Name: 表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ MexB膜タンパク質の発現・可溶化・精製法。Pseudomonas aeruginosaの多剤耐性トランスポーターを大腸菌で発現し、界面活性剤可溶化とiMAC・ゲル濾過クロマトグラフィーで精製します。膜タンパク質研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクトは、全米科学財団と生体分子科学学会からCJJへの補助金によって支えられている。

1。 1日目： 緑膿菌からMexBはpFB101によってエンコードされます。 MexB遺伝子は、P.から増幅された緑膿菌ゲノムDNAおよびpET30b +ベクトルのNdeI及びXhoI制限部位に挿入。構造はC末端ヘキサヒスチジンタグが含まれています。 <ol><li>プラスミドを大腸菌を形質転換するのに使用され大腸菌は、C43（DE3）12株、および形質転換体を30 ug / mlとカナマイシンを含むLB寒天上にプレーティングされています。 </li></ol> 2。 2日目：一晩培養： <ol start="2"><li>夕方には、30 ug / mlとカナマイシンを含む4 X 3 mlのLB培養液は、新鮮な形質転換体のコロニーから接種されています。また、培養は、凍結パーマから接種することができます。 これらの小さな文化は37℃で一晩ローラー上に成長されています。 </li></ol> 3。 3日目：6リットルの文化を育てる。 <ol start="3"><li>午前中は、30 ug / mlとカナマイシンを含む150mLのLBに接種するのに一晩培養を使用してください。 37シェーカー上で° Cで培養して成長する。 </li><li>午後には、フェルンバッハのフラスコで30 ug / mlとカナマイシンを含む6 × 1L 2XYTメディアを接種する小さな文化を使う。 （1:40希釈用培養液あたり25mlを使用してください）​​。 37の文化を育て° Cを彼らが0.4から0.6のOD 600に到達するまで、1.5時間程度</li><li>培養物は、適​​切な密度に達すると、0.5mLの1M IPTGを添加することによりタンパク質の発現を誘導する。シェーカーに戻ってすべてのフラスコに入れ、℃で一晩30℃、それらを成長を続けている。 </li></ol> 4。 4日目：細胞を採取し、タンパク質を精製する。 <ol start="6"><li>次のように、緩衝液にプロテアーゼ阻害剤、DNアーゼ、およびリゾチームを追加する：細胞の再懸濁バッファー50mlに、10mgのDNaseI（0.1 mg / mLの最終濃度）、リゾチームの1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤のタブレット、とピンチを追加します。 。膜の再懸濁バッファー60 mLに、1プロテアーゼ阻害剤のタブレットを追加する。膜の再懸濁バッファーの別の50 mLに、1プロテアーゼ阻害剤のタブレットを追加する。氷の上ですべての3つのソリューションをしてください。 </li><li>細胞を回収するために大規模な遠心分離機の文化30分5,000 rpmで遠心する。 </li><li> 100 mLの細胞を再懸濁バッファーに懸濁し（50 mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、2mMのMgCl 2、1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤のタブレット、リゾチームのは0.1 mg / mlのDNase I、ピンチ） </li><li> 12000 PSI（762ゲージ圧）でフレンチ圧力セルを2回細胞溶液を渡します。瓶の中に細胞ライセートを収集するには、氷の上に冷たいまま。 </li><li> SS34遠心チューブに細胞溶解液を移し、4℃、10,000 rpmで30分間細胞破片を除去するため遠心° CのSS - 34ローターで。 </li><li>慎重にTi647.5超遠心チューブに上清を取り除く。 4Cで40,000 rpmで50分間遠心操作する。上清を捨てる。 </li><li>約で、細胞膜を含むペレットを、懸濁します。膜の再懸濁バッファーを25mL（50 mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤の錠剤）。 </li><li> 4℃で50分間Ti647.5ローターで40,000 rpmで遠心チューブと遠心分離機℃に膜懸濁液を移す</li><li>上清を捨て、25mLの膜の再懸濁バッファー（50mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤の錠剤）で洗浄した膜ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 5。 TMタンパク質Solublization： <ol start="15"><li>再懸濁した膜（25mLを約）に、6 mLの10％DDM（最後の界面活性剤濃度= 2％DDM）ロック4で混合℃で2時間。を追加する</li><li> 4℃で40分間40,000 rpmで混合物を遠心° C不溶性の蛋白質から可溶性タンパク質の界面活性剤複合体を分離するTi647.5ローターインチMexBタンパク質の洗剤の複合体を含む上清を、保存します。 </li></ol> 6。 IMAC： <ol start="17"><li>再懸濁バッファーで平衡化した爪の金属アフィニティービーズで高速回転から得られた上清を混ぜる。 4でローラーで1時間インキュベート℃に</li><li>重力流カラム本体にスラリーを注ぎ、フロースルーを捨てる。 </li><li> IMAC結合および洗浄バッファー（50 mMリンNAP、pH7で、300mMのNaCl、5％グリセロール、0.2％DDM）を20mL（10カラム体積）でカラムを洗浄</li><li> IMAC溶出バッファー（50mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、250 mMイミダゾール、0.2％DDM）でタンパク質を溶出する。 </li><li>溶出画分15μLのサンプルを取る、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析のために15μL2X SDSサンプルバッファーでそれぞれを混ぜる。微量遠心機で30秒を回転させる。各分画でMexBの量と純度を推定するために10％ポリアクリルアミドSDSゲル上でサンプルを分析する。 </li><li> MexBタンパク質の洗剤の複合体と4でスピンコンセントレータでそれらを集中を含む画分をプール℃のタンパク質がこのsで沈殿しないように注意してくださいTEP。 </li></ol> 7。ゲル濾過カラム： <ol start="23"><li> 24 mlのランニングバッファー（50 mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、0.2％β-オクチルグルコシド）とスーパーローズ12 HL 10分の30の列をあらかじめ平衡化し、フラットなベースラインを待ちます。 </li><li>バッファを実行するとループをロードするAKTAシステムをすすぎます。 </li><li>列に適用する前に、シリンジフィルターを用いてタンパク質溶液をフィルタ。 </li><li> 5mgの/ mLまでのタンパク質濃度で、カラムにタンパク質溶液240μLまで原稿をセット。 </li><li>バッファの1.5カラム体積（36 mL）を実行する、0.25 mLの画分を集めた。溶出量を15mL - MexBタンパク質の洗剤の複合体は、約10のピークとして溶出してください。 </li><li>ピーク画分の5μLのサンプルを取る。 2X SDSサンプルバッファーで各サンプル1:1に混ぜる。各分画でMexBの量と純度を推定するために10％ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを分析する</li><li>純粋MexBを含む画分プール。 </li></ol> 8。代表的な結果： 図1は、ゲル濾過カラムからのIMACカラムと個々の画分からプールされたカラムの分画とポリアクリルアミドゲルを含んでいる。ゲル濾過カラムの後にタンパク質はクマシー染色したポリアクリルアミドゲルで純粋に表示されます。図2は、カラムからのタンパク質の洗剤複雑な溶出の主要なピークを示すゲル濾過カラムからのトレースが含まれます。 MexBタンパク質の平均収量は2XYT文化6リットルあたり約2ミリグラムです。 <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 MexBのPDCの精製の​​SDS - PAGEゲル。レーン1、分子量マーカー。 2、IMACの画分をプールされた。 3-7、ゲルろ過カラムの分画。 <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 MexBタンパク質の洗剤の複合体（PDC）用のゲルろ過の結果の例。

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
<li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).</li>
<li>Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+MexAB-OprM%2C+MexCD-OprJ%2C+and+MexXY-oprM+efflux+pumps+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).</li>
<li>Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrAB+efflux+pump+plays+a+major+role+in+the+antibiotic+resistance+phenotype+of+Escherichia+coli+multiple-antibiotic-resistance+%28Mar%29+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.</a> J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).</li>
<li>Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug+efflux+pumps+MexA-MexB-OprM+and+MexC-MexD-OprJ+in+a+multidrug-sensitive+Escherichia+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).</li>
<li>Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrA%2C+AcrB%2C+and+TolC+of+Escherichia+coli+Form+a+Stable+Intermembrane+Multidrug+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux.</a> Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).</li>
<li>Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mex-gene+products+in+antibiotic+extrusion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).</li>
<li>Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+and+surfactant+interactions+in+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).</li>
<li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+membrane+solubilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Surfactants in membrane solubilisation.</a> Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).</li>
<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

多剤耐性に加えて、イオン輸送、細胞間コミュニケーション、小胞輸送、細胞構造の維持、および宿主 - 病原体相互作用を含む多くの重要な細胞活動は、細胞膜に埋め込まれているタンパク質を含む。膜貫通型タンパク質は、既知のタンパク質の30％以上を構成し、今日使用されている医薬品の大半の目標です。膜貫通型タンパク質の不適切な折りたたみや活動は、嚢胞性線維症や糖尿病などの重要な遺伝病につながる。膜貫通型タンパク質の広大な重要性にもかかわらず、可溶性タンパク質に比べてその構造と分子機構に関するこれまであまり知られています。疎水性配列の存在は、それが難しいこれらのタンパク質の大量を表現し、分離することと、多くの生化学的及び構造方法へのそれらは、難治性ですできます。 このプロトコルは、可溶性タンパク質の界面活性剤複合体としてMDRの膜タンパク質の発現、界面活性剤可溶化および精製を示した。これらのメソッドは、多くの組換えにより発現さの膜貫通タンパク質のいくつかの変更で使用することができます。結果として得られる精製されたタンパク質の界面活性剤複合体は可溶性であり、リポソームまたは架橋の研究への再構成を含め...

<table><tbody><tr><td>SDSサンプルバッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>C43(DE3) E. coli 株</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>2XYT培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>LB培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤タブレット</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-ドデシル-&amp;#946;-D-マルトピラノシド</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>15mlチューブ</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>See-Saw Rocker</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Talonメタルアフィニティーレジン</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>10% ポリacrylamide SDS PAGE ゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Tris/グリシン/SDS PAGE 泳動バッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidascope プレステイン分子量マーカー</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 30/10 カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Amicon遠心濃縮器</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Fernbachフラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>Fernbachフラスコ用シェーカー</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aktaシステム</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000ローター付 J6 大容量遠心機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 l 遠心ボトル</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>RC-5 遠心機</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SS34 固定角ローターおよびチューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall フロアモデル超遠心機</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T647.5 ローターおよびキャップ付きチューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>Frenchプレス</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、mexbの多剤耐性タンパク質の精製

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

多剤耐性（MDR）、構造的および機能的に関係のない抗がん剤や抗生物質の広い範囲に耐性であることが癌細胞や病原体の能力は、公衆衛生の現在の深刻な問題です。この多剤耐性がエネルギー依存性の薬剤排出ポンプによるところが大きい。ポンプは、毒性閾値以下にそれらの細胞内濃度を下げる、外部媒体への抗がん剤や抗生物質を排出する。我々は、 緑膿菌 、例えば、怪我や病気の多くのタイプの患者に感染症を引き起こす日和見細菌性病原体、火傷や嚢胞性線維症では、とにも免疫不全のがん、透析、および移植患者における多剤耐性を検討している。 P.における主要なMDRの排出ポンプ緑膿菌は、内膜プロトン-薬物アンチポーター（RND）、外膜のチャネル（OMF）、およびペリプラズムリンカー蛋白質（MFP）1-8から成る三者複合体である。 RNDとOMFタンパク質は、膜貫通蛋白質である。膜貫通型タンパク質は、全てのタンパク質の30％以上を構成し、現在の創薬ターゲットの65％です。疎水性の膜貫通ドメインは、水性緩衝液中のタンパク質が不溶性にします。膜貫通タンパク質を精製することができる前に、それは蛋白質が蛋白質の界面活性剤複合体（PDC）9月11日として可溶化できるように中性洗剤を含む緩衝条件を発見することが必要である。この例では、我々はRNDタンパク質、P.を使用してください、膜貫通タンパク質の組換え形態を表現洗剤を使用して、それを可溶化し、タンパク質の界面活性剤の複合体を精製する方法を示す緑膿菌の MexB貫通型トランスポーター、。この一般的な方法は、発現、精製、および他の多くの組換え的に発現する膜タンパク質の可溶化に適用することができます。タンパク質の洗剤の複合体は、後にX線結晶構造決定や架橋の研究を含む生化学的または生物物理学的特性評価に使用することができます。

このプロトコルでは、可溶性タンパク質の洗浄剤複合体として、発現、可溶化、および組換え的に発現する膜蛋白質、MexBの精製を示す。 MexBは日和見細菌性病原体は緑膿菌からの多剤耐性膜輸送体である。

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

多剤耐性（MDR）とは、がん細胞や病原体が、構造的および機能的に無関係な広範囲の薬剤に対して耐性を持つ能力のことであり、...

Mex B膜タンパク質を精製するために、まず組換えDNA法を用いてe coliでMex Bを発現させます。次に、膜を単離し、温和な界面活性剤で膜タンパク質を可溶化します。可溶化した膜タンパク質をiMacで精製し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製します。タンパク質の精製度は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて決定します。この手順は多剤耐性膜貫通輸送体に関する知見を得るために有効ですが、他の膜タンパク質にも適用可能です。本日の手順は、私の研究室の大学院生によって行われます。本手順では、Pseudomonas aeruginosa由来のMex BをPET 30B+発現ベクターにサブクローニングし、MexBのC末端にHis-tagが付加された状態で発現させます。夕方に、新鮮な形質転換体または凍結ストックを用いて、3 mLのLB-カナマイシン培地4本に接種します。これらの培養物を、37 °Cのローラー上で一晩培養し、翌朝に回収します。オーバーナイト培養液を用いて、30 µg/mLのカナマイシンを含む150 mLのLB培地を接種し、37 °Cの振盪機で午後まで培養します。この小規模培養液を用いて、30 µg/mLのカナマイシンを含む1 LのXYT培地6本に接種します。マイシンをシダバックフラスコに加えます。1:40希釈のため、1培養あたり25 millilitersを使用します。光学密度に達するまで、37 °Cで培養します。OD$_{600}$が0.4から0.6に達するまで、約1.5時間培養します。培養液が適切な密度に達したら、1 M IPTGを0.5 mL添加してタンパク質発現を誘導します。すべてのフラスコをシェーカーに戻し、翌朝に細菌を回収するまで、30 °Cで一晩培養を継続します。シェーカーから培養液を回収し、冷却します。次に、細胞を回収するため、培養液を遠心チューブに移し、大型遠心機を用いて4 °Cで5,000 rpmで30分間遠心分離します。細胞の遠心分離を行っている間に、100 mLの細胞再懸濁緩衝液にDNAse、プロテアーゼ阻害剤、およびリゾライムを添加します。また、この表に示されているように、メンブレン再懸濁緩衝液の2つの分注分にプロテアーゼ阻害剤を添加します。遠心分離が完了したら、3つの溶液すべてを氷上で保持してください。細胞ペレットを100 millilitersの細胞再懸濁緩衝液で再懸濁します。次に、細胞を破砕します。細胞懸濁液をフレンチプレスセルに充填し、セルをフレンチプレスにセットします。圧力を12,000 pounds per square inchに達するまでかけます。破砕された細胞が少しずつ流れ出るように、バルブをごくわずかに開きます。バルブを開けすぎると細胞が勢いよく噴き出しますが、それでは圧力が不十分な状態で放出されるため、効率的に破砕されません。細胞溶解物は、氷上で冷却したボトルに回収してください。細胞懸濁液を、再び12,000 pounds per square inchのフレンチプレスに通します。細胞溶解液をSS 34遠心管に移し、SS 34ローターを用いて4 °Cで10,000 rpmで30分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。これにより、清澄化された溶解液が得られます。膜画分を調製するために使用します。上清をTI 6 4, 7 0.5超遠心管に慎重に移し、TI 6 4 7 0.5ローターを用いて40,000 rpmで50分間、4 °Cで遠心分離します。上清を廃棄します。ピペットを使用して、細胞膜を含むペレットを約25 millilitersのmembrane Resus suspension bufferで穏やかに再懸濁します。膜懸濁液を清潔な遠心管に移し、TI I 6 4 7 0.5ローターを用いて40,000 rotations per minuteで50 minutes、4 degrees Celsiusで再度遠心分離し、洗浄した膜ペレットを25 millilitersのmembrane Resus suspension bufferで再懸濁します。次に、再懸濁した膜に対し、約25 millilitersで膜タンパク質を可溶化します。最終的な界面活性剤濃度が2%DDMとなるように、10%DDMを6mL加えます。混合物を4°Cで2時間揺盪させます。DDM存在下で2時間のインキュベーション後、TI I 6 4 7 0.5ローターを用いて、混合物を40,000rpmで40分間、4°Cで遠心分離します。これにより、可溶性タンパク質-界面活性剤複合体と不溶性タンパク質を分離します。MexBタンパク質-界面活性剤複合体を含む上清を回収し、精製に使用します。MexBタンパク質-界面活性剤複合体を含む上清を、Resus懸濁緩衝液で平衡化した2mLの金属アフィニティービーズと混合します。ローラーを用いて4°Cで1時間インキュベートし、タンパク質をレジンに結合させます。スラリーを重力フローカラムボディに注ぎ、通り抜けた液を廃棄します。カラムの洗浄が完了したら、20 mLまたは10カラムボリュームのiMac結合・洗浄バッファーでカラムを洗浄します。結合したタンパク質を10 mLのiMac溶出バッファーで溶出させます。各溶出分画から10 µLのサンプルを採取します。2倍濃度のSDSサンプルバッファー10 µLと混合し、10%ポリアクリルアミドSDSゲルで分析します。各フラクションに含まれるMex Bの量と純度を推定します。Mex Bタンパク質界面活性剤複合体を含むフラクションを回収し、4 °Cでスピン濃縮器を用いて濃縮します。このステップでタンパク質が沈殿しないよう注意してください。数回の短時間遠心分離を行い、沈殿が生じないか確認します。その後、回収した分画を合わせて、ゲルろ過カラムを用いて精製します。Superose 12 HL 30 10/300 GL カラムを 24 milliliters のランニングバッファーで予備平衡化し、ベースラインが安定するまで待ちます。次に、アクターシステムのローディングループをランニングバッファーで洗浄します。タンパク質をカラムに適用する前に、シリンジフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過してください。その後、最大5 mg/mLの濃度のタンパク質溶液を、最大240 µLまでカラムにロードします。1.5カラムボリュームのバッファーを流し、0.25 mLずつ分画して回収します。XBタンパク質界面活性剤複合体は、溶出量約10〜15 mLでピークとして溶出します。ピーク分画から5 µLのサンプルを採取します。各サンプルを2倍濃度のSDSサンプルバッファーと1対1の比率で混合します。10%ポリアクリルアミドゲルでサンプルを分析し、各画分中のMex Bの量と純度を推定し、純粋なMex Bを含む画分を回収します。このポリアクリルアミドゲルには、iMacカラムから回収した画分およびゲルろ過カラムからの個々の画分をロードしました。ゲルろ過カラム後のタンパク質は、クマシー染色したポリアクリルアミドゲル上で純粋な状態で現れます。ゲルろ過カラムのトレースは、タンパク質-界面活性剤複合体のメインピークがカラムから溶出していることを示しています。mxbタンパク質の平均収量は、2 XYT培地6Lあたり約2mgです。習熟すれば、適切に実施することでこの手順を8時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、膜タンパク質の発現、可溶化、および精製方法について十分に理解できるはずです。

expression-detergent-solubilization-purification-membrane-transporter

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、 緑膿菌からの排出ポンプのin vitroでの調査のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、リポソーム膜内で、堅牢で可逆的、かつ調整可能なプロトン勾配の生成を可能にし、ひいてはprotomotive力によって通電任意の膜タンパク質に適応可能である必要があります。...

緑膿菌からの MexAB排出ポンプの体外調査に

緑色蛍光タンパク質の融合に基づく大腸菌における組換え膜タンパク質の発現についてスクリーニングする効率的なアプローチが提示される。...

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。...

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

ここの postfusion 二層にこれらの膜タンパク質の洗剤無料配信するためターゲット脂質膜融合ペプチド プロテオリポソームに膜タンパク質の再構成とそのようなプロテオリポソームの融合の 2...

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

ここで表現し、可溶化、酵母を用いた SLC4 トランスポーター家族に相同性を有するいくつかの真核生物のホウ酸トランスポーターを浄化するプロトコルを提案します。ポリコームタンパク アセンブリの精製 homomeric...

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

フランスのプレスを用いた大腸菌の異種発現と細胞の分解によって産生される膜小胞製剤におけるプロトン駆動膜トランスポーターの特性評価方法について説明する。...

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。...

カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

ヒト膜トランスポーターの構造的および生化学的研究には、安定で無傷の均質なタンパク質がミリグラム単位で必要です。ここでは、コドン最適化遺伝子を用いてヒト溶質キャリアトランスポーターをスクリーニング、発現、精製するためのスケーラブルな方法について説明します。...

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

このプロトコルは、最終遠心分離ステップに二糖類トレハロースを含む改良されたSERCA精製法について説明しています。この炭水化物は、過酷な条件下でタンパク質を安定化させます。精製されたSERCAは触媒活性があり、高純度を示したため、構造的および機能的研究に適していました。...

ウサギ筋肉からの筋小胞体Ca2+-ATPaseの精製

学ぶ MexB膜タンパク質の発現・可溶化・精製法。Pseudomonas aeruginosaの多剤耐性トランスポーターを大腸菌で発現し、界面活性剤可溶化とiMAC・ゲル濾過クロマトグラフィーで精製します。膜タンパク質研究に応用可能です。

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

さらに動画を探す