Name: 一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学ぶ PALM超解像顕微鏡法を用いたヒトiPSC由来心筋細胞のαアクチニン構造解析。従来の共焦点顕微鏡では検出できないサルコメア組織の微細な変化を定量的に評価し、心筋細胞の成熟状態を正確に評価する方法です。

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この研究は、EU構造基金(ESF/14-BM-A55-0024/18)によって支援されました。さらに、H.L.はロストック大学医療センター(889001および889003)のFORUNプログラムとヨーゼフとケーテ・クリンツ財団(T319/29737/2017)によってサポートされています。C.I.L.は、ロストック大学医療センターの臨床医科学者プログラムによってサポートされています。R.DはDFG(DA1296/6-1)、DAMP財団、ドイツ心臓財団(F/01/12)、BMBF(VIP+ 00240)によってサポートされています。
マドレーヌ・バルチュは、iPSC細胞培養と心臓分化における彼女の技術サポートに感謝します。

新生児マウスと成体マウスを含むこのプロトコルのすべてのステップは、ロストック大学医療センターの動物ケアのための倫理ガイドラインに従って行われました。
1. iPSC由来心筋細胞の培養と解離
<ol><li>前述の2D単層法を使用して hiPSC-CM を 25 日間区別します。</li>
	<li>前温解離媒体を37°Cにし、培地を室温まで支持する。</li>
	<li>PBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>細胞に温め込み解離培地を加え、37°Cおよび5%CO2で12分間インキュベート2する。</li>
	<li>セルにサポート メディアを追加します。 注: 追加するサポート メディアのボリュームは、手順 1.4 で使用される解離媒体の 2 倍のボリュームである必要があります。</li>
	<li>5 mL血清ピペットを使用して細胞を取り出す。</li>
	<li>遠心分離細胞は 200xg で5分間、3mLのhiPSC-CM培地培地17でペレットを再懸濁した。</li>
	<li>75,000細胞/ウェルの細胞密度で8ウェルガラス底チャンバーの種子細胞と3日間培養。</li>
</ol>2. 成人心筋細胞の分離
<ol><li>NMRIマウスからの成体心筋細胞の単離および培養は、以前に報告された18のように行った。</li>
	<li>8ウェルガラスチャンバースライドおよび培養1日で細胞をシードする。</li>
</ol>3. 新生児心筋細胞の分離と培養
<ol><li>新生児心筋細胞の分離手順は、NMRIマウスから得られ、前述の19のように行った。</li>
	<li>8ウェルガラスチャンバースライド内の種子分離細胞は、75,000細胞/ウェルの細胞密度でスライドし、新生児CM培養培地19で3日間培養する。</li>
</ol>4. αアクチンネットワークの蛍光標識
注:最適な結果を得るには、細胞は8ウェルガラス底チャンバで培養されます。ラベル付けは、イメージングの1日前に実行する必要があります。
<ol><li>37°Cでプリウォーム4%PFA。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒドを培養培地に直接添加してiPSC-CMを固定し(1:1希釈)、37°Cで15分間インキュベートします。固定のためのPFAの最終濃度は2%である。</li>
	<li>固定細胞を0.2%トリトン-Xにインキュベートし、PBSで希釈し、室温で5分間培養します。</li>
	<li>細胞をPBSで2回、それぞれ5分洗います。</li>
	<li>1%BSA溶液(PBSで希釈)を加え、室温で60分間インキュベートします。</li>
	<li>1%BSAで1:100 αアクチン抗体を希釈し、0.05%Triton-Xを含有して150μLの一次抗体溶液を調製する。細胞に加え、室温で60分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を0.2%BSA溶液で2回洗浄し、それぞれ5分ずつ洗浄します。</li>
	<li>ヤギ抗マウスAlexa647抗体を1%BSAで1:100、0.05%Triton-Xを含む2次抗体溶液150 μLを調製します。細胞に加え、室温で40分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を0.2%BSA溶液で2回洗浄し、それぞれ5分ずつ洗浄します。</li>
	<li>細胞をPBSで2回、それぞれ5分洗います。PALMイメージングまで、標識された細胞を4°Cで暗闇の中に保管してください。</li>
</ol>5. PALMイメージングバッファの調製
注: 各実験に対して、PALM イメージング バッファを新たに準備することが重要です。
<ol><li>50gのグルコースを蒸留水50mLに溶解して50%グルコース溶液を調製する。</li>
	<li>50 mM Tris-HCl、10%のグルコース、10 mMの塩化ナトリウムを含む塩基性バッファーを準備します。<ol>
<li>塩酸を使用してpHレベルを~8.0に調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.6 mgのピラノースオキシダーゼを316 μLの塩基バッファーに溶解して、ピラノースオキシダーゼ溶液を調製します。</li>
	<li>カタラーゼ溶液を500 μLの基本バッファーに溶解して調製します。10,000 x g で3分間、十分に混ぜ合わせ、遠心分離機を混ぜます。上清は、さらに使用するために保管してください。カタラーゼ溶液は、数日間4°Cで保つことができます。</li>
	<li>316 μLのピラノースオキシダーゼ溶液、25 μLのカタラーゼ溶液、50%グルコース溶液100μL、50μLのシステマーチン、5μLのシステマチラン、5μLのシクロオスタテトライン、3.5μLのβメルカプトエタノールを混合して、500 μLのPALMイメージングバッファーを調製します。ピラノースオキシダーゼとカタラーゼの最終的な触媒活性は、それぞれ7.5 U、35,000Uである必要があります。 注:PALMイメージングバッファは、3〜5時間の最適なイメージング条件を提供します。蛍光色素の点滅能力が低下した場合は、新しい緩衝液アリコートを調製する。</li>
</ol>6. PALM 画像の取得
<ol><li>使用前に少なくとも3時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、熱平衡を可能にするために、イメージングの前にサンプルを室温に持って来てください。顕微鏡にインキュベーションチャンバーが装備されている場合は、温度を30°Cに調整してください。</li>
	<li>適切な洗浄溶媒を使用して、チャンバースライドの目的と底部を洗浄します。</li>
	<li>300 μL の PALM イメージング バッファーをラベル付きセルの 1 つのウェルに加え、チャンバー スライドを顕微鏡のステージ ホルダに挿入します。</li>
	<li>PALM 画像取得パラメータを設定します。<ol>
<li>1.57 N.A. 100xの石油の目標を選択して取得します。</li>
		<li>PALM モードを選択し、TIRF 設定を有効にします。</li>
		<li>取得するフレーム数を調整します。通常、5,000~10,000フレームで最適な結果を得ることができます。しかし、獲得したフレームの数は、蛍光色素の標識効率および点滅能力に強く依存し、使用者によって調整され得る。</li>
		<li>UV レーザーパワーを 0.1%、647 レーザーを 0.2% に設定します。</li>
		<li>ゲインレベルを50~100に設定します。</li>
		<li>レーザー照明をオンにして、ターゲットセルを選択します。ゲインレベルは、信号強度が低い場合(蛍光標識に依存して)増加させることができます。</li>
		<li>レーザー照明をオフにする</li>
	</ol>
</li>
	<li>PALM画像取得<ol>
<li>ゲインを 0 に減らし、レーザーパワー(ex 647)を 100% に増やします。</li>
		<li>ターゲットセルを~5 sに漂白します。</li>
		<li>ゲインを50に増やし、PALM画像の取得を開始します。 注:ゲインは十分な信号強度を得るために調整する必要がありますが、過飽和ピクセルは避けるべきです。信号強度が低下する場合は、ゲインレベルを上げます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>必要に応じて、UVレーザーパワーを着実に増強(0.1%-10%)信号強度を高め、蛍光素の点滅を促進します。</li>
</ol>7. PALMデータの再構築
<ol><li>イメージJソフトウェアを開き、PALMデータをインポートします。</li>
	<li>開く雷雨プラグインと "実行分析"<ol>
<li>[カメラの設定] メニューにピクセル サイズと EM ゲインを入力します。 注:100xの目標と1.6倍の拡大レンズを使用する場合、100 nmピクセルサイズが適しています。ただし、ピクセルサイズは、PALMイメージングに使用される顕微鏡とカメラのハードウェア機能に依存するため、ユーザーはこのパラメータを慎重に確認して適応する必要があります。EM ゲイン値はメタデータから取得できます。</li>
		<li>「ラン分析メニュー」では、パラメータを次のように設定します: B スプラインの順序: 3、B スプライン スケール: 2.0、ピーク強度しきい値: stf(Wave.F1)、フィッティング半径: 3、初期シグマ: 1.6、倍率: 5.0、更新頻度: 50、横シフト:"OK"ボタンをクリックして確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再構築されたPALM画像の後処理<ol>
<li>[プロットヒストグラム] メニューで 、 "Sigma" パラメータを選択します。</li>
		<li>[長方形] ツールを使用して、可能なアーティファクトを除外して ROI を選択し、ROI をフィルタに適用します。ROI 値は、フィルタ コマンド ボックスに表示されます。</li>
		<li>ROI 値に "と不確定性 <25" を追加します。可能なフィルターコマンドは次のようになります: "(シグマ > 48.6821 & シグマ < 1117.40) & 不確実性 <25"。選択したシグマ値を適用します。</li>
		<li>[重複を削除]メニューで、距離のしきい値を「10 nm」と入力して適用します。</li>
		<li>「マージメニュー」で最大距離を「20」、最大分子あたりのフレーム数を「0」、最大オフフレームを「1」に設定します。設定を適用します。</li>
		<li>[ドリフト補正] メニューで相互相関を選択し、"ビン数" を "5" と "拡大" に設定して "5.0" にします。ドリフト補正設定を適用します。</li>
		<li>最終的な PALM イメージを保存し、必要に応じてポスト処理データをエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>サルコメアフィラメントの分析
<ol><li>サルコメア長さの分析<ol>
<li>イメージJソフトウェアを開き、再構築されたPALMイメージをインポートします。</li>
		<li>選択したサルコメア構造の間にZディスクに垂直な線を引き、アクチニンフィラメント間の最短距離を測定します。</li>
		<li>[分析] メニューの [プロット プロファイル] を選択し、2 つのピーク間の長さを取得します。サルコメアの長さは1つの細胞内で変化する可能性があるため、ターゲットセルの異なる領域で最低20個のサルコメアを測定する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-ディスク厚さの分析<ol>
<li>イメージJソフトウェアを開き、再構築されたPALMイメージをインポートします。</li>
		<li>再構築された PALM イメージを 8 ビット モードのイメージに変換します。</li>
		<li>リッジ検出プラグインを開き、次のパラメータを入力します: 20、ハイコントラスト: 230、低コントラスト: 10、シグマ: 0.79、低いしきい値: 25.84、最小行長: 20.</li>
		<li>「見積もり幅」「線を延長」「結果を表示」を設定します。</li>
		<li>[OK] をクリックし、結果表の [平均線幅] を使用して、さらに分析を行います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Erdélyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li>
<li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275(2014).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

iPSC由来のCM in vitroの生成は、再生療法、疾患モデリング、薬物スクリーニングプラットフォームの開発にとって重要です。しかし、これらのCMの成熟度が不十分な心血管研究20における大きな障害である。この点に関して、iPSC由来CMの構造成熟状態のモニタリングを可能にする高分解能イメージング技術が必要である。同時に、超分解能顕微鏡は、チチンおよびトロポニン10、21、22,21,22に対して最近実証されるように、適切なサルコメア形成に必要な特定のタンパク質の機能を正確に分析するための貴重なツールとなり得る。
現在のプロトコルでは、αアクチニンサルコメアネットワークを解析することにより、iPSC CMの構造成熟を定量的に評価するPALMベースのアプローチを提示する。
従来の光顕微鏡と比較し...

心筋梗塞や心筋症などの心血管疾患(CVD)は、西洋世界における主要な死因である。人間の心臓は再生能力が乏しいだけであるため、CVDからの回復を促進する戦略が必要です。これには、失われた心筋細胞(CM)を補充するための細胞置換療法と、効率的かつ安全な医薬品介入のための新しい抗不整脈薬の開発が含まれます。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、ヒトCMインビトロでの無限の生成のための有望な細胞源であることが示されており、再生療法、疾患モデリング、および薬物スクリーニングアッセイ22、3、43,4の開発に適している。
多くの異なる心臓分化プロトコルが存在するが、iPSC由来のCMは、インビトロおよびインビボアプリケーション55、66を妨げる特定の定型的および機能的な側面をまだ欠いている。電気生理学的、代謝的、および分子変化に加えて、心臓成熟プロセスは、力の生成および細胞収縮に必要な基本的な単位であるサルコメアの構造組織を含む7。成人のCMは、よく組織された収縮装置を示すが、iPSC由来のCMは、収縮能力の低下および収縮性の変化に関連するサルコメアフィラメントの配置解除を一般に示す。,9単軸収縮パターンを示す成熟CMとは対照的に、未熟CMにおける混乱した構造は、細胞全体の径方向収縮を生じ、または収縮焦点99,1010の出現を促進する。
心臓成熟を改善するために、3D細胞培養法、電気的および機械的刺激、ならびに生体内条件11、12、13,12,13における細胞外マトリックスを模倣する細胞外マトリックスの使用を含む、複数のアプローチが適用されている。これらの異なる培養条件の成功と効率を評価するためには、iPSC CMの構造成熟度を監視および推定する技術が必要です。従来の共焦点イメージングとは対照的に、光活性化局在化顕微鏡(PALM)の場合の分解能は約10倍高い。この技術は、細胞構造の微妙な変化を検出し、より正確な分析を可能にします14.PALMベースのイメージングの高解像度を考慮すると、この方法の全体的な目標は、zディスクの厚さとサルコメアの長さの正確な決定によるiPSC由来CDのサルコメア成熟度の顕微鏡的評価でした。これまでの研究では、これらの構造的特徴は、心の成熟度15を評価するための適切なパラメータであることが示されている。例えば、全長のジストロフィンを欠いた疾患のiPSC-CMは、野生型細胞16と比較した場合にサルコメア長さおよびzバンド幅を減少させた。同様に、個々のサルコメアの長さを測定し、心臓発達16に対する地形の手掛かりの影響を調べた。そこで、サルコメアの長さとzディスクの厚さを定量的に測定することにより、iPSC-CMにおけるサルコメアネットワークの構造成熟を評価するためにこのアプローチを適用しました。

<table><tbody><tr><td>ヒトiPS細胞株</td><td>宝</td><td>Y00325</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-スライド 8 ウェル ガラス底</td><td>同上</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>0.5ml エッペンドルフチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A906</td><td></td></tr><tr><td>心筋細胞解離キット</td><td>幹細胞技術</td><td>05025</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C40-1G</td><td></td></tr><tr><td>シクロオクタテトラエン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>138924-1G</td><td></td></tr><tr><td>システアミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>30070-10G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 Ca2+ および Mg2+ なし</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2-ヤギ 抗マウス IgG アレクサ フルーア 647</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A-21237</td><td></td></tr><tr><td>フィジー画像処理ソフト (Image J)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>X997.2</td><td></td></tr><tr><td>Siloku Aldrich</td><td></td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>8187150100</td><td></td></tr><tr><td>Pyranose oxidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4234-250UN</td><td></td></tr><tr><td>sarcomeric &α;-actinin antibody [EA-53]</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Nadium</td><td>chloride Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr></tbody></table>

一分子局在顕微鏡を用いたヒトipsc由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

iPSC由来心筋細胞の成熟は、再生療法、薬物検査および疾患モデリングにおける応用において重要な課題である。複数の分化プロトコルが発達しているにもかかわらず、成人のような表現型に似たiPSC心筋細胞の生成は依然として困難である。心筋細胞成熟の主要な側面の1つは、高い収縮能力を確保するためによく組織されたサルコメアネットワークの形成を含む。ここでは、心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの半定量的解析のための超解像ベースのアプローチを提示する。光活性化局在化顕微鏡を用いて、新生児組織から分離したiPSC由来心筋細胞と心臓細胞のサルコメア長さおよびZ-ディスク厚さの比較を行った。同時に、信頼性の高いデータを得るための適切なイメージング条件の重要性を示しています。我々の結果は、この方法が高い空間分解能を有する心細胞の構造的成熟度を定量的に監視するのに適しており、サルコメア組織の微妙な変化を検出することを可能にすることを示している。

CMの構造成熟度を推定するために、新生児、完全に成熟した成人、およびiPSC CMは、最初に、サルコメアネットワークを視覚化するためにαアクチニン抗体でCMに標識した。PALMの取得後、画像を再構築し、個々のフィラメントの幅を自動検出するためのプラグインベースの画像処理ソフトウェアを用いてZディスク厚さを測定した。サルコメア長さは、隣接するフィラメントに対応する2つの隣接する強度ピーク間の距離を測定することによって算出した。 図1 は、iPSC由来CMにおけるサルコメア組織の評価を示す。
図2Aに示されるように、iPSC-CMおよび新生児細胞は、不規則で配置が不整れたサルコメア構造を有する同様のα−アクチニンパターンを示すことが判明した。同様に、定量的評価は、α-アクチニンフィラメントの長さと厚さがほぼ同じであることを示し、iPSC CMの早期発生状態を示す。より正確には、平均サルコメア長さは約1.83 μm(成人対iPSC CM対新生児CM:1.91±0.02 ...

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

この方法は、iPSC由来心筋細胞におけるサルコメア成熟の定量的評価に使用することができる。この超解像度ベースのアプローチを使用すると、従来の共焦点イメージングでは不可能なサルコメア組織の微妙な変化を検出することが可能です。使用の少なくとも3時間前に、顕微鏡のスイッチを入れ、試料を室温にします。顕微鏡の準備ができたら、300マイクロリットルのPALMイメージングバッファーをラベル化された細胞のウェルに加え、チャンバースライドを顕微鏡のステージホルダーに挿入します。1.57 NA 100Xオイルの目的を選択し、イメージングソフトウェアでPALMモードを使用し、TIRF設定を有効にします。フレーム数を 5,000 ~10,000、UVレーザーパワーを0.1%、647レーザーを0.2%、ゲインレベルを50~100に設定します。取得パラメータがすべて設定されたら、レーザー照明をオンにしてターゲットセルを選択します。画像を取得するには、647レーザーパワーを100%に増やし、ゲインをゼロに減らします。ターゲットセルを約5秒間漂白し、ゲインを50に増やしてPALM画像取得を開始します。PALM データの再構築のために、取得の最後に、ImageJ でデータを開き、雷雨 プラグインを開きます。プラグインで実行解析を選択し、カメラのセットアップメニューを開きます。ピクセルサイズと電磁ゲインを入力します。実行解析メニューで、B スプラインの順序を 3 に、B スプライン スケールを 2 に、ピーク強度しきい値を stfwave に設定します。f1、フィッティング半径を3に、初期シグマを1.6に、倍率を5に、更新頻度を50に、横に2にシフトし、OKをクリックします。再構築後、プロットヒストグラムメニューでシグマを選択し、矩形ツールを使用して、可能なアーティファクトを除く対象領域を選択します。対象領域をフィルタに追加し、25 未満の不確定要素を対象領域の値に追加します。[重複の削除] タブで、距離のしきい値として 10 ナノメートルを入力します。[マージ]タブで、最大距離を 20、分子あたりの最大フレーム数をゼロに、最大オフ フレームを 1 に設定します。ドリフト補正タブで、相互相関を選択し、ビン数と倍率を5に設定し、最終的な PALM 画像を保存して、後処理データをエクスポートします。サルコメアの長さを解析するには、目的の PALM 画像を ImageJ にインポートし、ラインツールを使用して、Z-ディスクに垂直に垂直に選択したサルコメア構造の間に線を引き、アクチンフィラメント間の最短距離を測定します。解析メニューでプロットプロファイルを選択し、2つのピーク間の長さを取得します。Z ディスクの厚さを分析するには、再構築された PALM イメージを 8 ビット モードのイメージに変換し、リッジ検出プラグインを開きます。線幅を 20 に、高コントラストを 230 に、低コントラストを 10 に、シグマを 0.79 に、下限しきい値を 25.84 に設定し、最小行長を 20 に設定します。見積もり幅、延長線、および結果の表示を選択し、「OK」をクリックして結果表の平均線幅を使用して、さらに分析します。iPSC由来の心筋細胞と新生児細胞は、不規則に配列が崩壊したサルコメア構造を有する同様のαアクチニンパターンを示す。定量的評価は、αアクチニンフィラメントの長さと厚さが、iPSC由来の心筋細胞の早期発生状態を示す2つの細胞群の間でほぼ同一であることを示している。対照的に、成人成熟型心筋細胞は、サルコメアの長さがわずかに増加し、Zディスクの厚さを減少させた定期的なサルコメアネットワークを示す。従来の共焦点イメージングとPALMの比較では、サルコメアの長さに有意差は見当たらない。しかし、iPSC心筋細胞がPALMイメージングを行う場合には、Zディスクの厚さが深く減少することが検出されます。解像度のゲインは、PALM が適用されると観察され、対応する強度プロットによってサポートされます。特に、低品質のバッファーを用いて得られたサルコメア構造は、最適な画像化条件下で捕捉された構造と比較して厚く見える。このデータ精度の欠如は、フルオロフォアの点滅特性が低下するため、ローカリゼーションイベントごとに検出される光子が少なくなっています。また、ローカリゼーション精度が低下し、再構築されたPALM画像の全体的な解像度が低下します。さらに、サンプルドリフトは、蛍光分子の正確な局在化に影響を与え、画像がぼやけます。適切なPALM画像を取得するには、イメージング中の過度のサンプルドリフトを避けるために、イメージングシステム全体の熱平衡を可能にすることが非常に重要です。この手順に従って、ミトコンドリアのような他の細胞構造をPALMによって画像化して、心筋細胞成熟の追加パラメータを取得することができる。

analyzing-actinin-network-human-ipsc-derived-cardiomyocytes-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。...

Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される

心筋細胞では、管状の膜構造は、細胞内のネットワークを形成している。私たちは、品質管理、最先端の蛍光顕微鏡用ii）の生細胞染色を含むマウスの心臓から心筋細胞のi）の単離のためのプロトコルを最適化について説明し、およびiii）直接画像解析は、コンポーネントの複雑さおよび細胞内膜の可塑性を定量化するネットワーク。...

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。...

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。...

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

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ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。...

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。...

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

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学ぶ PALM超解像顕微鏡法を用いたヒトiPSC由来心筋細胞のαアクチニン構造解析。従来の共焦点顕微鏡では検出できないサルコメア組織の微細な変化を定量的に評価し、心筋細胞の成熟状態を正確に評価する方法です。

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

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