実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

自己免疫性下垂体炎は、下垂体の肥大と1つ以上の下垂体ホルモンの欠乏を特徴としています。原因となる自己抗原は不明のままです。ここでは、この疾患の研究に使用するマウス下垂体タンパク質を調製するためのプロトコルが示されています。

まず、安楽死させたマウスから下垂体を単離します。次に、下垂体を均質化して細胞を機械的に破壊し、細胞質タンパク質を放出します。均質なものは低速遠心分離によって明確化され、比色、BCAアッセイによる量、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動による品質が評価されます。

最後に、水性タンパク質ホモジネートを油性アジュバントと混合します。次に、この混合物をマウスに注入して、自己免疫性下垂体炎に似たマウスモデルを作成します。コンパニオンビデオに示されているように、実験動物で下垂体炎を誘発する4つの技術が説明されています。

この記事で紹介した技術は、下垂体タンパク質ミックスインフルエンザアジュバントの注射であり、1960年代にさかのぼる最も古いものです。他のアプローチとしては、1992年に風疹ウイルス由来の可溶性糖タンパク質を注入する方法、2002年にアデノウイルスを下垂体に直接定位的に注入する方法、2010年に別のラット株の腎臓嚢の下に1系統のラット下垂体を移植する方法などがあります。フィレンツェのアジュバントアプローチの主な利点は、今日では侵襲性が低く、一貫性があり、何よりも、人間の対応物によく似た病気を誘発するのにより正確であることです。

1960年代から報告されていますが、外国のアジュバント技術は下垂体炎の誘発に対してあまり機能しませんでした。私が博士課程の研究を始めたとき、公開された外国のアジュバントプロトコルを使用して、中程度の下垂体炎のインスタンスと重症度しか得ることができませんでした。EM感情に含まれるピトゥタンパク質の量を10倍に増やすという考えがあると、物事は大幅に改善されます。

この方法は、自己免疫性下垂体炎の病因に関する洞察を得ることができますが、自己抗原が同定されていない他の自己免疫疾患の研究にも使用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、主に最後のステップであるマージンの準備に苦労します。したがって、適切なエマルジョンをどのように調製すべきかを理解するためには、視覚的なデモンストレーションが重要です。

この手法の意味するところは、自己免疫の分野を超えています。免疫のためのin抗原の調製方法を知ることは、モノクローナル抗体の産生や新しいワクチンの試験にも使用できます。このテクニックを実演するのは、私の研究室のS動物園の英雄的なウラとメイランド・アルガトです。

マウスの下垂体は、テリカと呼ばれる蝶形骨のくぼみにある頭蓋骨の基部にある円筒形の腺です。腺は、三叉神経によって横方向に、視神経交叉によって前方に隣接しています。これは、より大きな前葉と、より小さな中葉および後葉で構成されています。

下垂体を分離するには、はさみを使用して安楽死させたマウスの首を切り落とし、頭蓋骨の後ろから前まで平行に切り込みを入れます。脳を持ち上げて後方に反転させると、二等辺三角形のコンテキストで円柱のように見える下垂体が露出します。下垂体を基部として、三叉神経を側面として、視交叉を頂点として持つ。

閉じた鉗子の先端で腺を一周して、周囲の髄膜を壊します。次に、細い鉗子を使用して、トゥルカの細胞から下垂体をつかみ、ドライアイスの上のプラスチックチューブに入れます。1つの準備のために、300マウスの下垂体を集めてください。

このコレクションには約9人時間かかります。コレクションが完了したら、下垂体が必要になるまで摂氏マイナス80度で保管します。15ミリリットルのファルコンチューブを氷浴に入れます。

チューブに250マイクロリットルの均質化緩衝液を加えます。均質化の直前に収集された100個の下垂体ごとに、マウスの下垂体をバッファーに加えます。次に、マウスの下垂体を含むファルコンチューブの底に直径5mmのジェネレーターであるポリトロンホモジナイザーの先端を置き、最高速度で30秒間バッファーホモジナイズします。

チューブを氷の上に保ちながら、チューブをゆっくりと上下に動かします。次に、ホモジネートを氷の上に1分間置きます。均質化と冷却の手順をさらに2回繰り返します。

この穏やかな均質化は、核を壊すことなく細胞を破壊し、タンパク質を放出するはずです 遠心分離機。ホモジネートを低速で、摂氏4度で10分間約1000Gの沈殿物、核、未破壊組織、結合組織や変性タンパク質複合体などの不溶性物質とする。ペレットを乱さないように注意してください。

現在、ポスト核酸またはPNSと呼ばれているSNAを新しいFalconチューブストアに移します。氷上のPNSは、以前と同じ量の均質化バッファーを使用してペレットを収縮させ、均質化および遠心分離します。2つのPNSサンプルをプールした後、溶液を多数のマイクロ遠心チューブに雄弁

マイクロ遠心分離管は、必要になるまで摂氏マイナス80度で保管してください。このタンパク質調製物は摂氏マイナス80度で安定ですが、徐々に効力が失われます。したがって、準備から6か月以内に使用することをお勧めします。

PNSの1つの小さなアリコートを保持して、biy酸アッセイによるタンパク質の収量と濃度を決定します。次に、平均総重量約570ミリグラムの300個のマウス下垂体からのゲル電気泳動によりタンパク質の品質を決定します。下垂体タンパク質は60ミリグラム、または組織10ミリグラムごとに1ミリグラムのタンパク質の収量が期待されます。

タンパク質濃度は通常、ミリリットルあたり約40ミリグラムです。ここで示す例は、10匹のマウスを免疫するためのものです。ここでの調製中に材料損失のための2つの余分なマウスを可能にする、下垂体タンパク質の1ミリグラムを含むエマルジョンの100マイクロリットルを各マウスに注射する計画は、タンパク質エマルジョンの12ミリグラムが調製されます。

まず、冷凍タンパク質アリコートを手のひらで温めて急速に解凍します。PBSでタンパク質濃度を20ミリグラム/ミリリットルに調整します。次に、12ミリグラムに対応する下垂体タンパク質抽出物の600マイクロリットルを2.5ミリリットルのガスタイトハミルトンシリンジに再懸濁し、完全なFRONSアジュバントまたは5ミリグラム/ミリリットルの熱を含むCFAに引き込み、手動で振とうして結核菌を殺しました。

次に、600マイクロリットルのCFAを別の2.5ミリリットルのハミルトン注射器に引き込みます。22ゲージのマイクロ乳化針をCFAで満たされたシリンジに取り付けて固定します。針がCFAで満たされるようにプランジャーをゆっくりと押します。

次に、針のもう一方の端を下垂体タンパク質抽出物で満たされたもう一方のシリンジに取り付けて固定します。シリンジ内に気泡を閉じ込めないでください。CFAシリンジのプランジャーをゆっくりと進めて、油成分を下垂体水抽出物に押し込み、少量のみが混合

次に、下垂体抽出物シリンジのプランジャーをCFAシリンジに押し戻します。この操作を繰り返して、全体の内容が混合されるまで、混合される材料の量を徐々に増やします。この白っぽく均一に分布した材料は、水と油のエマルジョンを表しています。

エマルジョンが形成されたら、最終サイクルの少なくとも500回後に完全な前後サイクルを繰り返すと、シリンジには1対1の水と油のエマルジョンが含まれ、下垂体タンパク質濃度は1ミリグラム/ミリリットルになりました。エマルジョンは、水のビーカーに一滴垂らしてエマルジョンの品質をテストするために使用する準備ができています。エマルジョンが正しく調製されていれば、液滴は表面にコンパクトでタイトなままです。

エマルジョンの品質が悪いと、エマルジョンは広がり、小さな液滴に分裂します。エマルジョンは、その調製の同じ日にSJLマウスに注射され、実験的自己免疫性下垂体炎を誘発します。このプロトコルは、付属の jo of vertical で詳しく説明されています。

ピット腺が採取され、技術が習得されると、1時間でタンパク質の指導を行うことができます。このステップでは、浸漬の準備中に、約1時間かかります。開発後の初期混合段階でゆっくりと忍耐強く作業することを忘れないでください。

この技術は、自己免疫の分野の研究者が、自己反応性リンパ球が標的臓器を認識して浸潤するメカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見た後、マウスの下垂体からタンパク質抽出物を調製する方法と、それをクローン病のajuものと混合して免疫原として使用する準備ができているエマルジョンを調製する方法についてよく理解しているはずです。注射器や、不活化微生物や乾燥した微生物結核を含む完全なインフルエンザエッジの注射器を使用すると、誤ってパンク

したがって、この手順を実行するときは、常にGライトを使用し、針を適切に廃棄してください。