Name: 単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学ぶ単一分子蛍光顕微鏡法で生細菌内の機能的分子複合体を可視化・追跡・定量化する手法。このプロトコルは細胞生物学研究における分子ダイナミクスの理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は教授ジュディスアーミテージ（オックスフォード大学、英国）と教授コンラッドMullineaux（ロンドンのクイーンメアリー大学、英国）のグループから、菌株の種類の寄付を認める。 IMDは、共同で生化学の部門（オックスフォード大学）とOCISBによって資金を供給され、ARは、工学物理科学研究評議会（EPSRC）DTCの学生の身分によって資金を供給され、NDは、バイオテクノロジーおよび生物科学研究会議（BBSRC）から資金提供され、MCLは王立協会大学研究フェローシップによって資金を供給。

<ol><li>この手順を開始するには、 大腸菌の細菌細胞を発現する蛍光蛋白質の凍結ストックの50μlを最初に解凍し、午前中は37℃で一晩5 mlのLB培養培地で振盪しながら好気的に栽培されている、この飽和文化の50μlを抽出し、 、最小のM63グルコースの培地へと継代培養4〜6時間、30℃でインキュベートする。ここでは、電子輸送を表現するそのうちの一つ、2つの異なる細胞株を、使用例を示すGFP、GFPと融合した細菌べん毛モーターに関与するタンパク質を発現する他に融合されたチトクローム。 </li><li>細胞は固定化のサンプルとしてそれらを表示する場合のいずれかに成長のサブカルチャーから直接採取したり、それらは&quot;テザー&quot;の条件で表示する場合細菌の鞭毛を切り詰めるために剪断することができます。 </li><li>せん断は、無菌配管で結合された2つの滅菌注射器で構成されるデバイスに典型的にはサブカルチャーの1〜5ミリリットルを置くことが含まれます。せん断は、狭いチューブを通して文化をプッシュするごとにシリンジポンプを押し込んで交互に行われます。これは、必要なせん断の程度に応じ、50〜100倍が行われる。文化は、鞭毛のフラグメントを削除するには、最少培地で再懸濁している細胞をペレットに遠心分離されています。 </li><li>私たちは、その後、その後、脱イオン水とエタノールで徹底的に洗浄し、少なくとも1時間空気中で乾燥するまま、20分間エタノールにKOHの飽和溶液に浸漬することにより、BK7ガラス製カバースリップの洗浄準備</li><li>我々は、顕微鏡で細胞を収容するための簡単​​なフローセルを構築する。これは、BK7ガラスの顕微鏡スライド上にパラフィングリースの描画線を含み、その上にきれいにcoverlipsのいずれかを配置し、ピンセットで軽く押し下げて、トンネルサンドイッチを作成、5〜10μlののフローセルのボリュームを与える。 </li><li>固定化細胞を観察するために我々は、ポリ- L -リジンの0.1％w / v溶液を注射することにより、フローセルを入力し、それは少なくとも1分間室温でインキュベートすることができます。我々は、その後、フローセルの一方の端からメディアを注入し、他からティッシュペーパーでウィッキングで100μlの最少培地を用いて洗い流す。 </li><li>私たちは、その後、カバーガラスの表面をマークする最少培地で200nmの直径ラテックス微小球（Polysciences）の1:500希釈の20μlを通過ウィク。フローセルは、カバースリップは、下向きにシンプルな湿度チャンバーで表面の明確なプラットフォーム上に配置し、5分間室温でインキュベートされるように反転されます。非結合ビーズを100μlの最小限のメディアを介して吸い上げによって洗い流されている。 </li><li>我々がつながれた細胞を観察したい場合は我々は、ポリ- L -リジンのステップを省略し、代わりに5 mg / mlの抗フラジェリン抗体とフローセルを埋める。フローセルは、10分間加湿チャンバー内の場所ですし、発散性に優れたによってによってフラッシュされます。 </li><li>細胞培養液20μlの固定化細胞を見に係留細胞または断片化していない試料を観察する場合のどちらか剪断されたサンプルを使用して、フローセル通過して邪悪です。 </li><li>フローセルが反転し、20分間加湿チャンバーに配置されます。非結合細胞を次いで100μlの最小限のメディアを通して吸い上げによって洗い流されている。 </li><li>液浸オイルのドロップはカバースリップの上面の中央に配置され、フローセルは、高開口数対物レンズとの光学的接触をする、カスタムビルドの蛍光顕微鏡の試料ホルダーにに軽く置かれます。 </li><li>顕微鏡電子乗算カメラがオンになり、カメラは-70℃に冷却するように設定され、ソフトウェアは、最初のゲインコントロールをdisenabling、フレーム転送モードで25Hzの典型的なフレームレートで画像を取得するために設定されていますカメラ。 </li><li>明視野照明のスイッチがオンになっていると画像がそのカバーの表面に平行に、その長軸と立ち往生しているに基づいて撮像するセルの適切なセルまたはグループを選択し、フォーカスに取り込まれます。フォーカスが細かくカバーの表面に付着した200nmのラテックスビーズをジャストフォーカスになっていることを保証するために調整されます。 </li><li>イメージシーケンスは、細胞体の輪郭を記録するために明に取得されます。明視野照明はオフになり、カメラのゲインが最大に有効になっています。 </li><li>内部全反射蛍光（または反射）、適切な波長以上のレーザービームを（ここで、緑色蛍光タンパク質の励起のために、我々は473 nmのレーザーを使用）を使用して標準的な取得のための後焦点面に集束されるようにあらかじめ設定されています対物レンズが、細胞のサンプルに蛍光励起のためのエバネッセント場を生成する光軸から横方向にずれる。 </li><li>カメラの取得が開始され、レーザーのシャッターには、細菌内で蛍光タンパク質を励起するために開かれます。買収のレーザーの強さと速度のパラメータは異なる値を試すことで調査中の特定の生物学的システム向けに最適化する必要がありますが、典型的な範囲R細胞膜におけるモバイルタンパク質複合体を研究するelevantは50から40 msのフレームあたりの露光時間で、直径〜30μm程度の円形の励起領域の上に1から10 mWのレーザパワーです。サンプルは通常、〜10秒間、photobleachedまで点灯されています</li><li>このプロトコルは、両方のセルの本体は、カバースリップと鞭毛スタブとの間の、そして堅くカバーの表面に固定されている固定化細胞のための結合点を中心に回転されるテザーセルに使用することができます。 </li><li>複合体の高コピー数を持ついくつかの細胞株は、前の全反射イメージングにセルの一方の極の初期回折限界の集光漂白剤の恩恵を受ける。この漂白剤は、（またはFRAP）光退色後蛍光回復で使用されているものと同等です。私たちのカスタム顕微鏡を使用して、励起レーザ光の一部は、FRAP型漂白に使用する第2の独立したパスにオフ供給することができます。通常は1 - 10mWのレーザパワーは、範囲10から300ミリ秒の典型的な漂白時間は、使用されています。その後、より簡単に可視化するためにその領域に拡散させる個々の複合体を可能にする細胞の漂白ゾーンではるかに高いイメージングコントラストでこの結果。 </li><li> &quot;slimfield&quot;と呼ばれる別の照明モードが採用されている細胞膜に比べてはるかに高速拡散細胞の細胞質で複合体を視覚化するための。ここで焦点レーザーは、横方向にちょうど単一のセルを含むように拡張されている。これは通常、ミリ秒のかなり高速のエクスポージャーを取るこ​​とができ、非常に強烈なフィールドを生成します。 </li><li>データ取得に続いて、画像はカスタム作成されたソフトウェア（LabVIEW 8.5でコード化された）に供給される。これは自動的に通常、数ナノメートルの精度に細胞内の蛍光スポットの位置を検出し、その大きさと明るさを抽出します。追跡分子複合体の時間に対する光退色トレースはその後化学量論を推定するために使用されているbrightnessofは、単一の分子複合体を構成する方法多くの個々の蛍光タンパク質、すなわち。 </li></ol>代表的な結果： プロトコルが正しく行われている場合、明視野で見る細胞の画像は白/グレーの細胞体（図1a）に対して暗細胞体の周囲で、非常に区別される。蛍光を使用して固定化細胞では、我々は、幅で、通常は250から300 nmの（図1b）の別個のスポットの強度を、見ることができます。健康、テザ​​ー細胞は、明視野像におけるテザーの添付ファイルのポイントを中心に回転するように見られます。蛍光励起の下で我々の場合におけるいくつかの分子複合体はまた、べん毛モーターを持つタグタンパク質の局在を示す、添付ファイルの時点で見られるかもしれません。これらのスポットは、個々の分子の複合体であると見られるそれらの数は、使用される照明モードに依存し、実際に一度に細胞内でどのように多くの複合体の提示されています。スポットの移動度は、研究対象の特定の生物学的システムに依存します。スポットの密度が最初は非常に高い場合は、ここで使用ラベル付けシトクロムの場合と同様に、初期FRAPの漂白を行うと、画像のコントラストを向上させることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="図1" /> 図1。細菌の鞭毛モーターに関与することが知られている緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合タンパク質を発現する固定化大腸菌の細胞のための（A）明視野と（B）全反射の画像（疑似カラー）。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

これは、べん毛モーターの機能を損なうおそれがあるので注意が、つながれた細菌を調べるための細胞&quot;せん断を介して&quot;しないように注意する必要があります。彼らは酸素枯渇になる可能性があるので、顕微鏡スライド上に、1時間に1回よりもはるかに長いためにセルを使用することが重要です。かなりの最適化は、最適な顕微鏡の撮像条件が検討され、特定の生物学的システムへの仕出し料理見つけるために必要となる場合があります。それはあなたの特定の顕微鏡システムに必要な正しい強度レーザーの励起を確認するために単独で精製GFPを用いたイメージングを試みることが賢明かもしれない。

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

生きた細胞のメカニズムへの完全な洞察は、細胞レベルでの事象を惹起し、ダイレクトキープロセスを調べることによってのみ達成することができます。生物系のせん断複雑さをこれまでには、代わりに相対的に原油バルクアンサンブル平均測定を使用して単一システムの研究に焦点を当て、あまりにも要求される正確な単一分子実験を引き起こしている。しかし、多くの重要なプロセスは一つのレベルで生きている細胞や少数の分子で起こる、アンサンブルの測定値は、一般的にこれらのイベントの確率と異種の性質を覆い隠す。ここでは、高度な光学顕微鏡と我々は、単一の分子とどのように我々は生物学的機械の機能に分子複合体内動態を観察できるの精度への単一の生きた細菌細胞内のタンパク質を監視する方法を示す分析画像解析ツールを使用して。テクニックは、生理学的に直接関連しています。彼らが検討されて生体試料に最小限の摂動と非侵襲的であり、完全に生体を構成する物質の調査、生物物理学の他の単一分子のアプローチが容易に利用できない機能に同調されています。さらに、生物学的標本は、すべて自然に発生するよりもはるかに多くのタンパク質を生成するための、より一般的ですが、理想的なアプローチとは対照的に変更されていない細胞株（&quot;ゲノムエンコード&quot;）とほとんど同一のレベルで、少なくとも蛍光タグタンパク質を生成する研究（&quot;発現プラスミド&quot;）。このように、調査される実際の生物学的サンプルは、自然の生物にかなり近いですので、実際の生理学的プロセスへの観察は、より関連性の高い。

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。

生細胞のメカニズムを完全に理解するには、細胞レベルでの現象を誘発し、方向付ける主要なプロセスを調査することでのみ達成可能です。

本稿では、機能的な分子複合体の検出、追跡、および定量化を可能にするため、生存細菌細胞に対して単一分子蛍光顕微鏡法を行うためのプロトコルを実演します。このプロトコルは、蛍光色素分子でタグ付けされたタンパク質を産生する細菌の培養から始まります。4〜6時間後、培養液から少量の細胞を抽出し、せん断によって鞭毛フィラメントを短縮させます。フローセル内のガラスカバースリップにコーティングを施し、細胞が表面に接着するようにします。細胞をフローセルに注入し、ゲラースタブ（gellar stub）を介して係留させ、レーザー励起顕微鏡を用いて蛍光観察を行います。その後、高量子効率カメラを用いて、タグ付けされた分子複合体の明視野画像および蛍光画像を記録します。こんにちは、私はIan Doyです。オックスフォード大学生化学部のMark Leeと共に研究しています。私はAlex Robertsonで、物理学部でMark Leeと共に研究しています。私は物理学部のleak labに所属しているNick Deです。本日は、高度な蛍光顕微鏡を用いて、生きた細菌内の単一分子複合体を可視化する手順について解説します。この手法を用いて、機能状態でこれらの複合体を研究します。また、ナノメートルスケールにおける天然の生物学的マシンのリアルタイムダイナミクスを調査するためにも本手法を利用しています。それでは始めましょう。まず、遺伝子改変された凍結保存済みのE. coli細菌株50 µLを融解させます。タンパク質を蛍光色素分子で標識するために、5 mLのLB培地に接種し、37 °Cで一晩振盪好気培養します。翌朝、飽和培養液から50 µLを分取し、最小M 63グルコース培地に継代して、30 °Cで4〜6時間培養します。ここでは、2種類の異なる細胞株を使用します。一方では、GFPに融合させた電子伝達シトクロムを発現させます。もう一方では、細菌の鞭毛モーターに関与するタンパク質を発現させます。GFP融合細胞は、固定化試料として観察する場合は、増殖中のサブカルチャーから直接回収します。また、係留条件下で観察する場合は、細菌の鞭毛を切断するためにせん断処理を行います。細菌を剪断させるため、滅菌済みのピペッティングにより、1〜5 mLの継代培養液を2本の滅菌済みシリンジで構成される装置に入れます。剪断の程度に応じて、各シリンジポンプを交互に押し、培養液を細いチューブに50〜100回ほど強制的に通過させます。次に、培養液を遠心分離して細胞をペレット化し、その後、鞭毛の断片を除去するために最小培地で細胞を再懸濁します。細胞の準備が整ったら、BK7ガラスカバースリップを水酸化カリウムとエタノールの飽和溶液に20分間浸し、洗浄して準備します。脱イオン水とエタノールで十分に洗浄し、少なくとも1時間以上自然乾燥させます。次に、顕微鏡内で細胞を保持するための簡易的なフローセルを作製します。作製方法は、BK7ガラス製の顕微鏡スライドガラス上にパラフィン 그리스で線を書き、その上に洗浄済みのカバーガラスを載せてトンネル状のサンドイッチ構造を作ります。ピンセットで軽く押さえます。これにより、フローセルの容積が 5～10 µL になります。固定化した細胞を観察するには、0.1% poly L lysine 溶液を注入してフローセルを満たし、室温で少なくとも1分間インキュベートします。次に、フローセルの片端から100 µLの最小培地を注入し、同時に反対側からティッシュペーパーで培地を吸い取ることで、フローセル内をフラッシュします。その後、カバーガラス表面をマークするために、最小培地で500倍に希釈した直径200 nmのラテックス微粒子を20 µL吸い込ませます。フローセルを簡易的な加湿チャンバーに入れ、室温で5分間インキュベートします。フローセルを反転させ、カバーガラスが下を向くようにします。その後、ティッシュペーパーを用いて100 µLの最小培地でウィッキングを行い、未結合のビーズを洗浄します。係留された細胞を観察する場合は、ポリL-リシンによるインキュベーション工程をスキップし、代わりにフローセルに5 µg/mLのAnti-Flag gellan抗体溶液を満たして、加湿チャンバー内に10分間置きます。インキュベーション後、ティッシュペーパーでウィッキングしてフローセル内をフラッシュします。次に、ティッシュペーパーを用いて、20 µLの細胞培養液をフローセルにウィッキングさせます。テザリングされた細胞を観察する場合は剪断したサンプルを、固定化された細胞を観察する場合は未剪断のサンプルを使用し、フローセルを反転させて加湿チャンバーに20分間置きます。その後、100 µLの最小培地をウィッキングさせて、未結合の細胞を洗い流します。カバーガラス上面の中央にイマージョンオイルを1滴滴下します。フローセルをカスタムメイドの蛍光顕微鏡のサンプルホルダー上にそっと配置します。これにより、高開口数対物レンズとの光学的な接触が確保されます。次に、顕微鏡の電子倍増カメラの電源を入れ、カメラの冷却温度を-70 °Cに設定します。ソフトウェアは、通常25 hertzのフレームレートで画像をキャプチャするように設定されています。フレーム転送モードで使用します。明視野照明を点灯し、画像をピント合わせしてください。長軸方向が固定されていることに基づいて、イメージングに適した細胞または細胞群を選択します。カバーガラス表面に対して平行にフォーカスを調整し、カバーガラス表面に付着している200 nanometerのラテックスビーズにちょうどピントが合うようにします。明視野で画像シーケンスを取得し、細胞体の外形を記録します。次に明視野照明をオフにし、全内反射蛍光（TIRFとも呼ばれる）を用いたイメージングのために、カメラゲインを最大に設定します。カメラのキャプチャを開始し、レーザーシャッターを開いて細菌内の蛍光タンパク質を励起させます。レーザー強度とキャプチャ速度のパラメータは、特定の生物学的システムに合わせて最適化する必要があります。解析対象のサンプルを、通常約10秒かかる光退色が生じるまで照射します。データ収集後、画像は独自に作成した解析プログラムに入力され、細胞内における蛍光スポットの位置を数ナノメートルの精度で自動的に検出し、そのサイズと輝度を抽出します。その後、アトラクト分子複合体の時間経過に伴う光退色曲線の輝度を用いて、化学量論的な組成を推定します。この手法を用いると、明視野で観察した細胞像が非常に鮮明になり、固定化した細胞を用いた蛍光観察において、白灰色をした細胞体に対して細胞体の外周が暗く表示されます。ここでは偽色で表示されており、通常250から300 nanometersの幅を持つ明確な高輝度スポットが確認できます。また、蛍光励起下の明視野像では、健全なテザリング細胞がテザリング固定点を中心に回転する様子が観察されます。付着点においていくつかの分子複合体が見られる場合があり、これはタンクタンパク質がGellerモーターに局在していることを示しています。これらのスポットは個々の分子複合体です。観察されるこれらの数は、使用する照明モードや、ある時点で細胞内に実際に存在する複合体の数によって異なります。本研究で使用したラベル付きシトクロムのように、スポットの密度が当初非常に高い場合は、最初にFRAPブリーチングを行うことでイメージングのコントラストを向上させることができます。スポットの可動性は、対象となる特定の生物学的システムによって異なります。以上で、高度な蛍光顕微鏡を用いて単一分子複合体を可視化する方法について解説しました。この手順を行う際は、鞭毛モーターの機能が損なわれる可能性があるため、細胞にせん断力をかけないことが重要です。また、細胞を顕微鏡スライド上に1時間以上放置すると酸素不足に陥る可能性があるため、注意してください。最適なイメージング条件を決定するには、自動化が必要です。お使いの顕微鏡システムに最適なレーザー出力を確認するには、精製GFPのみを使用することが有効です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。...

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。...

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

相関光電子顕微鏡 (クレム) メソッドは、以前、光顕 (LM) で選択されているセルの電子顕微鏡検査 (EM) による画像ウイルスによる細胞内構造に適用されます。LM および EM は、ウイルス-宿主間相互作用の統合ビューを達成するためにハイブリッド...

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1...

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。...

Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡

このプロトコルは、相関光顕微鏡と電子顕微鏡を使用して、それぞれmEosEMとAPEX2で標識されたミトコンドリアとリソソームの相互作用を視覚化するメカニズムを説明しています。...

ミトコンドリアとリソソーム間の相互作用を可視化するための2色相関光顕微鏡と電子顕微鏡法

学ぶ単一分子蛍光顕微鏡法で生細菌内の機能的分子複合体を可視化・追跡・定量化する手法。このプロトコルは細胞生物学研究における分子ダイナミクスの理解に貢献します。

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

さらに動画を探す