Name: 構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ ヒト溶質担体（SLC）のハイスループット発現・精製法。コドン最適化クローニングとBacmid発現系を用いて高純度タンパク質を調製し、構造生物学と創薬研究の基盤となる。

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この作業は RESOLUTE プロジェクト内で行われました。RESOLUTE は、Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (革新的医薬品イニシアチブ 2 共同事業) から助成金契約 No 777372 に基づき資金提供を受けました。この共同事業は、欧州連合(EU)の研究・イノベーションプログラム「ホライズン2020」とEFPIAの支援を受けています。この記事は著者の見解のみを反映しており、IMIも欧州連合およびEFPIAも、そこに含まれる情報の使用について責任を負いません。pHTBVプラスミドは、Frederick Boyce教授(ハーバード大学)のご厚意により提供していただきました。

溶質キャリアトランスポーターの発現および精製戦略

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

SLCを標的とする治療法の開発は、トランスポーター機能の体系的な特徴付けが欠如しているため、依然として妨げられてきました。これにより、正常および病態生理学的プロセスにおける多くの役割にもかかわらず、GPCRおよびイオンチャネル63と比較して、このタンパク質クラスを標的とする薬剤が不釣り合いに少なくなっています。RESOLUTE は、現在の SLC 研究を加速し、改善するための最先端の研究手法とツールの開発を目的とした国際コンソーシアムです。RESOLUTE の一環として、ヒト SLC の効率的なクローニング、コンストラクトスクリーニング、大規模発現および精製のためのプロトコルを開発しました。
本稿では、推定SLCおよび孤立SLCを含むヒトSLCトランスポーターの系統的探索に成功したスケーラブルなSLCクローニングおよび発現法について述べる。 特に、この方法で精製されたSLCは、その後のトランスポーター構造、生化学、機能、結合剤生成、および低分子結合の研究で成功裏に使用されている。この方法を定期的に採用してミリグラム単位のSLCを精製し...

膜タンパク質は、長い間、研究者や製薬業界の標的となってきました。これらのうち、溶質キャリア(SLC)は、ヒトゲノム1内にコードされている400を超える二次トランスポーター遺伝子のファミリーです。これらのトランスポーターは、イオン2、神経伝達物質3、脂質4,5,6,7、アミノ酸8、栄養素9,10,11、医薬品12など、多数の分子の輸出入に関与しています。このような幅広い基質により、これらのタンパク質は、毒素の輸送13、乱用薬物の輸送と阻害14,15、または有害な突然変異16を通じて、さまざまな病態生理学にも関与しています。細菌の相同体は、いくつかのSLCファミリーの基本的な輸送メカニズムのプロトタイプとして機能してきました17、18、19、20、21、22、23、24、25。ヒトタンパク質とは対照的に、原核生物のオルソログは、よく理解されている大腸菌発現系でよりよく発現することが多く26,27、X線結晶構造解析用の整然とした結晶を生成する小さな界面活性剤でより安定しています28。しかし、配列と機能の違いは、これらの遠縁タンパク質の創薬への使用を複雑にします29,30。したがって、SLCを標的とする薬物の作用機序を解読するために、ヒトタンパク質の直接的な研究がしばしば必要になります31、32、33、34、35。クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)の最近の進歩により、より天然に近い条件でのSLCの構造特性評価が可能になりましたが36,37、これらのタンパク質の発現と精製の難しさは、標的治療薬や診断薬の開発にとって依然として課題です。
この課題を軽減するため、RESOLUTE コンソーシアム (re-solute.eu) は、ヒト SLC ファミリータンパク質の大規模な発現と精製のためのリソースとプロトコルを開発しました38。コドン最適化遺伝子を皮切りに、SLCコンストラクトのハイスループットクローニングおよびスクリーニング法を開発しました。これらの方法はSLCファミリー全体に系統的に適用され、遺伝子はBacMamウイルス発現系にクローニングされ、タンパク質発現は、以前に記述されたハイスループットクローニングおよび発現試験の方法に基づいてヒト細胞株で試験された39。要約すると、SLC遺伝子はpDONR221プラスミドからpHTBV1.1ベクターにクローニングされます。その後、このコンストラクトを使用して、哺乳類細胞で発現するためのサイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー要素を含む昆虫細胞をトランスフェクションするためのバクミドベクターに目的の遺伝子を転置します。得られたバキュロウイルスは、標的SLCタンパク質の発現のために哺乳類細胞を形質導入するために使用できます。
さらに、選択したSLCの大規模発現と安定精製のための標準化された方法を開発しました(図1)。このプロトコルには、効果的なトラブルシューティングを容易にし、実験間のばらつきを最小限に抑えるための複数のチェックポイントが含まれています。特に、タンパク質の発現と局在のルーチンモニタリング、および個々のターゲットの精製条件の小規模な最適化は、連鎖球菌および緑色蛍光タンパク質(GFP)タグによって支援されました41,42。
最終的に、これらの化学的に純粋で構造的に均質なタンパク質サンプルは、X線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)による構造決定、生化学的ターゲットエンゲージメントアッセイ、結合剤生成のための免疫、および化学的に定義されたリポソームへの再構成による無細胞機能研究に使用できます。

<table><tbody><tr><td>3Cプロテアーゼ</td><td>50</td>または100 kDaカットオフ遠心濃縮器を自社<td></td><td></td>で製造</tr><tr><td></td><td>ザルトリウス</td><td>VS0242</td><td></td></tr><tr><td>5-シクロヘキシル-1-ペンチル-&β;-D-マルトシド</td><td>アナトレース</td><td>C325</td><td>CYMAL-5</td></tr><tr><td>96ウェルバクミド精製キット</td><td>ミリポア</td><td>LSKP09604</td><td>モンタージュプラスミド Miniprep</td></tr><tr><td>96ウェルブロック (2 mL)</td><td>GreinerBio-One</td><td>780271</td><td></td></tr><tr><td>接着プラスチックシール</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>テープパッド</td></tr><tr><td>アガロースサイズ排除クロマトグラフィーカラム</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 増加 10/300 GL</td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ DNAse</td><td>自社</td><td></td><td></td>生産</tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>コレステリル ヘミスコハク酸トリス塩</td><td>アナトレース</td><td>CH210</td><td></td></tr><tr><td>CHS コバルト金属アフィニティー樹脂</td><td>タカラバイオ</td><td>635653</td><td>TALONメタルアフィニティー樹脂</td></tr><tr><td>D(+)-ビオチン</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>851209</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン-アガロースサイズ排除クロマトグラフィーカラム</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 増加 10/300 GL</td></tr><tr><td>デジトニン</td><td>アポロ サイエンティフィック</td><td>BID3301</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス ティッシュグラインダー (40 mL)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td>cOmplete, EDTAフリープロテアーゼ阻害剤 カクテル</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fos-Choline-12</td><td>Anatrace</td><td>F308S</td><td>FS-12</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>グリコジオスゲニン</td><td>アナトレース</td><td>GDN101</td><td>GDN</td></tr><tr><td>重力フローカラム</td><td>コールパーマー</td><td>WZ-06479-25</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 中</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12338018</td><td>FreeStyle 293 中</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>アポロサイエンティフィック</td><td>BI8181</td><td></td></tr><tr><td>親水性中性シリカ UHPLC カラム</td><td>Sepax</td><td>231300-4615</td><td>Unix-C SEC-300 4.6 x 150</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>昆虫トランスフェクション試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71259</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ラウリルマルトース ネオペンチルグリコール</td><td>アナトレース</td><td>NG310</td><td>LMNG</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム 六水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>微量発現シェーカー</td><td>Glas-Col</td><td>107A DPMINC24CE</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>n-デシル-&β;-D-マルトシド</td><td>アナトレース</td><td>D322</td><td>DM</td></tr><tr><td>n-ドデシル-b-D-マルトピラノシド</td><td>アナトレース</td><td>D310</td><td>DDM</td></tr><tr><td>n-ドデシル-N,n-ジメチルアミン-N-オキシド</td><td>アナトレース</td><td>D360</td><td>LDAO</td></tr><tr><td>n-ノニル-&β;-D-グルコピラノシド</td><td>アナトレース</td><td>N324S</td><td>NG</td></tr><tr><td>n-オクチル-d17-&β;-D-グルコピラノシド</td><td>アナトレース</td><td>O311D</td><td>OGNG</td></tr><tr><td>オクタエチレングリコール モノドデシル エーテル</td><td>アナトレース</td><td>O330</td><td>C12E8</td></tr><tr><td>オクチルグルコース ネオペンチルグリコール</td><td>アナトレース</td><td>NG311</td><td>OGNG</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D8537</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン(10)ドデシルエーテル</td><td>アナトレース</td><td>AP1210</td><td>C12E10</td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン(9)ドデシルエーテル</td><td>アナトレース</td><td>APO129</td><td>C12E9</td></tr><tr><td>組織培養プレート用多孔質シール</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td>生物培養用レーヨンフィルム</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>組換え酵素ミックス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11791020</td><td>ゲートウェイ LR クローナーゼII</td></tr><tr><td>無血清昆虫培地</td><td>Gibco</td><td>10902088</td><td>SF-900 II 無血清培地</td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター 24ヘッドプローブ</td><td>ソニックス</td><td>630-0579</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター パワーユニット</td><td>ソニックス</td><td>VCX 750</td><td></td></tr><tr><td>ストレプタクチン樹脂</td><td>IBA ライフサイエンス</td><td>2-5030-025</td><td>ストレプタクチンXT 4Flow 大容量樹脂</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマAldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖モノドデカン酸</td><td>Anatrace</td><td>S350</td><td>DDS</td></tr><tr><td>懸濁液適応 HEK293 細胞</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A14527</td><td>Expi293F</td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70967</td><td>GeneJuice トランスフェクション試薬</td></tr></tbody></table>

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

溶質担体(SLC)は、イオン、栄養素、代謝物、神経伝達物質、医薬品など、さまざまな内因性および外因性の基質を輸出入する膜トランスポーターです。このタンパク質群は、魅力的な治療標的および疾患マーカーとして浮上しているにもかかわらず、現在の医薬品では比較的薬漬けにされていません。これらのトランスポーターの創薬プロジェクトは、構造的、機能的、生理学的知識が限られているために妨げられており、最終的にはこのクラスの膜包埋タンパク質の発現と精製が困難であるためです。ここでは、コドン最適化遺伝子配列を用いて、高純度のミリグラム量のヒトSLCトランスポータータンパク質を得る方法を紹介します。これらのプロトコルは、コンストラクトデザインとハイスループット発現の体系的な探索と併せて、標的タンパク質の構造的完全性と生化学的活性の維持を保証します。また、これらのタンパク質の真核細胞発現、アフィニティー精製、およびサイズ排除クロマトグラフィーにおける重要なステップについても強調しています。最終的に、このワークフローにより、高分解能構造決定、輸送研究、低分子結合アッセイ、およびハイスループットin vitro スクリーニングに適した、純粋で機能活性かつ安定したタンパク質調製が得られます。

SLC 遺伝子は、RESOLUTE pDONR プラスミドから哺乳類発現用の BacMam ベクターにクローニングできます クローニング、発現、および精製のための記載されたプロトコルは、複数のタンパク質フォールドにわたる多くのSLCトランスポーターに対して成功していることが証明されています。それにもかかわらず、この手順には、進行をモニタリングするためのいくつかのチェックポイントが含まれており、発現、タンパク質のフォールディング、脂質および界面活性剤依存性の安定性、およびバッファー条件に対する感受性の違いを説明するための最適化が可能です。
SLCクローニングおよび小規模発現時のチェックポイント クローニングステップでは、アガロースゲル電気泳動を使用して、PCRおよび消化産物の正しいサイズを確保する必要があります。同様に、ゲートウェイ反応と転位反応は、コロニーPCR反応で検証できます(図2A、B)。バキュロウイルス...

ヒト膜トランスポーターの構造的および生化学的研究には、安定で無傷の均質なタンパク質がミリグラム単位で必要です。ここでは、コドン最適化遺伝子を用いてヒト溶質キャリアトランスポーターをスクリーニング、発現、精製するためのスケーラブルな方法について説明します。

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

溶質担体(SLC)は、栄養素の取り込みに関与し、ヒトの病気に関与しています。しかし、SLCを標的とする薬剤は、研究が不十分なため、ほとんどありません。私たちは、SLCのクローニング、発現、精製のための効率的なアプローチを開発しました。当社のワークフローは、純粋なタンパク質を生成し、生化学的および構造的研究を可能にし、最終的には創薬キャンペーンに洞察を提供します。生物学的プロセス、疾患、薬物送達において多くの役割を担っているため、SLCはますます注目を集めており、魅力的な治療標的となっています。民間のReSOLUTE IMIプロジェクトは、SLCの機能、生理学、病理学、および治療標的における新しい発見を可能にするために、オープンアクセスのリソースとデータを生み出しました。従来、SLCは様々な基質と多様な輸送機構を持つ内在性膜タンパク質であるため、研究が困難でした。最近、クライオ電子顕微鏡、BacMam発現系、および新しい可溶化試薬により、その特性評価が大きく変化しました。純粋なタンパク質サンプルは、生化学的および構造的研究に必要です。ヒトでは、溶質担体は過剰に発現すると収量が悪く、精製すると不安定になることがよくあります。そのため、これまでは、各ターゲットが個々の構造を開発し、下流アプリケーション用のタンパク質サンプルを製造するのに何年もかかっていました。私たちの方法は、複数のターゲットまたは単一のターゲットの構成物の並列かつ費用対効果の高い研究に最適化されています。そのため、実験の柔軟性、コスト、時間、ラボリソースのバランスを慎重にとっています。さらに、この記事とReSOLUTEウェブポータルで、すべてのプロトコルとリソースへのオープンアクセスを提供しています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

学ぶ ヒト溶質担体（SLC）のハイスループット発現・精製法。コドン最適化クローニングとBacmid発現系を用いて高純度タンパク質を調製し、構造生物学と創薬研究の基盤となる。

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

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