共局在するピクセル数が、髄膜炎菌における手綱の25%以上のオーバーラップが得られた。

係数とYは、より豊富な手綱信号の通貨の周波数の尺度であり、その都度、より少ない存在量のメニンガカカオ信号が発生します。この測定値は、内在化した髄膜コックアイの近傍でアルファアクチニンが著しく出現することを示しています。この実験では、細胞骨格要素を持つ内在化細菌の導入を視覚化し、定量化する方法を示します。

構造の完全性を維持し、高いバックグラウンドを避けるために、固定および免疫ステムのプロトコルに厳密に従うことを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。