Name: 付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学ぶポリアクリルアミドゲルアッセイによる細胞外マトリックス剛性がListeria monocytogenes感染に及ぼす影響。HMEC-1細胞を用いた定量的手法で、硬い基質上で感染率が約2倍高いことを明らかにする。

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誠に感謝フッター、r. Lamason、m. Rengaranjan、議論の実験的なサポート ・ テリオ研究室のメンバー。この作品は、高度な研究 (F.E.O.)、スタンフォード大学院フェローシップ (F.E.O.) アメリカ心臓協会 (E.E.B.) に NIH R01AI036929 (J.A.T.)、ハワード ヒューズ (J.A.T.)、ハワード ヒューズ ギリアム交わりによって支えられました。フローサイトメトリーは、スタンフォード共有 FACS 施設で行われました。

著者が明らかに何もありません。

細胞はさまざまな細胞の形態だけでなく、その遺伝子発現および蛋白質活動、重要な細胞機能および動作45,46に影響を与えることができる影響を与える物理的環境手がかりを感じることができます。セルの ECM の剛性は、細胞運動、分化、増殖、および最終的に細胞の運命47,48,49の重要な変調器としてますます感謝です。細胞とその ECM の複雑な生体力学的相互作用を理解することの多くの最近の進歩をされているが、どのように環境剛性について細菌感染に対する細胞の感受性に影響を与える少し知られています。このような調査を促進する、感染症の試金50で互換性が可変剛性のポリアクリルアミド ゲルの老舗作製に基づいてこの小説ウェル アッセイを開発しました。伝統的に、ガラスや約 1 3 桁が最も付着性細胞8,51自然 ECM より硬めは、ポリスチレンの表面上の組織培養細胞の細菌感染を研究されています。ここで説明アッセイは、関連する生理学的環境剛性政権における細菌ホスト相互作用の研究を有効にする新しい高速道路を開きます。
提示されたアッセイのコンセプトの証明の HMEC 1 細胞モデル付着性宿主細胞と Lm モデルの細菌の病原体として選ばれました。ただし、適切に変更された場合は、アッセイをさらなる研究に対して拡張できます。このような研究は、細菌やウイルスなどを含むその他の病原体によって異なる哺乳類付着性宿主細胞の種類の感染症を含むことができます。この特定のアッセイ ゲル蛋白質 - でコーティングしたコラーゲンは、ホスト細胞の種類に応じてそれはヒドロゲルへの関心の宿主細胞の付着を容易にするために異なる ECM タンパク質-コーティング、フィブロネクチン、ラミニンなどを使用すること52。 ホスト セルの種類に依存する追加の考慮事項が検討するハイドロゲル剛性範囲。剛性の範囲に決まるべきである何が特定のホスト セルの型に関連する生理学的、どれだけをホストする接続与えられた剛性ハイドロゲル.に単分子層を形成同様に、検討する必要に応じて、モデル病原体によってわずかな変更は記載感染試験に実装する必要があります。
製造ポリアクリルアミド ゲル24,50,53にある特定の特徴のための以前の方法と比較して試金の技術革新は、提案された感染症法に統合。まず、マルチもガラスの底板を同時に複数の条件のスクリーニングを可能にするだけでなく、特定の手順の自動化、ゲルが構築されます。これはしばしば変更同時にまたは複数の複製は非常に重要ですのでこのようなアプローチの結果は、ホスト細胞の通路と追加のホストに感染する細菌の正確な数などの要因によって影響される可能性が調べることで複数の条件を監視、間の独立した実験。このアッセイのユニークな特徴は、ゲルがある従来の顕微鏡を使用してのイメージを十分に薄い高さ約 40 μ m のこと。我々 は、我々 は、両方の生細胞顕微鏡検査およびセル固定および高いバック グラウンド蛍光を導入することがなくイメージング、続いて免疫染色に正常に実行できますを示した。最後に、ゲルは、蛍光マイクロ ビーズ、単一の焦点平面に閉じ込められた埋込アッパーの 1 つで、2 つの層から成っています。この属性は、アウト フォーカスの光イメージング中に干渉することがないことを保証します。ビーズの存在により、制服が、TFM と MSM の24,32,41のパフォーマンスが向上を確保するためゲルの表面地形学です。TFM と MSM、それぞれ可変剛性マトリックスに存在する細胞の細胞外マトリクスと細胞の力を計算することが可能です。この小説の試金を使用して、環境の剛性と感染症の両方の貢献を同時に比較することによって物理的な力のような測定をすることが可能です。次のようなアプローチ、効果感染は、宿主細胞そのコースを通して力学を定めることができます。また、細胞の細胞内ストレスの進化は MSM を使用して計算することができます、単層の障壁の完全性の測定として使用することができます。最後に、アッセイのウェルの性質を考えると、それはより多くの深さでホスト細胞力学と感染症との間の複雑な相互作用を調査するため、細菌感染症の薬理学的および遺伝的摂動を同時に導入することが可能。
細胞の増殖速度に及ぼす基板の剛性にある技術の固有の制限の 1 つがあります。通常、感染症法では、異なる条件下でホストの細胞密度が同じであることを確認する必要があります。単独で細胞密度があります感染ホストの感受性に影響を及ぼすためにです。宿主細胞として使用された HMEC 1 セル、ゲル上の 24 h のとき自分の番号の差が表示されません。ただし、異なる種類の細胞は差分の増殖、感染症研究をバイアスすることがでくハイドロゲル剛性によってを発生可能性があります。同様に、感染のバイアスが生じるときセル単分子膜を形成しないまたはゲル、特定の細胞のタイプは非常に柔らかい行列 (例えば、ひと臍帯血管内皮細胞やマディン-ダービー犬腎臓に播かれるときに発生するにも接続しないでください。上皮細胞は 0.6 kPa ヒドロゲル54,55でシードします。)ある特定の細菌 (例えば、ボレリア burdgorferi) に接続できる病原体に関する限りでは、宿主が彼らを侵略、それらを介しても生まれ変わることができます56。この試金は病原体の輪廻の研究、仕事だろうが、57を正常に機能する好中球 PA ヒドロゲルでシード内皮細胞細胞に関する過去の研究をされているので、それは可能と思われる場合我々 はまだ未テストします。アクリルアミドと bis アクリルアミド24,25,26 の適切な濃度を混合することによって与えられたヤングのポリアクリルアミド ゲルを製造する方法を示す調査の多くがずっとあります。 ,27。しかし、1 つの様々 な剛性のヒドロゲルに存在する細胞の TFM 実験を実行する欲望、特にとき、AFM または他のインデント技術58を通じてヒドロゲルの予想の剛性を確認する重要です。使用される各種の溶媒や高齢アクリルアミド原液、期待値からのわずかな偏差が発生する可能性や方法の原子間力顕微鏡による測定が実行される (例えば、原子間力顕微鏡の先端の形状)。最後に、ここに提示されたアプローチより現実的な生理学的関連性の高い 3 D のシナリオとは異なる 2次元行列に宿主細胞を播種に基づいています。ただし、可変剛性を有する 3 D ゲルを製造、宿主細胞とそれらをシードとし、病原体に感染するにはまだ、特定の技術的な問題が包含します。それにもかかわらず、我々 は、近い将来に我々 ことができる 3 D の設定で感染症を研究するため現在のアッセイを拡張するを予測します。
要するに、予備的な結果とともに記載されている治験はこの新規アッセイが定量的方法より多くの病原性細菌の付着菌の感染を研究するための非常に有用なツールになることを証拠を提供します。以前調べたより生理学的環境。光顕、続いて提案セットアップにおけるヒドロゲルあるアッセイ フローサイトメトリー、免疫染色などの複数の手法のパフォーマンスと互換性のあるポリアクリルアミドの加工力と牽引力顕微鏡。両方、病原体は、ホストを感染させる戦略を解くのとの開発を促進する上で重要な影響を及ぼすだろうと見込んで、病原体によって異なる付着性ホスト細胞の種類の感染症を含む研究のアッセイを使用ことができます。感染症に対する治療的介入は。

ほとんどの動物の組織内の細胞が通常付着、隣接する細胞とその細胞外マトリックス (ECM) の両方を取り付けます。細胞の ECM へのアンカレッジは細胞の運動性細胞の増殖と生存の1,2に至る多くの細胞プロセスにとって重要です。ECM に細胞の定着は、ECM の組成と剛性の両方に依存します。セルは、動的に再配置することで、細胞骨格、細胞バイオメカニクスと機能3,4,5,6 を批判的に順番変更細胞外マトリクスと細胞間の癒着、後者の変化に対応します。.時間 (すなわち、高齢化)、および病態生理学的プロセス (例えば、動脈硬化、癌、感染症、等)、(すなわち、解剖学的位置)、スペース、ECM 剛性によって異なります。例えば、それは広く受け入れられているその血管内皮細胞上に存在する硬めの柔らかい行列と比較して、ecm と互いに高められた力を及ぼし、増加の運動性と増殖7、8を展示します。同様に、剛性行列上に存在する線維芽細胞は、ECM の高い収縮力を伝えるし、増殖の亢進、運動、および ECM 生産9,10,11を表示します。様々 な細胞タイプ、付着性宿主細胞との関係を細胞力学と ECM 剛性への応答が広く調査された、ECM、および細菌感染症の剛性はありませんまだ主として知られています。
ECM 剛性細菌ホスト細胞の相互作用の役割を研究するには、菌、リステリア菌(Lm) は、モデルの病原体として選ばれました。Lm は、さまざまな哺乳類を宿主の全身感染症を引き起こす可能性がユビキタス食品由来の菌です。この通性細胞内の病原体は、血管内皮細胞の種類を調べることによって腸の粘膜上皮から遠隔臓器で移動できます。Lm は、髄膜炎を引き起こす可能性が血液脳関門を違反にする場合、それは胎盤を交差させる、自然流産12,13を生じる。Lm は別のホスト細胞型に感染し、病原性の明瞭な作戦を使用してこれを行うことができます。Lm 感染はあまり Lm に感染することができる方法について知られているが、バイパス血管内皮細胞の血管14,15,16の内腔上皮細胞においてほとんど研究されています。さらに、それはまだ主として知られている内皮細胞が存在する ECM の剛性が Lm の能力これらの宿主細胞に侵入して、広めるために調節します。Lm といくつか追加の細菌種の (すなわち、リケッチア parkeri) ホストの両方に感染した細胞、細胞質に侵入して細胞間普及17を容易にするためのアクチン細胞骨格の活用,18,19. 彼らはホスト アクチン重合経路を妨害して16,20代の前方に推進力を促進するアクチン彗星の尾を生成するそれらを可能にする蛋白質の表現を通して、それを達成します。感染症の結果として宿主細胞のアクチン細胞骨格は動的にはまだ完全に特徴付けられる、出すは、ECM と各物理的な力を含む宿主細胞のバイオメカニクスに影響を与える可能性のある方法で再配置する必要があります。その他。これらのプロセスを調べるひと血管内皮細胞 (HMEC-1) モデル宿主細胞として 3 つの理由から選ばれた: 1 内皮細胞が知られている高度機械受容変動の物理的な手がかり21; 常に公開されている。2. Lm を血管内皮細胞に感染する採用戦略がまだ未知22;3。HMEC 1 不死化細胞ラインし、したがって、こと簡単に培養ができ遺伝子操作を受けます。
主に宿主細胞の細菌感染症研究生体外でガラスや、ほとんど電池12,14,23の生理学的な ECM より大幅剛性ポリスチレン基板上に細胞を播種されて。その剛性は生理学的に関連する行列に播種された細胞の感染を調べる、病原性細菌によって細胞の伝染の ECM 剛性の役割を解明するためには、我々 従って薄く加工に基づく革新的なアプローチウェル プレートの可変剛性のビーズに埋め込まれたポリアクリルアミド ゲル。提案されたアプローチの目新しさはそれがウェル フォーマットにより同時に複数の条件を監視できると基板が組み込まれている特定の方法のための複数の技術と互換性があります。HMEC 1 細胞これらタンパク質被覆ヒドロゲルでシード, 内面に蛍光になるか恒常蛍光を発する Lm の異なる株に感染し.ホスト HMEC 1 細胞の感染感受性の ECM 剛性の役割は、フローサイトメトリーで評価しました。さらに、免疫染色と蛍光顕微鏡は、付着および内面化された細菌を区別するために使用されました。最後に、牽引力顕微鏡 (TFM) は、感染時にその行列に内皮細胞を発揮牽引応力に Lm 感染の影響を特徴付けるために成功しました。提示されたアッセイは、異なる細胞や病原体を用いた付着性のセルの伝染の感受性に及ぼす ECM 剛性に関する研究を有効にするには、さらに簡単に変更できます。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレットフィ</td><td></td><td>ッシャーS318-500</td><td></td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>シグマ</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>25%グルテラアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>40%アクリルア</td>ミド<td>シグマ</td><td>A4058-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ビスアクリルアミド溶液(2%w / v)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 &mu;m, yellow-green fluorescent (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Fisher</td><td>BP17925</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン, I 型 ラット由来</td>溶液 <td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、遊離酸</td><td>J.T. Baker</td><td>4018-04</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 medium、フェノールレッド</td><td>Thermofischer</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Medium、グルタミンなし</td><td>Life technologies</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A</td><td>Gemini Bio-Prod</td><td>900108 500ml</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>シグマ</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>シグマ</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200mM</td><td>フィッシャー</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>フィッシャー</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>MP バイオメディカル</td><td>194530</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマ</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>DifcoTM 寒天、粒状</td><td>BD</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>BBL TM Brain-heart infusion</td><td>BD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 - 水中の 10 mg/ul 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 16% EM グレード</td><td>電子顕微鏡</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>抗リステリア菌 monocytogenes 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab35132</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor&reg;546抱合型</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA-11035</td><td></td></tr><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25200056</td><td></td></tr>クロス<tr><td>トリジウム組織溶解</td>シ<td>グマ</td><td>C8051</td><td></td></tr>スト<tr><td>レプトマイシン硫酸</td>塩フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>3810-74-0</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>カルバイオケム</td><td>8510</td><td></td></tr>ド<tr><td>デシル硫酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>28364</td><td></td></tr><tr><td>MES 粉末</td><td>シグマ</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. ベイカー</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>J.T. ベイカー</td><td>2444-1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>アクロス</td><td>40991</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ディスポーザブル ラボ機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm 円形ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-545-81</td><td>No. 1.5 カバースリップ | ガラス径 10mm |コーティングされていない</td></tr><tr><td>ガラス底24ウェルプレート</td><td>Mattek</td><td>P24G-1.5-13-F</td><td></td></tr><tr><td>5 mlポリスチレンチューブ、35 &mu;mセルストレーナーキャップ&nbsp;</td><td>ファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>T-25フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353118</td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15mlコニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て血清ピペット(1 ml、2 ml、5 ml、10 ml、25 ml)</td><td>ファルコン</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>パスツールガラスピペットVWR</td><td></td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ(1-200 &mu;L, 101-1000 &MU;l)</td><td>デンビル</td><td>P1122、P1126</td><td></td></tr><tr><td>パウダーフリー検査用手袋</td><td>Microflex</td><td>XC-310</td><td></td></tr>キュ<tr><td>ベットバクテリア</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr>カ<tr><td>ミソリ</td><td>VWR55411-050</td><td></td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジニードル</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>0.2um滅菌ボトル</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>20mlシリンジ</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>0.2um フィルター</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>木の棒</td><td>グレインジャー</td><td>42181501</td><td></td></tr><tr><td>サランラップ</td><td>サンタクルスバイオテクノロジーズ</td><td>sc-3687</td><td></td></tr><tr><td>プレート バクテリア</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td> 大型/非使い捨ての実験装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養フード</td><td>Baker</td><td>SG504</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>IGS180</td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td>NuAire</td><td>NU-8700</td><td></td></tr><tr><td>倒立型 Nikon Diaphot 200 落射蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>NIKON-DIAPHOT-200</td><td></td></tr><tr><td>ケージインキュベーター</td><td>Haison</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Scanford FACScan アナライザー&nbsp;</td><td>スタンフォード大学とCytekは、FACScan</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>ピペッター(10 &mu;l、200 &mu;l、1000ul)</td><td>ギルソン</td><td>F144802、F123601、F123602</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラートレド</td><td>30019028</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>1 Lフラスコ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB5011000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブマシン</td><td>アムスコ</td><td>3021</td><td></td></tr><tr><td>攪拌マグネットプレート</td><td>ベルコ</td><td>7760-06000</td><td></td></tr><tr><td>マグネット攪拌バー</td><td>ベルコ</td><td>1975-00100</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン</td><td>DU 640</td><td></td></tr><tr><td>スキャンフォード FACScan アナライザー</td><td>Cytek Biosciences</td><td>カスタム スタンフォードとサイテックは FACScan</td><td></td> をアップグレードし</tr>ました<tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ソフトウェア (&mu;Manager)</td><td>Open Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動画像解析ソフトウェア、CellC</td><td>https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td><td></td> <td>ソフトウェアは無料で入手できます。実行可能ファイルとMATLABソースコードは、https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ で入手できます</td></tr></tbody></table>

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

細胞外マトリックスの剛性には、一般的な携帯電話の動作、機能、および運命に影響を与える知られている複数の環境機械刺激の一つが装備されています。ますます付着性のセル型のレスポンス剛性行列を特徴とすると、付着細菌感染に対する細胞の感受性によって決まるマトリックス剛性なんてとして主に知られているが細菌感染の影響で、宿主細胞のバイオメカニクス。我々 は細菌感染に対する宿主の血管内皮細胞の感受性によって異なりますこれらの細胞が存在するマトリックスの剛性とのバイオメカニクスが変更されるホストの感染が細菌細胞、仮説します。これら二つの仮説をテストするため、内皮細胞はモデルの病原体としてモデル ホストとリステリア菌として使用されました。小説ウェル フォーマット アッセイを開発することによってを示す菌、リステリア菌による内皮細胞の感染に及ぼす剛性マトリックスがフローサイトメトリー ・免疫染色顕微鏡続いてによって定量的に評価できます。さらに、ホスト内皮細胞バイオメカニクスの菌、リステリア菌感染の影響は牽引力顕微鏡を使用して、検討することができます。提案手法は、組織に関連する力学の付着性細胞の細胞、彼らの細胞外マトリックスの生体力学的相互作用の理解に向けての重要なステップである細菌の感染に及ぼす影響の解析と病原性細菌。このメソッドはさまざまな細胞のバイオメカニクスと基板剛性への応答に関する研究の他のタイプに適用されますも各実験では並行して多くの複製を実行することができる必要があります。

Lm 感染細胞 HMEC の ECM 剛性に依存の感受性: さまざまな剛性の PA ヒドロゲル、すべては表面をコーティングしたコラーゲン私、プロトコルの手順 1で説明したようにマルチよくガラス底板に造られた (図 1参照)。26,27を前述のように、ゲルの正確な剛性を確認する AFM 測定を行った (図 2参照)。過去の研究は、内皮細胞の基底膜のローカル コンプライアンス 1 kPa (例えば、脳組織) から 70 kPa (例えば大動脈)36,37,38,の範囲が示されています。39,40。 したがって、次剛性行列上に存在する HMEC 1 細胞の感染をテストしました: 70 kPa 20 kPa、3 kPa 0.6 kPa。各ハイドロゲル剛性の結果の再現性を評価するために六つのゲルを作製しました。
フローサイトメトリーは、Lm 感染 HMEC 1 細胞の ECM 剛性に依存した感受性を評価するために使用された (図 3参照)。HMEC 1 細胞は細胞内細菌のみ (参照図 1 L - 1N) の検出を許可する内面化 (actAp::mTagRFP) 後、蛍光マーカーを表す Lm ひずみ (JAT985) に感染していた。JAT985 はまた、ActA、ActA はアクチン彗星の尾およびそれに続く細菌の散布の形成に必要な細胞から細胞に広がってから細菌を無効にすることを欠いています。7-8 h 後 HMEC 1 細胞の感染は、フローサイトメトリーを使用して査定されました。単一細胞を分析するように、細胞数の分布の大部分は、対側の散布、フォワードを使用ゲートだったし、蛍光を示す細胞を除外する 2 番目のゲーティング ステップを行った、(図 3 a - 3 Cを参照してください。).図3 予備的な結果を示すその Lm HMEC 1 感染が約 2 倍 HMEC 1 セル ソフト 0.6 kPa ゲル上のセルと比較すると硬い 70 kPa ゲル上の大きい (図 3B - を参照してください。3D). ソフト行列と比べて硬い上に存在する HMEC 1 セルの Lm 感染感受性の増加に起因することができる: 1; HMEC 1 に Lm 付着力が強く。2. 増加 Lm 侵入 HMEC-1;または 3。上記の共起するの両方。HMEC 1 細胞が仮説を保持をテストするソフト (3 kPa) と硬い (70 kPa) ヒドロゲル シード, Lm を表現する GFP 恒常に感染して (図 4 a - 4 C参照)。サンプルは、感染直後に修正され、外部 (付着) 細菌は抗体で染色しました。定量的な顕微鏡を使用して、宿主細胞に存在する柔らかいゲル ( 4 図D参照) と比較して硬い場合 HMEC 1 へ付着したかなり多くの細菌があることがわかった。流れの cytometry のデータと一致して、大幅により多くの細菌は宿主細胞に存在する柔らかいゲル (図 4E参照) と比較して硬い場合 HMEC 1 によって内面化します。しかし、HMEC 1 セルに Lm の侵入効率 (細菌の内面/総細菌数) は同様に、基板の剛性に関係なく (図 4F参照)。
Lm 感染 HMEC 1 細胞の牽引力顕微鏡: Lm HMEC 1 細胞の感染は、添付ファイルの ECM にまたは互いにそのバリアの整合性に影響を与えず強度を含む、感染した宿主細胞のバイオメカニクスを変えることができます。我々 は細胞 ECM 牽引力と単分子膜応力顕微鏡41細胞内張力力を計算する計算する牽引力顕微鏡32を使用してケースをできるかどうかを評価しようと思う。図 5は、変形フィールド、牽引応力場と異なる時間ポイント感染後に 20 kPa ヒドロゲル上 HMEC 1 細胞の細胞内張力場のマップを示しています。図 5 a - 5 Dは、図 5E中感染制御 HMEC 1 セルを参照 - 5 H 300 細菌/セルと同じ感染症の多様性で Lm HMEC 1 細胞を参照してください。この準備作業は、感染制御の細胞のない観察されるに対し感染 HMEC 1 細胞が lm、感染の過程で細胞外マトリクスと細胞内ストレスの大きさを減らすことを示唆します。
ECM 依存剛性 Lm 普及 HMEC 1 分子の間で: 微速度顕微鏡観察の効果を調べるために, HMEC 1 分子による Lm の剛性行列が。Lm は、単分子膜に広がる、細菌は時間 (参照してください図 6Aとビデオ図 1および2) の関数として成長感染のフォーカスを作成します。感染症フォーカス部を凸、細菌42周りのポイントのセットを含む最小の凸ポリゴンを描画することによって測定しました。菌、リステリア菌宿主細胞の単層細胞-細胞拡散の効率を測定する分野では標準的な指標はありません。拡散効率を評価するためにいくつかの感染症フォーカス41の場合は、宿主細胞の数をカウントしているし、感染ホスト細胞43のグループの周りに手動で描画境界を持って他の人。菌、リステリア菌の拡散の効率を測定するための自動化された、一貫性、および計算安価なプロセスだから、細菌の周り凸多角形を描画しました。これにより我々 は 70 kPa ヒドロゲル シード 3 kPa 行列 (図 6Bとビデオの数字 1と2を参照) のそれらと比較されたときにシード HMEC 1 セルで感染症フォーカス領域のわずかな減少を見つけた。感染症フォーカスの成長速度を決定するには、半径の距離は感染症フォーカスの面積の平方根 pi によってこれを割ることによって時間の関数としてプロットしました。この数学的な変換では、感染症フォーカスの形状はほぼ円形44と仮定します。フォーカス成長の速度を測定するには、両方 3-70 kPa 行列の半径方向の距離の変化 (すなわち斜面) の速度を測定しました。このアプローチが明らかに感染症フォーカスが HMEC 1 セル 3 kPa 行列上でより速く、単調増加しました。ただし、フォーカスでは、大幅に遅くなります (最初の 200 分) とわずかに遅い (200 に 600 分) を (参照してください図 6C) 70 kPa 行列に播種された細胞に成長しました。確かに、さらにデータの分析を確認、感染症フォーカス伸び率は、平均では、2 倍 70 kPa 行列で特に最初の 200 分間 (図 6Dを参照してください)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> 図 3: Lm 侵略 HMEC 1 細胞の ECM 剛性に依存した感受性をフローサイトメトリーを用いて測定. HMEC 1 セルが Lm (JAT985) で感染し、感染したフローサイトメトリーで分析しました。A. このパネルは単一の井戸から来る代表 HMEC 1 細胞の前方散乱プロット対側を示しています。(左) 破片を除外し細胞ダブレット、トリプレット (右) のゲートを介して細胞の一括配布が選ばれました。B. HMEC 1 ソフト 0.6 kPa にメッキのため、このグラフはセルあたり Lm の蛍光強度の対数のヒストグラムを示しています。Cします。 このグラフは、HMEC 1 硬い 70 kPa ゲル上メッキのセルごとの Lm の蛍光強度の対数ヒストグラムを示しています。N のヒストグラム = 4-6 レプリケートが異なる色で表示されます。感染制御の細胞のヒストグラムは紫です。何が感染しているを定義するために使用するゲートは、赤で表示されます。覚書は 100、感染症は感染後評価 8 h。D. データを示すハイドロゲル剛性対感染 HMEC 1 細胞の割合 (N = 5)。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。<a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> ビデオ図 1: HMEC 1 細胞膜 (フェーズ) を介して細胞内 Lm (赤のチャネル) の普及はシード 3 kPa 基板上<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank"></a><img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank"></a><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank"></a>

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイを開発しました。この試金は牽引力顕微鏡、細胞、細胞外マトリックスおよび病原性細菌の生体力学的相互作用の定量的測定を可能にする、免疫染色、フローサイトメトリーと互換性が。

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

この方法論の全体的な目標は、接着細胞の細菌感染に対する細胞外マトリックス硬さの影響を高度に定量的な方法で特徴付けできるようにすることです。この方法は、宿主細胞の細菌感染感受性を調節する機械的な力の役割は何かなど、宿主病原体のバイオメカニクスという新たな分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法は、高解像度のタイムラプスビデオシーケンスを作成すると同時に、複数の条件をスクリーニングし、特定の手順を自動化するのに役立ちます。24ウェル皿のガラス活性化を行うには、直径13ミリメートルの井戸あたり500マイクロリットルのツマロ水酸化ナトリウムを加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。水酸化ナトリウムを捨て、超純水を使用して井戸を一度すすぎます。次に、500マイクロリットルの2%エタノール中95%トリエトキシシランを各ウェルに加え、5分間インキュベートします。水で、井戸を一度すすいでください。次に、500マイクロリットルの0.5%グルタルアルデヒドを各ウェルに加え、プレートを30分間インキュベートします。水で一度すすいだ後、蓋を外した状態でプレートを摂氏60度で乾かします。調整可能な剛性のハイドロゲルを製造するには、ヒドロゲルの所望の剛性に応じて、40%ストックアクリルアミド溶液の3〜10%と2%ビスアクリルアミド溶液の06〜6%を含む水溶液を準備します。この後、水を加えます。各剛性について、Solution Oneはビーズフリーですが、Solution Twoには03%0.1マイクロメートルの蛍光マイクロビーズが含まれています。溶液1と2を真空で15分間脱気し、重合を阻害する酸素を排除します。次に、迅速に行動しながら、0.43%TEMEDと10グラム/ミリリットルのストックAPS溶液の0.6%をソリューション1に追加します。24ウェル皿の各ウェルの中央に3.6マイクロリットルの溶液を追加します。すぐに12mmの円形カバースリップを使用してウェルを覆い、溶液を20分間放置して完全に重合させます。シリンジの針を硬い表面に軽くたたいて、先端に小さなフックを作り、カバースリップの取り外しを容易にします。次に、針を使用してカバースリップを持ち上げます。次に、0.43%TEMEDと10グラム/ミリリットルのストックAPS溶液の0.6%をソリューション2に追加します。次に、12mmの円形カバースリップの上に2.4マイクロリットルの混合物を堆積させます。溶液2を滴下した円形のカバースリップを最初のポリアクリルアミド層の上に置き、鉗子を使用して下向きに静かに押して、2番目の層の厚さが最小になるようにします。次に、溶液2を20分間重合させます。各ウェルに500マイクロリットルの50ミリモルHEPES pH 7.5を加え、シリンジ針と鉗子を使用してガラスカバースリップを取り外します。ハイドロゲルを滅菌するには、組織培養フードに置き、1時間UVにさらします。次に、Sulfo-SANPAHと1%DMSOおよび50ミリモルHEPES pH 7.5の0.5重量/体積の混合物を準備します。200マイクロリットルの溶液をヒドロゲルの上面に加えます。その後、迅速に作業し、302ナノメートルのUVを10分間さらして活性化します。50ミリモルHEPES pH 7.5の1ミリリットルを使用してハイドロゲルを2回洗浄し、必要に応じて繰り返して余分な架橋剤を除去します。ハイドロゲルを200マイクロリットルの0.25ミリグラム/ミリリットルのラットテールコラーゲンIと50ミリモルのHEPESでタンパク質コーティングします。ハイドロゲルをコラーゲンと室温で一晩インキュベートします。目的の細胞をハイドロゲルに播種する前に、1ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で1時間平衡化します。ヒト微小血管内皮細胞を播種するには、テキストプロトコルに従って細胞懸濁液を培養および調製した後、ハイドロゲルから培地を取り出し、各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。テキストプロトコルに従ってL.monocytogenesの一晩培養物を調製した後、培養物の1ミリリットルを微量遠心チューブに移し、室温で2, 000倍gで4分間スピンダウンします。組織培養グレードのPBSを使用してペレットを2回洗浄した後、1ミリリットルのPBSを使用してペレットを再懸濁します。10 または 50 マイクロリットルの細菌懸濁液と 1 ミリリットルの MCDB 131 フル培地を組み合わせて、宿主細胞あたり約 50 個の細菌または宿主細胞あたり 10 個の細菌の感染の多様性 (MOI) を得るために、感染ミックスを調製します。24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、ハイドロゲルや細胞を破壊しないように注意します。1ミリリットルのMCDB 131フル培地を使用して細胞を1回洗浄し、その後、各ウェルに1ミリリットルの細菌を加えます。皿に蓋をして、漏れないようにポリエチレン製の食品ラップで包みます。プレートを2, 000倍gで10分間遠心分離して浸潤を同期させ、次に37°Cで培養物を30分間インキュベートします。MCDB 131フル培地で、サンプルを4回洗浄し、組織培養インキュベーターに戻します。さらに30分後、培地を1ミリリットルあたり20マイクログラムのゲンタマイシンを補充したMCDB 131フル培地と交換します。.感染後8時間でフローサイトメトリーを行うには、24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、組織培養PBSを使用してウェルを1回洗浄します。PBSの除去に続いて、各ウェルに200マイクロリットルのトリプシンEDTAコラゲナーゼミックスを追加します。皿を組織培養インキュベーターに10分間置き、細胞が完全に剥離できるようにします。各ウェルを8回静かにピペッティングした後、200マイクロリットルのフルメディウムを加えてトリプシンを中和します。各ウェルから400マイクロリットルの細胞溶液を、35マイクロメートルのセルストレーナーキャップ付きの5ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。フローサイトメトリーでサンプルを解析します。Paハイドロゲル上にHMEC-1細胞を播種し、テキストプロトコールに従ってゲンタマイシンで処理した後、プレートを5時間インキュベートして、ActAプロモーターがオンになり、mTagRFPオープンリーディングフレームの発現を促進します。感染後4時間後、1ミリリットルあたり1ミリグラムのヘキスト染料1マイクロリットルと1ミリリットルのL-15フル培地を混合し、各ウェルに加えて核を染色します。細胞を10分間インキュベートした後、培地を1ミリリットルのL-15フル培地に20マイクログラム/ミリリットルのゲンタマイシンを補充して交換します。オートフォーカス機能を使用して5分ごとに複数の位置を画像化し、LM細菌がさまざまな剛性のハイドロゲルに播種されたHMEC-1単層を介してどのように広がるかを監視します。このグラフで報告されているように、このビデオのプロトコルを使用して調製されたPaハイドロゲルの正確な剛性を確認するために、AFM測定が行われました。ここでは、異なる硬さのマトリックス上のHMEC-1細胞に、細胞内細菌の検出のみを可能にする内在化後の蛍光マーカーを発現するLM株に感染させました。細胞は前方対側散乱プロットを使用してゲーティングされ、第2のゲーティングステップでは自家蛍光を示す細胞が除外されました。フローサイトメトリー解析の結果、LM感染は、硬い70 kropelのハイドロゲルでは0.6 kropelの約2倍であることが明らかになりました。HMEC-1へのLM接着の増加、HMEC-1へのLM浸潤の増加、またはその両方が、GFPを構成するLMに感染した直後の感染感受性の増加の原因であるかどうかを検証するために、HMEC-1細胞を固定し、付着した細菌を抗体で染色しました。ここに示すように、宿主細胞が硬いゲルに常駐している場合、軟質ゲルと比較して、HMEC-1に付着する細菌が有意に多かった。フローサイトメトリーのデータと一致するように、HMEC-1によって取り込まれる細菌は、ソフトゲルと比較して、宿主細胞が硬い上に存在する場合で有意に多くなります。一度習得すると、このアッセイは約3日で完了しますが、その間に長いインキュベーションステップが必要です。この手順を試行する際は、ハイドロゲルと宿主細胞が汚染されていないことを確認するために、できるだけ無菌であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、原子間力顕微鏡などの他の方法も組み込んで、感染時に宿主細胞の剛性がどのように変化するか、この影響がマトリックスの剛性に依存するかどうかなどの質問に答えることができます。その開発後、この技術は、メカノバイオロジーの分野の研究者が、上皮細胞などのさまざまな宿主細胞とリケッチア・パーケリなどのさまざまな細菌性病原体を使用して、宿主細胞病原体の生体力学的相互作用の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、マルチウェルプレート上で調整可能な剛性のハイドロゲルを製造する方法と、感染アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。病原菌を扱うことは危険な場合があることを忘れないでください。したがって、この手順を実行する際には、侵入部位と病原体との間にバリアを挿入したり、エアロゾルの発生を防ぐなどの予防策を常に講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

細胞機能上の基層の剛性の影響をモデル化することができます...

アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

このビデオは、接着細胞の細菌感染に対する細胞外マトリックス(ECM)硬化の影響を研究するためのアッセイを示しています。さまざまな硬さのポリアクリルアミドハイドロゲルをコラーゲンで重ね合わせたマルチウェルプレートに重ね合わせることで、生理的ECMの硬さを模倣します。ヒト内皮細胞をハイドロゲル上に重ね合わせ、細胞内で蛍光タンパク質を発現するように設計されたリステリア菌を細胞に感染させると、フローサイトメトリーを使用して、硬いハイドロゲル上に存在する細胞内の内在する細菌と柔らかいハイドロゲル上に存在する細菌を比較します。...

細胞外マトリックスの硬直が細菌感染に及ぼす影響を研究するためのアッセイ

このビデオでは、内皮細胞を介した細胞外マトリックスの硬さ依存性リステリア菌の播種を評価するための定量的なタイムラプス顕微鏡法を紹介しています。より柔らかいヒドロゲルは、硬いヒドロゲルと比較して、内皮細胞を介した細菌の拡散を容易にし、マトリックスの硬さが細菌の播種に及ぼす影響を強調しています。...

細胞外マトリックスの硬さ依存性細菌播種を評価するための定量的タイムラプス顕微鏡法

腫瘍微小環境中の機械的剛性が浸潤突起の活性を増加し、収縮性アクトミオシンによって悪性の挙動を駆動する重要な役割を果たしている。アクリルアミドゲル（PAAS）を使用して、浸潤突起と牽引力アッセイは、マトリックスの剛性に応じて、癌細胞の浸潤性および収縮特性を研究するために利用することができる。...

癌細胞に対する浸潤突起と牽引力のアッセイのために、ポリアクリルアミドゲル

ここでは、マルチウェルプレートフォーマットのポリアクリルアミドゲルの迅速、効率的、安価な調製を可能にする方法について説明しています。この方法は特別な機器を必要とせず、どの研究室でも簡単に採用できます。これは、剛性依存性の細胞応答の理解に焦点を当てた研究に特に役立ちます。...

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。...

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

我々は競争によって媒介される細菌を監視するための定性分析を記述...

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

この方法は、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株による感染の後、宿主細胞転写の変化を測定するためにクリックケミストリーの使用を記載している。結果は、蛍光顕微鏡を介して、定性的に可視化またはフローサイトメトリーを介して定量的に得ることができる。この方法は、他のウイルスとの使用に適合可能である。...

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

インビトロでの付着アッセイは、細胞単層上皮するような肺炎球菌のコロニー形成を阻害するためのプロバイオティクスの使用のような潜在的な介入を調査するために、肺炎連鎖球菌の付着を研究するために使用することができる。...

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。...

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

学ぶポリアクリルアミドゲルアッセイによる細胞外マトリックス剛性がListeria monocytogenes感染に及ぼす影響。HMEC-1細胞を用いた定量的手法で、硬い基質上で感染率が約2倍高いことを明らかにする。

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェルフォーマットポリアクリルアミドを用いたアッセイ

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付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

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