間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

樹状突起スパインは、ニューロンの樹状突起からの膜突起であり、シナプス入力を受け取ります。棘の伸長、縮小、または消失は、神経活動の特定のパターンに起因する神経ネットワーク機能の変化に応答して発生します。この現象は、樹状突起スパインの形態学的変化を観察するための皮質可塑性として知られています。

生きた動物では、マウスの頭蓋骨にイメージングプレートが貼り付けられています。頭蓋骨の領域は外科的に薄くされ、低倍率と高倍率での画像が必要です。その後、エリアは後の時点で再イメージ化されます。

得られた結果は、樹状突起棘の形態が、複数の時点で薄い頭蓋骨の準備を使用して明確に視覚化できることを示しています。そして、その背骨の形態は非常に可塑性であり、構造の変化と樹状突起棘の出現と消失を示しています。こんにちは、私はロチェスター大学の神経生物学および解剖学部門のアナヤ・マカ研究室のエミリー・ケリーです。

今日は、プレパレーションと呼ばれるフィンに続くマウスバイアル皮質の慢性イメージングの手順を示します。私たちの研究室では、この手順を使用して樹状突起脊椎のターンオーバーを研究しています。それでは始めましょう。

無菌手術用のツールを滅菌することから手順を開始します。次に、70%エタノールを使用してワークスペースを滅菌し、操作面を清潔なドレッシングで覆います。フェンタニルカクテル麻酔マウスの麻酔の深さをモニターします つま先のつま先をつまむことに対する反応をテストすることにより、ここに示されているマウスは、GFPが発現しているA-G-F-P-Mトランスジェニックマウスです。

第5層では、樹状突起プロセスを表層に投影するパラメタルセル。体温を摂氏37.5度に保つには、動物を加熱毛布の上に置き、付属の直腸体温計で監視します。次に、はさみを使用して目が乾燥するのを防ぐために、眼科用軟膏を塗布します。

マウスの後頭部から耳の後ろから目にかけて毛を取り除きます。次に、70%エタノールを塗布して動物の頭のてっぺんをきれいにし、続いてベタジンスクラブとベタジン溶液を塗ります。耳の後ろと正中線の右側または左側に沿ってLCU切開を行い、どちらの半球が目に画像化されるかに応じて、皮膚を折り返して手術部位から離します。

皮膚は後で細い鉗子を使って縫合するので、皮膚は取り出さないでください。皮膚をそっと引き上げて、関心のある領域から離します。清潔な鉗子を使用して、頭蓋骨の露出部分から骨膜をそっとこすり落とします。

頭蓋骨に少量の10%公正塩化物を塗布して、骨膜膜を完全に乾燥させ、完全に除去したことを確認します。頭蓋骨が完全に乾いていることが重要です。接着剤が適切に付着するように、乾燥した骨膜膜を顕微手術用ブレードでそっとこすり落とします。

次に、ステンレス製ヘッドプレートのイメージングウィンドウの周りに佐野アクリル接着剤を薄く塗り、プレートを頭蓋骨に貼り付けます。綿棒の木製の端で、イメージングウィンドウの内側の継ぎ目に接着剤を塗布し、イメージングプレートと頭蓋骨の湾曲との間のすべての隙間を埋めるようにします。接着剤加速器をウィンドウに一滴垂らします。

次に、余分なものをすばやく拭き取ります。接着剤が完全に乾いたら、接着剤を乾かします。0.7ミリメートルのステンレス鋼のバリで固定された歯科用ドリルを使用して、イメージングウィンドウの頭蓋骨を薄くし始めます。

0.9%滅菌生理食塩水を時折適用する交互の穴あけ。頭蓋骨に過度の熱を発生させるのを避けるため。頭蓋骨の表面を横切る小さなストロークを使用して、頭蓋骨の4 x 4ミリメートルの窓を薄くします。

デンタルドリルで。鈍い端の鉗子で頭蓋骨の薄さをテストします。頭蓋骨の表面は、穏やかな圧力でわずかにへこみます。

イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは10〜30ミクロンです。頭蓋骨が薄くなったら、窓からすべての破片を取り除き、頭蓋骨に生理食塩水を置きます。解剖スコープに取り付けられたデジタルカメラでイメージングウィンドウを撮影します。

この写真の脳血管系は、その後のイメージングセッションのためにイメージングプレートを配置する位置を見つけるのに役立ちます。動物を2フォトンリグに運びます。動物は加熱ブランケットの上に留まり、イメージングセッション全体を通して体温を継続的に監視する必要があります。

ミタイレーザーを搭載した2光子顕微鏡。最大出力の10ワットソリッドステートポンプと、改良されたオリンパスのフロービュー共焦点ユニットが使用されています。このシステムは深部組織のイメージングに最適化されており、外部検出器は対物レンズのできるだけ近くに設置され、脳からの蛍光を最大限に検出できるようにし、低デジタルズームを使用してイメージングウィンドウに生理食塩水を一滴加えます。

デジタルカメラを使用して、明るく標識されたニューロンを含む領域を特定します。Ips、イメージングエリアの写真を撮ります。これは、その後の時点で同じイメージング位置に戻るために必要です。

樹状突起の影響の程度を示す脳の可視範囲全体にわたる低倍率のスタックを取得します。これは、血管と樹状突起の両方として、後続の時点でイメージング領域を特定するために使用されます。イメージングソフトウェアを使用して、若い動物や成体の動物でその構造を維持します。

デジタル倍率を8倍に増やし、必要に応じてXY座標を調整し、樹状突起スパインの位置や構造を含む詳細な樹状突起形態を示す高倍率スタックを収集します。パン座標、コレクションの範囲、Z ステップ サイズ、スタック内のステップ数など、各スタック コレクションに関する詳細なメモを取ります。これらのノートは、その後の時点でこの樹状突起または軸索に戻るときに使用されます。

イメージング後、ヘッドプレートを頭蓋骨の表面からそっと離して取り外します。鉗子を使用します。残っている接着剤をすべて取り除き、0.9%滅菌生理食塩水で頭蓋骨を拭きます。

6番の縫合糸を使用して、頭蓋骨の上の皮膚を縫合します。イメージング手順に従って、70%エタノールでその領域を拭きます。動物が目を覚まし、動きやすくなるまで、動物をヒートランプの下の清潔なケージに入れます。

次に、動物を元のケージに戻して、2日から数か月後のどこかの時点で動物を再びイメージし、ステッチを取り除き、頭の皮膚を再度開きます。無菌法を使用して、最初の手術中に撮影された脳血管系のデジタル画像を使用して、元のイメージング位置を特定します。その後、以前と同様にヘッドプレートを固定し直します。

必要に応じて、顕微手術用ブレードを使用して、イメージング時間の間に再成長した可能性のある骨を優しく薄くします。歯科用ドリルで薄くし、イメージングウィンドウの破片を取り除き、0.9%滅菌生理食塩水を滴下します。動物を2光子顕微鏡に運び、前のセッションで撮影したデジタル蛍光画像を使用して元のイメージング領域を特定します。

フロービュープログラムを開始します。元の低倍率画像を開き、透明シートをパソコンの画面に貼り付け、透明ペンで主要な血管パターンをスケッチします。次に、ライブ画像を開き、血液血管系を透明フィルム上のスケッチパターンに再調整します。

透明度を にすると、8 x ズームインされた構造物のイメージが再作成されます。前のイメージングセッションから収集した目的のスタックを開きます。コンピューター画面に貼り付けられた透明フィルムに構造をスケッチします。

ライブ画像から 8 倍にズームインし、画像を透明度に合わせます。低倍率の位置合わせの精度によっては、画像の角度をわずかに調整する必要がある場合もあり、パン座標を初日のイメージングパラメータに設定し、ステップサイズや画像の数など、ザックの画像収集を2回行うことができます。頭蓋骨の完全性を乱さないように、頭皮を開く回数を制限する必要があります。これにより、GFPM発現マウスの画像解像度が低下します。

ここでは、第5層パラメタル細胞のサブセットおよび対応する樹状突起過程をin vivo 2光子レーザー走査型顕微鏡を用いて可視化し、GFP標識視覚野樹状突起が示されている。この画像は、PIAから5ミクロンごとに取得された1つの画像を最終的な深さ175ミクロンまで投影したものです。ボックス化された領域は、ここでは 0 日目に高い倍率で示され、ここでは 4 日目に再び、0 日目と 4 日目の樹状突起枝画像の高倍率で示されています。

これらの画像は、白い矢印の頭で示される安定した棘を示しています 引っ込む棘が失われ、赤い矢印の頭でマークされ、新しい棘は緑の矢印で示されます。ここまで、薄い頭蓋骨製剤を用いてマウス視覚野で慢性的な2光子イメージングを行う方法を紹介しました。この手順を行うときは、頭蓋骨とその下にある硬膜の損傷を避けるために、薄くなるプロセス中に特別な注意を払うことを忘れないでください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。