Name: 回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶ回転ディスクTIRF顕微鏡法による細胞接着形成の可視化手法。高速3次元イメージングで細胞膜タンパク質の動態を解析し、細胞生物学研究に有用な知見を提供します。

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科学界の医療センター ハンブルク大学エッペンドルフ評価用サンプルで私たちを支援するため大いに感謝いたします。すなわち、NIH3T3 細胞、YFP ビンキュリンのアンドレア ・ Mordhorst と RFP Lifeact のマレン ルドルフをザビーネ Windhorst を感謝いたします。

1. 細胞の調製
<ol><li>2 日前の実験はシード 6 も細胞培養プレートのウェルあたり完全な成長媒体の 2 mL で 3 * 105 hela 細胞または NIH3T3 細胞です。このプロトコル全体の層流フードのセルを処理するを確認します。</li>
	<li>実験の前日は、製造元の推奨事項または経験的に決定されるプロトコル、例えばによるとトランスフェクション試薬を準備します。<ol>
<li>Lifeact RFP の 1 μ g と YFP ビンキュリン 200 μ L 減少血清中の合計で 1 μ g を希釈します。渦のトランスフェクション試薬簡潔に、4 μ L 200 μ L の DNA と渦に再度追加します。室温で 15 〜 20 分のトランスフェクション ミックスを孵化させなさい。</li>
		<li>セルに直接滴下全体トランスフェクション ミックスを追加します。プレートを揺することによって混合し、インキュベーターに戻します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験の日、ライブ イメージングのサンプルを準備します。<ol>
<li>35 mm ガラス底皿のガラス表面をコートする PBS におけるフィブロネクチンの 10 μ g/mL の溶液を準備します。最適なパフォーマンスの全反射高品質 0.17 mm ガラス coverslips のみを使用し、プラスチック製の底皿を避けます。常温で 30 分はそれを削除し、空気乾燥させる料理のガラス表面にソリューションを残します。</li>
		<li>1.8 倍の蒸留水で mL あたり 109粒子の密度に 0.1 μ m マルチ蛍光ビーズ ソリューションを希釈し、フィブロネクチン コート ガラス面に 30-60 秒のためのソリューションを追加します。解決策はすぐに削除、空気乾燥させる料理。 注: この手順は、ビーズによる画像登録の 2 色参照イメージを取得および/または細胞を播種する前に全反射面がある場合にのみ必要です。</li>
		<li>0.1 M アスコルビン酸 (AA) ソリューションを準備し、0.1 mM 成長培地 (AA 中) の最終濃度に希釈します。37 ° C の水浴にソリューションを配置します。 注: 使用蛍光最適化培可能であれば、このような phenolred-無料 (リボ-) フラビン減少中。AA は、ライブ イメージング14中に光毒性の影響を減らすことができる抗酸化剤です。我々 は、この分析では、すなわち複数のセル登場 AA 添加せずより適用される条件の下で健康的な正常にそれをテストしています。ただし、培地の pH は、0.17 pH 単位で下げられました。</li>
		<li>2 ml の PBS セルを洗浄して、250 μ L を追加トリプシン-EDTA とセルが完全になるまで待つ戸 (37 ° C の定温器で 2-3 分)。再懸濁しますセル 1 mL に慎重にピペットで AA 中で加温、4 ml AA 培地 15 mL 細胞培養管にそれを追加します。顕微鏡の近くの 37 ° C および 5% の CO2に設定インキュベーターに少し開いた蓋の細胞懸濁液を配置します。</li>
		<li>1 mL ガラス底皿 AA 中で加温し、事前に加熱された顕微鏡のホルダーを追加 (次の段落を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ライブ イメージング
<ol><li>安定した 37 ° C、5% CO2湿気のある大気を達成するために顕微鏡の環境制御を開始します。 注: ここでは、小さなステージ トップ インキュベーション室使用されている約 15 分大きいインキュベーター内で許可されている安定した設定が安定した状態を達成するためにより多くの時間を必要があります。</li>
	<li>細胞懸濁液を適用する前に、顕微鏡で取得のすべての設定を修正します。<ol>
<li>時間間隔 30 に設定 s と 60-90 分に期間ごとの時点 (値「1」) でオート フォーカスをハードウェア ベースのオート フォーカス機能をアクティブにします。</li>
		<li>カメラの露出とゲイン、すべてのチャネルのためのレーザー出力の調整します。レベルの高利得、低露光時間と低いレーザー力、写真毒性を減らすためにお奨めします。 注: ここに示すデータは 200 ms 露出に買収されました、488 の 0.5 W/cm ² の励起強度に等しいレベル 500 と 20% レーザー電力利得 nm、1 W/cm ² 561 の nm、それぞれ。</li>
		<li>0.4 μ m 間隔で 10 μ m に回転ディスク チャネルの z スタックを設定します。ド全反射チャンネル z スタックを有効に。ハードウェアのオート フォーカスのフォーカス位置を「0」、すなわち最低平面になります下オフセットを設定します。</li>
		<li>多地点機能「ステージ ポジション」をアクティブにします。 注: 30 s の時間で 3 つのポジションまでを記録できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>眼またはコンピューターの画面上にエピ蛍光照明蛍光ビーズを見つけるし、全反射チャネルを 1 つをアクティブにし、照射角を全反射照明を示す値に設定。顕微鏡のパネルでボタンを押してオート フォーカスをアクティブにしてオフセットのホイールとフォーカスを調整します。その後ビーズ画像登録、2 色データセット、つまり全反射 488 と全反射-561 を取得 (を参照してくださいポイント 3.1)。<ol>
<li>オプション: 全反射照明を確保するため、追加自由にフローティングの多色蛍光ビーズ懸濁液の数マイクロリットル (を参照してくださいポイント 1.3.2。)。全反射チャネルのライブビューをアクティブにし、照明角度を大ききます。正しい全反射照明8を確保する臨界角を超えて非付着ビーズが消えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 回、閉管の反転によって再び細胞懸濁液を混ぜるし、セルの 1 mL をイメージングの皿に適用します。</li>
	<li>低レベル エピ蛍光照明ダブル transfected セルをすばやく見つけます。明視野照明を使用してライブ カメラのプレビューでセルの中心し、位置をマークします。別 1-2 観光名所を検索し、位置リストに保存します。 注: 初めに、セル簡単に外し舞台上の動きのため、それゆえ 4-5 ポジション設定、できますすべて画像の取得を開始する前に再チェックします。その後、1-2 の位置を破棄します。</li>
	<li>「順序」ボタンをクリックしてしてデータ集録を開始します。</li>
</ol>3. 画像の後処理 ImageJ で
<ol><li>フィジー15で登録無料の hyperstack を生成するためには、2-4 チャンネル SD 全反射蛍光タイムラプス データセットに適用することができる「SD TIRF_helper」という名前のマクロを書かれています。サブフォルダー「マクロ」、フィジーの「SD TIRF_helper_JoVE.ijm」ファイルを保存し、、メニュー コマンドをクリックして、マクロを実行"プラグイン > マクロ > 実行..."。<ol>
<li>カラー チャンネル登録修正が必要、オプションを選択し新しいビーズ ベースの登録参照 (ランドマーク ファイル) を作成または前に作成された既存のファイルを使用します。 注: turboreg プラグイン16は、蛍光ビーズの参照画像に適用されます。プラグインのインストールの一般的なガイドラインに従って、フィジー ソフトウェアのプラグインをインストールします。</li>
		<li>バイオ形式のインポーターとデータをインポートし、表示オプションとして hyperstack を選択します。画像データセットを読み込み、最初の手順と 2 番目のステップで全反射シリーズの SD シリーズを選択します。フィジーは、チャネルとステージの位置、すなわち通常すべて SD のチャンネルとすべての全反射チャンネルは選択されているすべての段階の位置の 1 つ hyperstack として表示で並べ替えられたデータが表示されます。 注: データのインポート、各種ファイルから可能な限りたとえば TIFF シリーズまたはプラットフォーム依存のファイルの種類のように * .nd。それは独立した、圧縮 TIFF 形式として取得ソフトウェアによってエクスポートされなかった場合にのみ、ファイルの種類を認識できません。</li>
		<li>事前に決められたランドマーク ファイルを読み込み、それぞれのチャンネルに登録補正を適用します。</li>
		<li>すべての SD と全反射チャネルの希望カラー ルックアップ テーブル (LUT) を選択し、それらをマージして単一の多次元 hyperstack。 注: 強度値がゼロの z 平面の数は全反射チャンネルの処理中に SD データセットで z 平面の数と一致する底面の上に追加されます。この手順は、最終的な hyperstack の可視化が重要です。この方法論が正しければ、全反射照明の深さから SD スタックの z ステップ サイズより小さい (200 nm7未満) は (400 nm)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li>
<li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).</li>
<li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li>
<li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li>
<li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+%CE%B1-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li>
<li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
<li>Chen, B. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li>
<li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿で示したライブセル イメージング実験、3 の異なるステージで 1 分あたり 2 SD 全反射画像のスタックなど高い獲得率すなわちを実行に適した構成で SD と全反射顕微鏡の最初の成功の実装合計 (およそ毎秒 3 フレーム)、168 のフレームに対応する位置に買収されました。されたいくつかの SD 全反射顕微鏡は前述12,13、主に、3 D の細胞プロセスに従うことの十分に高いイメージング速度の不足 2 未満の時間分解能画像のスタックあたり s がしばしば必要。提示セットアップは 1 秒あたり 0.78 画像のスタック最大イメージング、3.5 の転送速度を達成できる調査 3 D 小胞ダイナミクスがされているライブの実験で大きな画像のスタック毎秒7を示した。さらに、前の SD 全反射顕微鏡イメージング モードでは、さらに多チャンネル集録速度を下げるあたり 1 つだけ検出器があった。技術的には、分割ビュー構成を実装できるシステムにもできる同時のデュアル カラ...

日々、固定高/超解像イメージングと生体試料を提供する光学顕微鏡技術は急速に発展します。超解像技術枯渇 (STED) 構造化照明顕微鏡 (SIM) と光活性化ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) または直接確率光再建顕微鏡 (嵐) の刺激をそれぞれ、市販分子スケール1,2,3,4,5,6のほとんどの詳細を示す細胞レベル下の構造のイメージングを有効にして。ただし、これらのアプローチは、大量が 2 番目の集録速度あたり複数のフレームを可視化する必要がありますライブ イメージング実験の適用性をまだ制限が。非常にダイナミックなプロセスを介して細胞膜、例えば遠藤 - 規制の品種/エキソサイトーシス、粘着性、移行、シグナル伝達、細胞大量に高速で発生します。最近、このギャップを埋めるために統合された顕微鏡法は提案と呼ばれる回転ディスク-全反射 (SD 全反射)7だった。詳しくは、全反射型顕微鏡特に分離膜8,9をローカライズ、SD 顕微鏡は最も敏感なと高速可視化と追跡のためのイメージング技術をライブすることができます。細胞質10,11細胞小器官。単一のセットアップの両方のイメージング技術の組み合わせが過去12,13で実現されている、ただし、ここ (図 1) に示す顕微鏡は最後にライブ イメージング SD 全反射実験を実行する条件を満たしています。3 コマ/秒のスピードで前述のプロセス。この顕微鏡は市販、この原稿の目標は詳細を説明して、画像の取得、登録、および関連付けられている SD 全反射型顕微鏡可視化のためのオープン ソース ツールやプロトコルを提供することです。
セットアップは、独立したポートを介して 2 つのスキャン ユニットに接続されている倒立顕微鏡に基づいている - の左側のポートは全反射し、光活性化/-漂白の SD ユニット、スキャナー ユニットを背面のポートにリンクされる実験。最大 6 レーザー (405/445/488/515/561/640 nm) 励起に使用することができます。励起とどちらか 100 x 蛍光信号の検出/NA1.45 オイルまたは 60 x/NA1.49 オイル全反射の目的、それぞれ採用されています。放出される光はダイクロイック ミラー (561 nm ロングパスまたは 514 nm ロングパス) によって分割し、様々 な帯域通過フィルターによってフィルター処理 (55 nm 幅 525 を中心とした nm、54 nm 幅 609 を中心とした緑と赤の蛍光の nm それぞれ) 2 つの EM CCD カムの前に置かれました。時代 (年号)。Zobiakらのセットアップに関するより技術的な詳細が表示されていることに注意してください。70.5 年頃内光路から移動された SD ユニット全反射構成で s ように同じの 2 台のカメラは、検出に使用することができます、1 年頃と比較すると 2 つの画像診断装置の高速切り替えをできるように、過去に報告された s13 <。/c2 >。この機能により、デュアル チャネル同時取得、したがって 4 チャンネルは SD 全反射イメージング以前で比類のないスピード、精度を実行することができます。また、SD と TIRF 画像間の位置合わせは必要ありません。2 つのカメラ間のイメージの配置は、ただし、実験を開始する前にチェックし必要に応じて修正あります。次のプロトコル登録修正ルーチンは自己 ImageJ マクロで実装されていました。さらに、マクロに sd と、異なる次元にもかかわらず全反射データセットの同時可視化できるように設計されました。集録ソフトウェア自体は、これらの機能を提供しませんでした。

<table><tbody><tr><td>顕微鏡とアクセサリー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-TIRF顕微鏡</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti パーフェクトフォーカスシステム</td><td>ニコン</td><td></td><td>倒立顕微鏡スタンド</td></tr><tr><td>CSU-W1 T2</td><td>横河</td><td></td>電機スピ<td>ニングディスクユニット</td></tr><tr><td>iLAS2&nbsp;</td><td>ローパー・サイエンティフィック</td><td></td><td>TIRF/FRAPスキャナー</td></tr><tr><td>Evolve&nbsp;</td><td>Photometrix</td><td></td><td>EM-CCDカメラ</td></tr><tr><td>PiezoZステージ</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td>電動Zステージ</td></tr><tr><td>Bioprecision2 XYステージ</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td>電動XYステージ</td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーションチャンバー</td><td>Okolab</td><td>ボールドライン</td><td>温度、CO2および湿度供給</td></tr><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa子宮頸がん細胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3線維芽細胞DSMZ</td><td></td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccoの修飾イーグル培地+グルタMAX-I(DMEM)</td><td>ギブコ</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Reduced serum medium</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)TurboFect</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td>Transfection試薬</td></tr><tr><td>アスコルビン酸 (AA)</td><td>シグマ</td><td>A544-25G</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>35mm, 0.17mm ガラスカバースリップ</td></tr><tr><td>フィブロネクチン、ウシ血漿</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー改良チャンバー</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck ビーズ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RFP-Lifeact</td><td></td><td></td><td>Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf,</td></tr><tr><td>Germany YFP-Vinculin</td><td></td><td></td><td>Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center HamburgEppendorf, Germany</td></tr><tr><td>Software and plugins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td>Version 3</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Version 1.52c</td></tr><tr><td>Turboreg plugin</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"</td><td>この出版物</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/bzobiak/ImageJ Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>バージョン6.2.2</td></tr></tbody></table>

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

生きている細胞では、接着形成などのプロセスは、細胞膜と細胞内で広範な構造変化を伴います。ライブ サンプルの高速イメージングが可能 2 つの相補的な光学顕微鏡技術が結合されたこれらの非常に動的なイベントを視覚化するために: 高速で高解像度のボリューム録音および総内面反射の顕微鏡ディスク (SD) を回転正確な局在と細胞膜の可視化 (TIRF) 蛍光顕微鏡検査。試料作製、顕微鏡校正、画像形成および取得を通じた指導、多色・高時空間的解像度 SD 全反射イメージング ライヴ ・ シリーズの包括的かつ完全なイメージング プロトコルが表示されます。多次元のライブ イメージング データセット、すなわち登録および個々 のチャンネルの組み合わせを生成するためのすべての必要な画像後処理手順は、ImageJ のオープン ソース ソフトウェアの自己書かれたマクロで提供されます。開始時に蛍光タンパク質のイメージングおよび接着複合体の成熟だけでなく、アクチン細胞骨格ネットワークの形成は、この新たなアプローチの原則の証拠として使用されました。高解像度 3 D 顕微鏡や全反射の組み合わせがセルラ環境内および、同時に、高い検出膜準の分子の正確な局在これらの複雑なプロセスの詳細な説明を提供シグナル/バック グラウンド比。

アッセイ開発されました SD 全反射イメージングの可能性を示すために細胞-マトリックス接着複合体との相互作用、細胞骨格細胞接着過程の時空間的組織を明らかにする必要があります。したがって、付着 hela 細胞、あるいは NIH3T3 細胞は 18-24 時間、YFP ビンキュリンと RFP Lifeact を導入させたトリプシン、フィブロネクチン コート ガラス底培養皿上にシードします。これらの細胞株で選択された彼らの顕著な骨格と高い耐性のライブ イメージング実験対照的にたとえば、一次電池。それらは彼らはトリプシン処理後、非常に敏感な状態でイメージング耐えられない可能性があります。顕微鏡で YFP/RFP 発現細胞が選ばれ、接着工程時に観測された 60 分コマ撮り (図 2および映画の 1 と 2)。この特定のアッセイめったといない明確に記載されている文献17,18.また、癒着形成は、例えば...

高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ イメージング実験画像のスタック毎秒。

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

スピニングディスク TIRF 顕微鏡は、細胞骨格ネットワーク形成中のタンパク質の役割を研究するのに有用なツールです。この技術により、細胞内で起こる高速細胞アプローチの3次元イメージングが可能となり、同時に、細胞膜に配置された蛍光分子の正確な局在化が可能になった。この方法は、微生物学、細胞生物学、および細胞膜と細胞環境との相互作用を研究することが重要なすべての枝のような研究分野に洞察を提供することができます。この方法は、細胞膜内の構造を局所化することが重要であり、残りの細胞容積の高解像度を維持したいライブイメージング実験に拡張することができます。考慮しなければならない重要なことは、TIRF照明および他のイメージングパラメータを設定し、トランスフェクトされた細胞の焦点を見つけるために適切な細胞ラインの選択である。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、画像取得時のセルの処理に関する問題を避けるのに役立ちます。実験の2日前に、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに完全増殖培地の2ミリリットルの種子3,000 HELAまたはNIH 3T3細胞。翌日、トランスフェクション試薬を準備します。まず、RFPリバクトのマイクログラム1個とYFPヴィンクリン1マイクログラムを、合計200マイクロリットルの減らされた血清培地で希釈します。トランスフェクション試薬を短時間ボルテックスする。その後、混合物の4マイクロリットルを200マイクロリットルのDNAに加える。再度試薬をボルテックスし、室温でトランスフェクションミックスを15~20分間インキュベートします。インキュベーション後、トランスフェクションミックス全体を直接細胞に滴下して追加します。プレートを振って井戸を混ぜ、インキュベーターに戻します。実験当日、まず35ミリメートルガラス底皿をPBSでフィブロネクチンの1ミリリットル当たり10マイクログラムでコーティングして、ライブイメージング用のサンプルを準備します。ガラス表面に溶液を室温で30分間放置し、取り除き、皿の空気を乾燥させます。次に、直径0.1ミクロンのマルチ蛍光ビーズ溶液を蒸留水中の1ミリリットル当たり18億粒子の密度に希釈します。フィブロネクチンコーティングガラス表面に30〜60秒間溶液を加えます。その後、溶液を取り出し、皿の空気を乾燥させます。蛍光ビーズで皿のプレコーティングは、細胞を播種する前にTIRF平面を見つけたい場合、または画像登録のための2色のビーズ画像を取得したい場合、2つの理由でのみ必要です。次に、0.1モルアスコルビン酸溶液を最終濃度の0.1ミリモルで増殖培地に添加することにより、抗酸化成長培地を調製する。37°Cの水浴に入れ、培地を予熱します。次に、2ミリリットルのPBSで細胞を洗い、プレートの各ウェルに250マイクロリットルのトリプシンEDTAを加えます。37°Cで細胞をインキュベートし、細胞が完全に切り離されるまで2〜3分待ちます。細胞を1ミリリットル前から添加した抗酸化成長培地に慎重に再懸濁し、15ミリリットルの細胞培養チューブに培地の4ミリリットルを加えます。セル懸濁液をわずかに開いた蓋を5%の二酸化炭素で緩衝した摂氏37度に設定したインキュベーターに入れます。まず、顕微鏡の環境制御を開始し、安定した細胞培養条件を達成します。次に、予熱した顕微鏡のサンプルホルダーに、1ミリリットルの前温化抗酸化成長培地を含むガラス底皿を入れます。次に、撮像ソフトウェアで、顕微鏡で取得設定を行う。取得時間間隔を 30 秒、継続時間を 60 ~ 90 分に設定します。また、値を 1 に設定して、各時間のハードウェアベースのオートフォーカスの自動焦点機能をアクティブにします。カメラの露出を 200 ミリ秒、ゲイン レベルを 500 に、レーザーパワーを各チャンネルに 20% に調整します。高いゲインレベル、低露出時間、低レーザーパワーは、光毒性を低減するために推奨されます。次に、回転するディスク チャネルの Z スタックを 0.4 ミクロンの間隔で 10 ミクロンに設定し、下のオフセットをゼロに設定して、最も低い面がハードウェアオートフォーカスのフォーカス位置になり、TIRF チャネルの Z スタックを非アクティブにします。最後に、マルチポイント関数ステージポジションをアクティブにします。これにより、30秒間隔で最大3つのポジションを記録できます。ここで、蛍光光灯を持つ蛍光ビーズを見つけ、1つのTIRFチャンネルをアクティブにし、TIRF照明を示す値に照明角度を設定します。次に、顕微鏡パネルのボタンを押してオートフォーカスをアクティブにし、オフセットホイールでフォーカスを調整します。フォーカスが入ったら、TIRF 488 と TIRF 561 を使用して 2 色のデータ・セットを獲得し、後続のビード・ベースのイメージ登録を行います。培養器から細胞を取り出し、閉じたチューブを2~3回反転して細胞懸濁液を混合する。次に、細胞の1ミリリットルをイメージング皿に塗布する。低レベルの蛍光照明を持つ二重のトランスフェクトされた細胞を素早く見つけます。見つかったら、明視野照明を使用してライブカメラプレビューでセルを中央に配置し、位置をマークします。次に、目的の追加の 1 ~ 2 つのポイントを見つけ、それらを職位リストに保存し、シーケンス ボタンをクリックしてデータ取得を開始します。最初は、ステージの動きのために細胞を簡単に取り外すことができるので、4~5つのポジションを設定し、後で1つまたは2つを破棄することをお楽しめます。フィジーで登録フリーのハイパースタックを生成するために、まず、提供されたファイルSD-TIRF_helper_joveをダウンロードして保存してください。フィジーサブフォルダマクロの ijm。メニューコマンドをクリックしてマクロを実行し、プラグインからマクロを始め、最後に実行します。カラーチャンネルで登録補正が必要な場合は、オプションを選択し、ランドマークファイルと呼ばれる新しいビードベースの登録参照を作成します。次に、バイオフォーマットインポーターでデータをインポートし、表示オプションとしてハイパースタックを選択します。画像データセットをロードし、第1ステップで回転ディスクシリーズを選択し、第2ステップでTIRFシリーズを選択します。この時点で、フィジーはチャネルとステージ位置で並べ替えられたデータを表示します。所定のランドマークファイルをロードして、登録補正を各チャンネルに適用します。次に、回転するディスクと TIRF チャネルごとに目的の色参照テーブルを選択し、それらを単一の多次元ハイパースタックにマージします。TIRF イメージの処理中に、いくつかの zed プレーンが下面に追加され、この数は回転するディスク・データ・セット内の平面の番号と一致します。これは、最終的なハイパースタックの視覚的表現にとって非常に重要です。このビデオで説明した設定を用いて、YFPおよびRFP発現細胞を選択し、60分間のタイムラプスの間にそれらの接着プロセスを観察した。予想通り、細胞は丸い形をしており、最初は環境を感知し、基材に接触する膜突起で弱く付着しただけです。細胞マトリックス接触は、いわゆる新生接着の形成時に迅速に強化された。時間の経過とともに、接着複合体は拡大し、焦点付着に成熟した。これらの細長い構造は、主に細胞の周辺で明らかであった。これは、アクチン繊維の束縛と同様に細胞マトリックス接着の強化を誘発するアクトミオシン繊維によって作用された力から生じた。また、アクチンネットワーク形成の結果として細胞が平坦化した。取得速度は、次のパラメータ、時間間隔、露光時間、zed 平面の数、および位置数に依存します。したがって、高い取得率のためにこれらのパラメータを最適化することは非常に重要です。最新の回転ディスク技術の実装により、回転ディスクTIRF顕微鏡を新しい超解像度顕微鏡技術に変え、高い時間レートでイメージングを可能にします。回転ディスク顕微鏡は、細胞内部と細胞膜の間で発生するプロセスを研究するための非常に強力な技術です。我々は、数秒以内に非常に大きな画像スタックを取得することによって、小胞のダイナミックに従うことができることが示されています。コリメートレーザー光は目にとって危険です。ビームを直接見て、直接光の露出を避けるために、機器の安全上の注意を使用しないでください。

visualizing-adhesion-formation-cells-means-advanced-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

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発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

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近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。...

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

学ぶ回転ディスクTIRF顕微鏡法による細胞接着形成の可視化手法。高速3次元イメージングで細胞膜タンパク質の動態を解析し、細胞生物学研究に有用な知見を提供します。

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

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