単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

本稿では、機能的な分子複合体の検出、追跡、および定量化を可能にするため、生存細菌細胞に対して単一分子蛍光顕微鏡法を行うためのプロトコルを実演します。このプロトコルは、蛍光色素分子でタグ付けされたタンパク質を産生する細菌の培養から始まります。4〜6時間後、培養液から少量の細胞を抽出し、せん断によって鞭毛フィラメントを短縮させます。

フローセル内のガラスカバースリップにコーティングを施し、細胞が表面に接着するようにします。細胞をフローセルに注入し、ゲラースタブ（gellar stub）を介して係留させ、レーザー励起顕微鏡を用いて蛍光観察を行います。その後、高量子効率カメラを用いて、タグ付けされた分子複合体の明視野画像および蛍光画像を記録します。

こんにちは、私はIan Doyです。オックスフォード大学生化学部のMark Leeと共に研究しています。私はAlex Robertsonで、物理学部でMark Leeと共に研究しています。私は物理学部のleak labに所属しているNick Deです。

本日は、高度な蛍光顕微鏡を用いて、生きた細菌内の単一分子複合体を可視化する手順について解説します。この手法を用いて、機能状態でこれらの複合体を研究します。また、ナノメートルスケールにおける天然の生物学的マシンのリアルタイムダイナミクスを調査するためにも本手法を利用しています。

それでは始めましょう。まず、遺伝子改変された凍結保存済みのE. coli細菌株50 µLを融解させます。

タンパク質を蛍光色素分子で標識するために、5 mLのLB培地に接種し、37 °Cで一晩振盪好気培養します。翌朝、飽和培養液から50 µLを分取し、最小M 63グルコース培地に継代して、30 °Cで4〜6時間培養します。ここでは、2種類の異なる細胞株を使用します。

一方では、GFPに融合させた電子伝達シトクロムを発現させます。もう一方では、細菌の鞭毛モーターに関与するタンパク質を発現させます。GFP融合細胞は、固定化試料として観察する場合は、増殖中のサブカルチャーから直接回収します。また、係留条件下で観察する場合は、細菌の鞭毛を切断するためにせん断処理を行います。

細菌を剪断させるため、滅菌済みのピペッティングにより、1〜5 mLの継代培養液を2本の滅菌済みシリンジで構成される装置に入れます。剪断の程度に応じて、各シリンジポンプを交互に押し、培養液を細いチューブに50〜100回ほど強制的に通過させます。次に、培養液を遠心分離して細胞をペレット化し、その後、鞭毛の断片を除去するために最小培地で細胞を再懸濁します。細胞の準備が整ったら、BK7ガラスカバースリップを水酸化カリウムとエタノールの飽和溶液に20分間浸し、洗浄して準備します。

脱イオン水とエタノールで十分に洗浄し、少なくとも1時間以上自然乾燥させます。次に、顕微鏡内で細胞を保持するための簡易的なフローセルを作製します。作製方法は、BK7ガラス製の顕微鏡スライドガラス上にパラフィン 그리스で線を書き、その上に洗浄済みのカバーガラスを載せてトンネル状のサンドイッチ構造を作ります。

ピンセットで軽く押さえます。これにより、フローセルの容積が 5～10 µL になります。固定化した細胞を観察するには、0.1% poly L lysine 溶液を注入してフローセルを満たし、室温で少なくとも1分間インキュベートします。

次に、フローセルの片端から100 µLの最小培地を注入し、同時に反対側からティッシュペーパーで培地を吸い取ることで、フローセル内をフラッシュします。その後、カバーガラス表面をマークするために、最小培地で500倍に希釈した直径200 nmのラテックス微粒子を20 µL吸い込ませます。フローセルを簡易的な加湿チャンバーに入れ、室温で5分間インキュベートします。フローセルを反転させ、カバーガラスが下を向くようにします。

その後、ティッシュペーパーを用いて100 µLの最小培地でウィッキングを行い、未結合のビーズを洗浄します。係留された細胞を観察する場合は、ポリL-リシンによるインキュベーション工程をスキップし、代わりにフローセルに5 µg/mLのAnti-Flag gellan抗体溶液を満たして、加湿チャンバー内に10分間置きます。インキュベーション後、ティッシュペーパーでウィッキングしてフローセル内をフラッシュします。

次に、ティッシュペーパーを用いて、20 µLの細胞培養液をフローセルにウィッキングさせます。テザリングされた細胞を観察する場合は剪断したサンプルを、固定化された細胞を観察する場合は未剪断のサンプルを使用し、フローセルを反転させて加湿チャンバーに20分間置きます。その後、100 µLの最小培地をウィッキングさせて、未結合の細胞を洗い流します。カバーガラス上面の中央にイマージョンオイルを1滴滴下します。

フローセルをカスタムメイドの蛍光顕微鏡のサンプルホルダー上にそっと配置します。これにより、高開口数対物レンズとの光学的な接触が確保されます。次に、顕微鏡の電子倍増カメラの電源を入れ、カメラの冷却温度を-70 °Cに設定します。

ソフトウェアは、通常25 hertzのフレームレートで画像をキャプチャするように設定されています。フレーム転送モードで使用します。明視野照明を点灯し、画像をピント合わせしてください。

長軸方向が固定されていることに基づいて、イメージングに適した細胞または細胞群を選択します。カバーガラス表面に対して平行にフォーカスを調整し、カバーガラス表面に付着している200 nanometerのラテックスビーズにちょうどピントが合うようにします。明視野で画像シーケンスを取得し、細胞体の外形を記録します。

次に明視野照明をオフにし、全内反射蛍光（TIRFとも呼ばれる）を用いたイメージングのために、カメラゲインを最大に設定します。カメラのキャプチャを開始し、レーザーシャッターを開いて細菌内の蛍光タンパク質を励起させます。レーザー強度とキャプチャ速度のパラメータは、特定の生物学的システムに合わせて最適化する必要があります。

解析対象のサンプルを、通常約10秒かかる光退色が生じるまで照射します。データ収集後、画像は独自に作成した解析プログラムに入力され、細胞内における蛍光スポットの位置を数ナノメートルの精度で自動的に検出し、そのサイズと輝度を抽出します。その後、アトラクト分子複合体の時間経過に伴う光退色曲線の輝度を用いて、化学量論的な組成を推定します。

この手法を用いると、明視野で観察した細胞像が非常に鮮明になり、固定化した細胞を用いた蛍光観察において、白灰色をした細胞体に対して細胞体の外周が暗く表示されます。ここでは偽色で表示されており、通常250から300 nanometersの幅を持つ明確な高輝度スポットが確認できます。また、蛍光励起下の明視野像では、健全なテザリング細胞がテザリング固定点を中心に回転する様子が観察されます。

付着点においていくつかの分子複合体が見られる場合があり、これはタンクタンパク質がGellerモーターに局在していることを示しています。これらのスポットは個々の分子複合体です。観察されるこれらの数は、使用する照明モードや、ある時点で細胞内に実際に存在する複合体の数によって異なります。

本研究で使用したラベル付きシトクロムのように、スポットの密度が当初非常に高い場合は、最初にFRAPブリーチングを行うことでイメージングのコントラストを向上させることができます。スポットの可動性は、対象となる特定の生物学的システムによって異なります。以上で、高度な蛍光顕微鏡を用いて単一分子複合体を可視化する方法について解説しました。

この手順を行う際は、鞭毛モーターの機能が損なわれる可能性があるため、細胞にせん断力をかけないことが重要です。また、細胞を顕微鏡スライド上に1時間以上放置すると酸素不足に陥る可能性があるため、注意してください。最適なイメージング条件を決定するには、自動化が必要です。

お使いの顕微鏡システムに最適なレーザー出力を確認するには、精製GFPのみを使用することが有効です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。