単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて
September 8th, 2009
ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。
ここでは、生きた細菌細胞に対して単一分子蛍光顕微鏡法を実施し、機能的な分子複合体を検出、追跡、定量するためのプロトコルを実演します。このプロトコールは、蛍光色素分子にタグ付けされたタンパク質を作る細菌の成長から始まります。4〜6時間後、少量の細胞を培養物から抽出し、それらのべん毛フィラメントを剪断によって切断します。
フローセル内部のガラスカバースリップは、セルが表面にくっつくようにコーティングされています。細胞をフローセルに注入し、ゲルスタブを介してテザーし、レーザー励起顕微鏡を使用して蛍光で観察します。次に、高量子効率のカメラが、タグ付けされた分子複合体の明るい明視野と蛍光画像を記録します。
こんにちは、私の名前はイアン・ドイで、オックスフォード大学の生化学科でマーク・リーと一緒に働いています。私はアレックス・ロバートソンで、マーク・リーと一緒に物理学科で働いています。私はリークラボのニック・デで、同じく物理学部に所属しています。
本日は、高度な蛍光顕微鏡を使用して、生きた細菌の単一分子複合体を視覚化する手順をご紹介します。この手順を使用して、これを機能的な状態で研究します。また、天然の生物学的機械やナノメートルのレンズスケールのリアルタイムダイナミクスの調査にも使用しています。
それでは始めましょう。大腸菌の凍結茎の50マイクロリットルを解凍するために開始する。これらは遺伝子組み換えされています。
タンパク質に蛍光色素分子をタグ付けするには、5ミリリットルのLB増殖培地を接種し、摂氏37度で一晩中好気的に振とうしながら細菌を増殖させます。翌朝、飽和培養物の50マイクロリットルを取り、それを最小のM 63グルコース培養培地に継代培養し、摂氏30度で4〜6時間インキュベートします。ここでは、2つの異なる細胞株が使用されています。
1つは、GFPに融合した電子輸送シトクロムを発現させるものです。もう1つは、細菌のべん毛モーターに関与するタンパク質を発現しています。GFPに融合した細胞は、固定化されたサンプルと見なす場合は増殖する継代培養から直接回収するか、つながれた条件下で観察する場合は細菌のべん毛を切り捨てるために剪断することができます。
細菌を剪断するには、1〜5ミリリットルの継代培養物を、滅菌配管による2つの滅菌注射器からなる装置に入れます。各シリンジポンプを交互に押し込み、得られたせん断の程度に応じて、培養物を狭いチューブに約50〜100回押し込みます次に、培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、次いで細胞を最小限の培地に再懸濁してべん毛断片を除去します。細胞の準備ができたら、洗浄したBK 7ガラスカバースリップを水酸化カリウムとエタノールの飽和溶液に20分間浸して調製します。
脱イオン水とエタノールで十分にすすぎ、少なくとも1時間自然乾燥させます。.次に、顕微鏡に細胞を収容する単純なフローセルを構築します。これを行うには、BK 7ガラス顕微鏡スライドにパラフィングリースの線を引き、クリーニングしたカバースリップの1つを上に置いてトンネルサンドイッチを作成します。
鉗子で優しく押し下げます。これにより、フローセルの容量は5〜10マイクロリットルになります。固定化された細胞を観察するには、ポリLリジンの0.1%溶液を注入してフローセルを満たし、室温で少なくとも1分間インキュベートします。
次に、フローセルの一方の端から100マイクロリットルの最小限の媒体を注入し、同時にもう一方のティッシュペーパーでフローセルを通じて媒体を吸い上げることにより、フローセルを洗い流し、WICは直径200ナノメートルのラテックスマイクロスフェアの500分の1の希釈液の20マイクロリットルを最小限の媒体に投げて、カバーの滑り面をマークしました。フローセルを単純な湿度チャンバーに入れ、室温で5分間インキュベートします。フローセルは、カバースリップが下を向くように反転しています。
その後、未結合のビーズは、ティッシュペーパーで100マイクロリットルの最小限のメディアを吸い上げて洗い流されます。テザー細胞を観察するには、ポリLリジンインキュベーションステップをスキップし、フローセルに1ミリリットルあたり5マイクログラムの抗フラグジェラン抗体溶液を充填し、湿度チャンバーに10分間置きます。インキュベーション後、ティッシュペーパーで吸湿させてフローセルを洗い流します。
次に、WICの細胞培養物を20マイクロリットルのフローセルを介してティッシュペーパーで、切断されたサンプルを使用してつながれた細胞を観察し、または非共有サンプルを使用して固定化された細胞を観察し、フローセルを反転させ、湿度チャンバーに20分間入れる。次に、結合していない細胞は、100マイクロリットルの最小限の培地を吸い上げることによって洗い流されます。カバースリップの上面の中央にイマージョンオイルを一滴垂らします。
フローセルを特注の蛍光顕微鏡のサンプルホルダーにそっと置きます。これにより、高開口数対物レンズと光学的に接触するはずです。次に、顕微鏡の電子増倍カメラのスイッチを入れ、カメラをマイナス70°Cに冷却するように設定します。
このソフトウェアは、通常のフレームレートである25ヘルツで画像を取得するように設定されています。フレーム転送モード。明視野照明のスイッチを入れ、画像にピントを合わせます。
長軸に固定されていることに基づいてイメージングする適切なセルまたはセルのグループを選択します。カバースリップ面と平行に、カバースリップ面に貼り付けられた200ナノメートルのラテックスビーズがちょうどピントが合っていることを確認するためにピントを調整します。明視野で画像シーケンスを取得し、細胞体の輪郭を記録します。
その後、明視野照明をオフにし、全反射蛍光(芝とも呼ばれる)を使用してイメージングするために、カメラゲインを最大にします。カメラ撮影を開始し、レーザーシャッターを開いて、バクテリア内の蛍光タンパク質を励起します。レーザー強度と取得速度のパラメータは、特定の生物学的システムに対して最適化する必要があります。
研究中のサンプルは、光が漂白されるまで照らされますが、これには通常約10秒かかります。データが収集されると、画像はカスタムメイドの解析プログラムに入力され、細胞内の蛍光スポットの位置を数ナノメートルの精度で自動的に検出し、そのサイズと輝度を抽出します。次いで、分子複合体を引きつける時間に対する光漂白微量の明るさを用いて、化学量論の使用を推定する。
この方法を使用すると、明視野で見た細胞の画像は非常に明確になり、固定化された細胞で蛍光を使用して、細胞体の周囲が白い灰色の細胞体に対して暗くなります。ここでは、幅が250〜300ナノメートルの強度の明確なスポットが偽色で表示されています。健康なテザー細胞は、蛍光励起下の明視野画像でテザー付着点の周りを回転しているのがわかります。
いくつかの分子複合体は、接着点にも見られることがあり、これは、ゲラーモーターでタンクされたタンパク質の局在を示しています。これらのスポットは個々の分子複合体です。これらの数が表示されるかどうかは、使用される照明モードと、一度にセル内に実際に存在する複合体の数によって異なります。
ここで使用した標識シトクロムの場合のように、スポットの密度が最初に非常に高い場合は、最初のフラップ漂白剤を実行すると、イメージングコントラストを改善できます。スポットの移動性は、特定の生物学的システムに依存します。研究では、高度な蛍光顕微鏡を使用して単一分子複合体を視覚化する方法を示しました。
この手順を実行するときは、フラッグモーターの機能を損なう可能性があるため、せん断セルがないことが重要です。また、細胞が酸素枯渇する可能性があるため、顕微鏡スライド上に細胞を1時間以上放置しないことも重要です。最適なイメージング条件を見つけるためには、自動化が必要です。
精製されたGFPのみを使用して、特定の顕微鏡システムに適したレーザー出力を確認するのに役立ちます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、生細菌細胞上の単分子蛍光顕微鏡法のプロトコルを紹介します。この方法により、機能的な分子複合体の検出、追跡、定量化が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 蛍光顕微鏡法
- 細胞生物学
- 分子イメージング
背景
- 単分子蛍光顕微鏡法により、生きた細胞内の個々の分子を観察できます。
- この技術は細胞環境における動的プロセスを研究するために不可欠です。
- 分子複合体を理解することは細胞機能への洞察に不可欠です。
- 生きた細菌細胞はこれらの研究のモデルシステムとして機能します。
研究の目的
- 単分子蛍光顕微鏡法を行うための詳細なプロトコルを提供すること。
- 研究者が生きた細胞内の分子複合体を視覚化し、定量化できるようにすること。
- 細菌細胞内の分子間相互作用の理解を深めること。
使用した方法
- 蛍光染料でタグ付けされたタンパク質を発現する細菌の培養。
- 細胞の抽出とせん断による鞭毛糸の切断。
- フローセルにガラスカバースリップをコーティングして細胞の付着を促進。
- フローセルに細胞を注入し、イメージングにレーザー励起顕微鏡を使用。
主要な結果
- 生きた細菌細胞内のタグ付けされた分子複合体の成功的な視覚化。
- 蛍光イメージングを通じた分子間相互作用の定量化。
- 生きた細胞環境におけるプロトコルの有効性の実証。
- 研究分野の研究者のための再現可能な方法の提供。
結論
- このプロトコルにより、生きた細胞内の分子複合体の詳細な研究が可能になります。
- 単分子蛍光顕微鏡法は細胞生物学のための強力なツールです。
- この方法は分子イメージングの様々な応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing single molecular complexes in living bacterial cells enables mechanistic de-risking of target validation by revealing stochastic and heterogeneous dynamics masked in ensemble measurements. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing physiologically relevant, minimally perturbative observations of functional biological machines at near-native expression levels. The method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages by delivering quantitative, reproducible data on molecular interactions in functional contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of single-molecule stoichiometry and dynamics in functional complexes.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of molecular interactions under near-native conditions, reducing reliance on overexpression artifacts.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment by revealing heterogeneity and functional states invisible to bulk assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-precision spatial and temporal data on molecular complexes for assay benchmarking and validation.
- Operational Value: Delivers reproducible fluorescence-based outputs detectable via standard microscopy platforms.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization through quantifiable single-molecule brightness and bleaching kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining physiological relevance through genomic encoding of fluorescent tags.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of complex dynamics in live cells to inform mechanism-of-action studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular complex behavior with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-molecule resolution of target engagement and complex assembly, informing lead identification through mechanistic insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of molecular complex formation and disassembly in live cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of tethered or immobilized cells with quantifiable fluorescent spot detection.
- Analytics: Delivers nanometer-scale positional data and brightness trajectories for stoichiometry estimation and complex size quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving native expression levels and minimizing cellular perturbation during imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for multiple targets through adaptable fluorescent tagging and flow cell preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of stochastic molecular behavior in functional contexts.
- Operational Value: Standardization via reproducible cell preparation, flow cell assembly, and image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative single-molecule dynamics data.
Implementation Considerations
- Expertise in fluorescence microscopy, bacterial culture, and protein tagging.
- Instrumentation including high numerical aperture objectives, laser excitation, and cooled EMCCD cameras.
- Cross-team standardization of shearing protocols, flow cell preparation, and image analysis pipelines.
- Adaptation considerations for different bacterial strains, fluorescent tags, and target complexes.
- Practical limitations include photobleaching constraints and shear sensitivity of flagellar function.
