表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製
2010年12月3日
このプロトコルでは、可溶性タンパク質の洗浄剤複合体として、発現、可溶化、および組換え的に発現する膜蛋白質、MexBの精製を示す。 MexBは日和見細菌性病原体は緑膿菌からの多剤耐性膜輸送体である。
Mex B膜タンパク質を精製するために、まず遺伝子組換えDNA法を用いてMex Bを大腸菌に発現させます。次に、メンブレンを単離し、メンブレンタンパク質を中性界面活性剤で可溶化します。可溶化した膜タンパク質はiMacで精製され、タンパク質はゲルろ過クロマトグラフィーでさらに精製されます。
タンパク質の精製レベルは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて決定します。この手順は、多剤耐性膜貫通トランスポーターへの洞察を提供することができますが、他の膜タンパク質にも適用することができます 今日の手順が私の研究室の大学院生によって形成されます この手順では、シュードモナス・アオサのMex BをPET 30 Bプラス発現ベクターにサブクローニングして、Mex BがC末端HEXAヒスタミンタグで発現されるようにします。夕方に4つの3ミリリットルポンド缶マイシン培養物に新鮮な形質転換剤を接種するか、冷凍ストックを使用して、朝に摂氏37度のローラーで培養物を成長させることから始めます。
一晩培養して、1ミリリットルあたり30マイクログラムを含む150ミリリットルのLBを接種します。マイシンは午後にシェーカーで摂氏37度で培養できますか?小さな培養物を使用して、1リットルあたり30マイクログラムを含む2つのXYT培地を1リットルの6倍に接種します。
シダの背部フラスコにマイシンを入れることはできますか?1〜40希釈で1培養あたり25ミリリットルを使用してください。光学密度に達するまで、37°Cで培養物を成長させます。
0.4〜0.6の600、約1.5時間。培養物が適切な密度に達したら、0.5ミリリットルの1モルを添加してタンパク質発現を誘導します。IPTGの。すべてのフラスコをシェーカーに戻し、翌朝バクテリアを収穫するまで、摂氏30度で一晩成長させ続けます。
シェーカーから培養物を取り出し、冷やします。次に、細胞を収穫するために、培養物を遠心分離管に移し、細胞が遠心分離されている間に大規模な遠心分離機で毎分5,000回転で摂氏4度で30分間遠心分離します。100ミリリットルの細胞懸濁液バッファーにDNA、プロテアーゼ阻害剤、リゾチームを補給します。
また、この表に示すように、膜Resus懸濁液バッファーの2つのアリコートにプロテアーゼ阻害剤を添加します。遠心分離が完了したら、3つの溶液すべてを氷上に置いてください。Resusは、細胞ペレットを100ミリリットルの細胞resus懸濁液バッファーに使用します。
次に、細胞を抽出します。セル懸濁液をフレンチプレッシャーセルにロードし、セルをフレンチプレスに置きます。圧力は、12, 000ポンド/平方インチに達するまで加えられます。
バルブはごく少量開いて、壊れた細胞が滴り落ちるようにします。バルブを開きすぎてセルを噴出させないことが重要です。これは、セルが小さすぎる圧力で放出され、効率的に壊れないためです。細胞ライセートをボトルに集め、氷上で冷やします。
セル溶液を再びフランスの圧力セルに通し、12, 000ポンド/平方インチで通過させます。細胞ライセートをSS 34遠心分離管に移し、遠心分離機に遠心分離して、SS 34ローターで摂氏4度で毎分10,000回転で細胞の破片を除去します。次は清澄化されたライセートです。
メンブレン画分の調製に使用されます。スーピネートを慎重にtiに移します。6 4、7 0.5超遠心分離機の管、4 4 4 7 0.5の回転子で40、摂氏4度で50分間毎分000回転で遠心
分離機。supinateを捨てます。ピペットを使用して、約25ミリリットルの膜Resus懸濁液バッファーに細胞膜を含むペレットを穏やかに再懸濁し、膜懸濁液をきれいな遠心分離管に移し、TI I 6 4 7 0.5ローターで4°Cの50分間、毎分40,000回転のゲインを遠心分離し、洗浄したメンブレンパレットを25ミリリットルの膜Resus懸濁液バッファーに再懸濁します。次に、膜タンパク質を再懸濁した膜に約25ミリリットルで可溶化します。
最終的な洗剤の集中が2%DDMであるように10%DDMの6ミリリットルを加えて下さいDDMの遠心分離機の存在下で2時間、40,000回転/分で混合物を40,000回転でTI I 6 4 7 0.5回転の回転の40分間の後で2時間、摂氏4度で混合物を揺さぶる。不溶性タンパク質から可溶性タンパク質界面活性剤複合体を分離するため。精製に使用するためにMex B蛋白質の洗剤複合体を含んでいる仰臥位のnatantを、Resus懸濁液緩衝液で平衡化した2ミリリットルのlon金属親和性ビーズとMex B蛋白質の洗剤複合体を含む仰臥位のnatantを保存し、樹脂に蛋白質が結合した後、4°Cのローラーで1時間インキュベートします。
重力流柱本体にスラリーを流し込み、流路を捨てます。カラムの洗浄が完了したら、20ミリリットルまたは10カラム容量のiMacバインディングと洗浄バッファーでカラムを洗浄します。結合したタンパク質を10ミリリットルのiMac溶出バッファーで溶出します。
各溶出画分について10マイクロリットルのサンプルを採取します。10マイクロリットルの2倍SDSサンプルと混合し、バッファーし、10%ポリアクリルアミドで分析します。SDSゲル。
各画分中のmex Bの量と純度を推定します。Mex Bタンパク質界面活性剤複合体を含む画分を引っ張り、摂氏4度のスピン濃縮器に濃縮します。このステップでタンパク質が沈殿しないように注意してください。
いくつかの短いスピンを使用して、降水量を監視します。各スピン後、ゲルろ過カラムを使用してプールされたフラクションの精製に進みます。スーパーローズ 12 HL 30 over 10 カラムを 24 ミリリットルのランニングバッファーで事前に平衡化し、平坦なベースラインを待ちます。
次に、アクター システムの読み込みループを実行中のバッファーですすいでください。タンパク質をカラムにアプライする前に、シリンジフィルターを使用してタンパク質溶液をろ過します。次に、最大240マイクロリットルのタンパク質溶液をカラムにロードし、1ミリリットルあたり最大5ミリグラムのタンパク質を充填します。
1.5カラム容量のバッファーを実行し、0.25ミリリットルのフラクションを収集します。XBタンパク質界面活性剤複合体は、溶出量約10〜15ミリリットルでピークとして溶出します。ピーク画分の5マイクロリットルのサンプルを採取します。
各サンプルを2倍のSDSサンプルバッファーで1対1に混合します。10%ポリアクリルアミドゲル上のサンプルを分析して、各画分のmeメックスBの量と純度を推定し、純粋なME B.Thisポリアクリルアミドゲルを含む画分を引っ張りますiMacカラムから引っ張られた画分とゲルろ過カラムからの個々の画分をロードしました。ゲルろ過カラムの後、タンパク質はkumasi染色されたポリアクリルアミドゲル上で純粋に現れます。
ゲルろ過カラムからのトレースは、カラムから溶出するタンパク質界面活性剤複合体のメインピークを示しています。mxbタンパク質の平均収量は、2つのXYT培養物の6リットルあたり約2ミリグラムであり、一度習得すると、この手順は適切に実行されれば8時間で行うことができます。このビデオを見れば、膜タンパク質の発現、可溶化、精製の方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、Pseudomonas aeruginosa由来の多剤耐性トランスポーターであるMexB膜タンパク質の発現、溶解、精製について概説しています。このプロセスには組換えDNA法と様々な精製技術が含まれ、可溶性タンパク質界面活性剤複合体を生成します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生化学
- 微生物学
- タンパク質精製
背景
- MexBは多剤耐性に関与する膜タンパク質です。
- 組換えDNA技術を用いて大腸菌で発現します。
- 精製プロセスは膜貫通輸送メカニズムへの洞察を提供します。
- この方法は他の膜タンパク質にも適用できます。
研究目的
- MexB膜タンパク質をさらなる研究のために精製すること。
- タンパク質発現における組換えDNA法の使用を実証すること。
- 多剤耐性トランスポーターの特性を探索すること。
使用方法
- PET 30 B plus発現ベクターを用いて大腸菌でMexBの発現。
- 膜の分離と弱い界面活性剤を用いた溶解。
- 固定化金属親和性クロマトグラフィー（iMac）による精製。
- ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたさらなる精製。
主要な結果
- MexBの可溶性タンパク質複合体としての成功的な発現と精製。
- SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたタンパク質純度の評価。
- 多剤耐性トランスポーターの機能に関する洞察。
- 他の膜タンパク質へのプロトコルの適用可能性の実証。
結論
- このプロトコルはMexBを効果的に精製し、膜タンパク質の研究のためのモデルを提供します。
- 組換えDNA法は研究におけるタンパク質発現に有用です。
- MexBの理解は抗生物質耐性メカニズムの知識に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables the production of purified membrane protein complexes essential for mechanistic studies of multidrug resistance transporters. By providing a scalable method to solubilize and purify transmembrane proteins like MexB, it supports target validation and assay development in antimicrobial discovery. The approach reduces biological risk in early-stage programs by enabling structural and functional characterization of clinically relevant efflux pumps.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MexB function in multidrug resistance pathways.
- Operational Value: Provides purified protein detergent complexes for binding and inhibition assays.
- Strategic Value: Supports target de-risking by confirming druggability of RND transporters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields soluble MexB suitable for high-throughput screening of efflux pump inhibitors.
- Operational Value: Standardized purification ensures batch-to-batch consistency for assay reproducibility.
- Strategic Value: Enables structure-guided inhibitor design through downstream biophysical characterization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking MexB activity to antibiotic resistance phenotypes.
- Operational Value: Purified complexes allow evaluation of compound effects on transporter function in vitro.
- Strategic Value: Supports preclinical model validation using defined molecular targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling progression from target engagement to lead optimization for antimicrobial programs targeting efflux-mediated resistance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on MexB substrate specificity and inhibition mechanisms.
- Screening: Delivers purified target for assay development and compound profiling.
- Analytics: Enables quantitative assessment of protein purity and yield via SDS-PAGE and gel filtration.
- Translational Research: Connects molecular target validation to phenotypic resistance outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for solubilizing and purifying other multidrug resistance transporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into transmembrane transport and inhibition.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable purification of membrane proteins.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing uncertainty in target validation.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of efflux pump inhibitors based on validated target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression and membrane biochemistry.
- Depends on access to ultracentrifugation, affinity chromatography, and gel filtration systems.
- Necessitates optimization of detergent type and concentration for solubility and stability.
- Involves careful handling to prevent protein precipitation during concentration steps.
- Limited by the need for specialized equipment and time-intensive purification workflows.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Introduction
1:08
Protein Overexpression
2:48
Harvesting and Extracting the Cells
4:58
Preparing the Membrane Fraction and Solubilizing Transmembrane Proteins
6:46
Hexahistidine Tag Affinity Purification by IMAC
8:23
Gel Filtration
9:44
Representative Results from MexB Purification
10:23
Conclusion
