付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

この方法論の全体的な目標は、接着細胞の細菌感染に対する細胞外マトリックス硬さの影響を高度に定量的な方法で特徴付けできるようにすることです。この方法は、宿主細胞の細菌感染感受性を調節する機械的な力の役割は何かなど、宿主病原体のバイオメカニクスという新たな分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法は、高解像度のタイムラプスビデオシーケンスを作成すると同時に、複数の条件をスクリーニングし、特定の手順を自動化するのに役立ちます。

24ウェル皿のガラス活性化を行うには、直径13ミリメートルの井戸あたり500マイクロリットルのツマロ水酸化ナトリウムを加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。水酸化ナトリウムを捨て、超純水を使用して井戸を一度すすぎます。次に、500マイクロリットルの2%エタノール中95%トリエトキシシランを各ウェルに加え、5分間インキュベートします。

水で、井戸を一度すすいでください。次に、500マイクロリットルの0.5%グルタルアルデヒドを各ウェルに加え、プレートを30分間インキュベートします。水で一度すすいだ後、蓋を外した状態でプレートを摂氏60度で乾かします。

調整可能な剛性のハイドロゲルを製造するには、ヒドロゲルの所望の剛性に応じて、40%ストックアクリルアミド溶液の3〜10%と2%ビスアクリルアミド溶液の06〜6%を含む水溶液を準備します。この後、水を加えます。各剛性について、Solution Oneはビーズフリーですが、Solution Twoには03%0.1マイクロメートルの蛍光マイクロビーズが含まれています。

溶液1と2を真空で15分間脱気し、重合を阻害する酸素を排除します。次に、迅速に行動しながら、0.43%TEMEDと10グラム/ミリリットルのストックAPS溶液の0.6%をソリューション1に追加します。24ウェル皿の各ウェルの中央に3.6マイクロリットルの溶液を追加します。

すぐに12mmの円形カバースリップを使用してウェルを覆い、溶液を20分間放置して完全に重合させます。シリンジの針を硬い表面に軽くたたいて、先端に小さなフックを作り、カバースリップの取り外しを容易にします。次に、針を使用してカバースリップを持ち上げます。次に、0.43%TEMEDと10グラム/ミリリットルのストックAPS溶液の0.6%をソリューション2に追加します。

次に、12mmの円形カバースリップの上に2.4マイクロリットルの混合物を堆積させます。溶液2を滴下した円形のカバースリップを最初のポリアクリルアミド層の上に置き、鉗子を使用して下向きに静かに押して、2番目の層の厚さが最小になるようにします。次に、溶液2を20分間重合させます。

各ウェルに500マイクロリットルの50ミリモルHEPES pH 7.5を加え、シリンジ針と鉗子を使用してガラスカバースリップを取り外します。ハイドロゲルを滅菌するには、組織培養フードに置き、1時間UVにさらします。次に、Sulfo-SANPAHと1%DMSOおよび50ミリモルHEPES pH 7.5の0.5重量/体積の混合物を準備します。

200マイクロリットルの溶液をヒドロゲルの上面に加えます。その後、迅速に作業し、302ナノメートルのUVを10分間さらして活性化します。50ミリモルHEPES pH 7.5の1ミリリットルを使用してハイドロゲルを2回洗浄し、必要に応じて繰り返して余分な架橋剤を除去します。

ハイドロゲルを200マイクロリットルの0.25ミリグラム/ミリリットルのラットテールコラーゲンIと50ミリモルのHEPESでタンパク質コーティングします。ハイドロゲルをコラーゲンと室温で一晩インキュベートします。目的の細胞をハイドロゲルに播種する前に、1ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で1時間平衡化します。

ヒト微小血管内皮細胞を播種するには、テキストプロトコルに従って細胞懸濁液を培養および調製した後、ハイドロゲルから培地を取り出し、各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。テキストプロトコルに従ってL.monocytogenesの一晩培養物を調製した後、培養物の1ミリリットルを微量遠心チューブに移し、室温で2, 000倍gで4分間スピンダウンします。組織培養グレードのPBSを使用してペレットを2回洗浄した後、1ミリリットルのPBSを使用してペレットを再懸濁します。

10 または 50 マイクロリットルの細菌懸濁液と 1 ミリリットルの MCDB 131 フル培地を組み合わせて、宿主細胞あたり約 50 個の細菌または宿主細胞あたり 10 個の細菌の感染の多様性 (MOI) を得るために、感染ミックスを調製します。24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、ハイドロゲルや細胞を破壊しないように注意します。1ミリリットルのMCDB 131フル培地を使用して細胞を1回洗浄し、その後、各ウェルに1ミリリットルの細菌を加えます。

皿に蓋をして、漏れないようにポリエチレン製の食品ラップで包みます。プレートを2, 000倍gで10分間遠心分離して浸潤を同期させ、次に37°Cで培養物を30分間インキュベートします。MCDB 131フル培地で、サンプルを4回洗浄し、組織培養インキュベーターに戻します。

さらに30分後、培地を1ミリリットルあたり20マイクログラムのゲンタマイシンを補充したMCDB 131フル培地と交換します。.感染後8時間でフローサイトメトリーを行うには、24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、組織培養PBSを使用してウェルを1回洗浄します。PBSの除去に続いて、各ウェルに200マイクロリットルのトリプシンEDTAコラゲナーゼミックスを追加します。

皿を組織培養インキュベーターに10分間置き、細胞が完全に剥離できるようにします。各ウェルを8回静かにピペッティングした後、200マイクロリットルのフルメディウムを加えてトリプシンを中和します。各ウェルから400マイクロリットルの細胞溶液を、35マイクロメートルのセルストレーナーキャップ付きの5ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。

フローサイトメトリーでサンプルを解析します。Paハイドロゲル上にHMEC-1細胞を播種し、テキストプロトコールに従ってゲンタマイシンで処理した後、プレートを5時間インキュベートして、ActAプロモーターがオンになり、mTagRFPオープンリーディングフレームの発現を促進します。感染後4時間後、1ミリリットルあたり1ミリグラムのヘキスト染料1マイクロリットルと1ミリリットルのL-15フル培地を混合し、各ウェルに加えて核を染色します。

細胞を10分間インキュベートした後、培地を1ミリリットルのL-15フル培地に20マイクログラム/ミリリットルのゲンタマイシンを補充して交換します。オートフォーカス機能を使用して5分ごとに複数の位置を画像化し、LM細菌がさまざまな剛性のハイドロゲルに播種されたHMEC-1単層を介してどのように広がるかを監視します。このグラフで報告されているように、このビデオのプロトコルを使用して調製されたPaハイドロゲルの正確な剛性を確認するために、AFM測定が行われました。

ここでは、異なる硬さのマトリックス上のHMEC-1細胞に、細胞内細菌の検出のみを可能にする内在化後の蛍光マーカーを発現するLM株に感染させました。細胞は前方対側散乱プロットを使用してゲーティングされ、第2のゲーティングステップでは自家蛍光を示す細胞が除外されました。フローサイトメトリー解析の結果、LM感染は、硬い70 kropelのハイドロゲルでは0.6 kropelの約2倍であることが明らかになりました。

HMEC-1へのLM接着の増加、HMEC-1へのLM浸潤の増加、またはその両方が、GFPを構成するLMに感染した直後の感染感受性の増加の原因であるかどうかを検証するために、HMEC-1細胞を固定し、付着した細菌を抗体で染色しました。ここに示すように、宿主細胞が硬いゲルに常駐している場合、軟質ゲルと比較して、HMEC-1に付着する細菌が有意に多かった。フローサイトメトリーのデータと一致するように、HMEC-1によって取り込まれる細菌は、ソフトゲルと比較して、宿主細胞が硬い上に存在する場合で有意に多くなります。

一度習得すると、このアッセイは約3日で完了しますが、その間に長いインキュベーションステップが必要です。この手順を試行する際は、ハイドロゲルと宿主細胞が汚染されていないことを確認するために、できるだけ無菌であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、原子間力顕微鏡などの他の方法も組み込んで、感染時に宿主細胞の剛性がどのように変化するか、この影響がマトリックスの剛性に依存するかどうかなどの質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、メカノバイオロジーの分野の研究者が、上皮細胞などのさまざまな宿主細胞とリケッチア・パーケリなどのさまざまな細菌性病原体を使用して、宿主細胞病原体の生体力学的相互作用の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、マルチウェルプレート上で調整可能な剛性のハイドロゲルを製造する方法と、感染アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。病原菌を扱うことは危険な場合があることを忘れないでください。

したがって、この手順を実行する際には、侵入部位と病原体との間にバリアを挿入したり、エアロゾルの発生を防ぐなどの予防策を常に講じる必要があります。