Name: 実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶマウス下垂体タンパク質調製法。マウスから下垂体を摘出し、ホモジナイズして遠心分離し、BCAアッセイとポリアクリルアミドゲル電気泳動で質と量を評価します。実験的自己免疫性下垂体炎の研究に応用可能です。

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実験的なプロトコルこの実験的なプロトコルの最初のステップは、マウスの下垂体腺の大きい数を集めることです。第二段階は、タンパク質の抽出液を調製するために腺を均質化するためです。第三段階は、油性混合物で、これらのタンパク質を乳化することです。 ステップ1：マウスの​​下垂体腺の収集と保管マウス下垂体は視交叉によって三叉神経と前方で横方向に囲まれたトルコ鞍と呼ばれる蝶形骨、のうつ病における頭蓋底に位置しています。腺が大きく前葉と小さな後、中間葉で構成され、平均1.9ミリグラムの重されている。下垂体は、動物のケア施設で安楽死される運命、混合系統、性別、および年齢のマウスから収集されます。 下垂体を単離するために、マウスは、解剖頭蓋骨上記の皮膚を安楽死させ、頭蓋骨の骨は、はさみで開いてカットされます。脳は、その後、周囲の硬膜から分離された下垂体を、公開する持ち上げたちょう形骨の外スクープとドライアイス上にプラスチック製のチューブに格納されています。 一般的に我々は一つのタンパク質の準備、9時間で一人で収集することができる数は300、マウス下垂体腺を使用してください。 収集が完了すると、下垂体腺を含むチューブを-80℃で保存された·次のステップの準備ができるまでのC。 ステップ2。マウス下垂体タンパク質の抽出<ol><li> 15 mlのファルコンチューブ（カタログ番号352059）に均質化緩衝液を追加すると、収集された100下垂体のためにバッファを250μlを用いて、氷浴中で保管。細胞の細胞質（0.2 M）の内側と生理的pH（7.4）の生理的に存在しているものと同様のイオン強度のバッファーを使用してください。我々は、リン酸塩を使用して緩衝生理食塩水（0.161 M、pH7.4）に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma - Aldrich社、カタログ番号P8340 - 1mLの）で補足。 </li><li>ちょうど均質化する前にバッファに下垂体腺を追加し、その後、ファルコンチューブの一番下にポリトロンホモジナイザーの発電機（5 mmの直径）を置きます。氷浴中でそれを保ちながら優しく上下ファルコンチューブを移動させる、30秒間、最大rpmでホモジナイズする。その後、1分間氷上でホモジネートを置きます。均質化と冷却のステップをさらに2回繰り返します。この穏やかな均質化は、細胞を破壊し、核を中断することなく、細胞質タンパク質を解放する必要があります。 </li><li>核、切れ目のない組織と不溶性の物質を（そのような結合組織や変性タンパク質の複合体として）を削除するには、4℃で10分間、低速（千グラム）でホモジネートを遠心</li><li> 、新たなファルコンチューブに（今PNS、ポスト核上清と呼ばれる）上清を移すペレットはそのままにするように注意して、氷上でPNSを保存する。 </li><li>均質化緩衝液の元のボリューム（収集された100下垂体のためのバッファを250μL）でペレットを再懸濁し、上記のように均質化する、最初のもので2 PNSを結合して上記のように遠心分離、および。 </li><li> -80℃で遠心チューブとストアへのアリコートをプールされたうちの2つのPNSサンプル° Cの次のステップの準備ができるまで。このタンパク質調製物を-80℃で保存できますCが徐々にその効力を失いますので、準備から6ヶ月以内にそれを使用することをお勧めします。ゲル電気泳動によってBCAアッセイ（Pierceのカタログがない。23225）、及びタンパク質の品質によってタンパク質の収量と濃度を決定するために小型のアリコートを使用してください。一般的に、我々は、40 mg / mLの周りの濃度で、均質化緩衝液を1.5mLで300マウスの下垂体からのタンパク質の約60 mgを得た。 </li></ol>ステップ3。予防接種のためのエマルションの調製<ol><li>急速に実験に必要な冷凍タンパク質のアリコートを解凍し、20 mg / mLのためにタンパク質の濃度を調整する。このタンパク質抽出物は、結核菌を（Becton Dickinson社、231141）殺された熱の5mg / mLを含む完全フロイントアジュバント（CFA、シグマF - 5881）と1:1で乳化されます。各マウスは、乳剤の100μLの下垂体抽出物1mgを受け取ります。 </li><li>ここに示した例では、各マウスは下垂体タンパク質1mgを含有するエマルジョンを100μLを注入される10匹のマウスを、免疫するためです。準備中のマテリアルロスの2つの余分なマウスを許可するため、下垂体タンパク質の12 mgを使用してください。 20 mg / mlの下垂体タンパク質の抽出物のアスパイア600μLを2.5 mLのハミルトン気密注射器を使用して上記の説明。振とうしてCFAを再懸濁し、そして別の2.5mLのハミルトンシリンジにCFA 600μLを目指します。 CFAで満たされたシリンジに22ゲージのマイクロ乳化針を取り付け、固定します。ゆっくりと針がCFAで満たされているようなCFAの注射器のプランジャーを押し、その後のもう一方の端を接続し、確保する下垂体抽出液で満たされた注射器の針。 </li><li>徐々にのみ少量混合されていることなどacqueous下垂体抽出物、中に油成分をプッシュするCFAの注射器のプランジャーを進めます。その後、CFAの注射器に下垂体抽出物の注射器のプランジャーを押し戻す。徐々に混合材料の量を増加させるこの操作を繰り返します。 2つのシリンジの内容全体が混合されるまで続けます。あなたは、油中水滴型エマルションを表す白っぽいし、均等に分散されたソリューションが得られます。 </li><li>エマルジョンが形成されると、エマルジョンが十分に混合されるように、少なくとも500回の往復運動を繰り返す。最終的なミキシングサイクルの後、1:1油中水型エマルジョンを使用する準備ができましたし、10 mg / mLの下垂体タンパク質濃度が含まれています。エマルジョンは、コンパニオンのjoveの記事で詳しく説明、皮下麻酔SJLマウスに同じ日に注入される。 </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

自己免疫性下垂体炎による最初の患者は1962年4に報告されているにもかかわらず、病原体抗原5をまだ明らかにされないままである。動物モデルは、患者のケアに翻訳可能なバイオマーカーの発見を助ける、これらの自己抗原を識別するために非常に便利です。この記事では、実験動物における自己免疫性下垂体炎を誘発するための適切な形式で下垂体タンパク質を調製するための簡単​​な手順を実証してきました。

<table><tbody><tr><td>15-ml Falconチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイズ緩衝液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytronホモジナイザー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCAアッセイ</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Complete Freund&amp;rsquo;s Adjuvant (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL Hamiltonガスタイトシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22ゲージマイクロエマルジョン針</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

自己免疫性下垂体炎は自己免疫1によって引き起こされるかを伴う下垂体の慢性炎症です。それは伝統的に稀な疾患と考えられてきたが、レポートでは、近年著しく増加している。下垂体炎は、実際には、そのようなCTLA - 4 2とPD - 1受容体としてTリンパ球上に発現する抑制性受容体をブロックする抗体を、治療を受けたがん患者の&quot;副作用&quot;として、稀にではない開発しています。自己免疫性下垂体炎はアジュバント3と混合下垂体タンパク質をマウスに注射することによって実験的に誘導することができる。このビデオの記事では、マウスの下垂体腺と方法SJLマウスにおける自己免疫性下垂体炎を誘発するのに適した形でそれらを準備してからタンパク質を抽出する方法を示します。

自己免疫性下垂体炎は、マウス下垂体タンパク質の抽出物を注入することにより、マウスで再現することができる。

自己免疫性下垂体炎は、自己免疫によって引き起こされるか、あるいは自己免疫を伴う下垂体腺の慢性炎症である1。これは従来、...

自己免疫性下垂体炎は、下垂体の腫大と1つまたは複数の下垂体ホルモンの欠乏を特徴とします。原因となる自己抗原は依然として不明です。ここでは、この疾患の研究に使用するためのマウス下垂体タンパク質を調製するプロトコルを紹介します。まず、安楽死させたマウスから下垂体を単離します。次に、下垂体をホモジナイズして細胞を機械的に破壊し、細胞質タンパク質を放出させます。ホモジネートを低速遠心分離で清澄化し、BCA法による比色定量法で量を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で質を評価します。最後に、水溶性のタンパク質ホモジネートをオイルアジュバントと混合します。この混合液をマウスに注射し、自己免疫性下垂体炎に類似したマウスモデルを作製します。付随するビデオに示されているように、実験動物に下垂体炎を誘発させるための4つの手法が報告されています。本記事で紹介する下垂体タンパク質混合物とインフルエンザアジュバントを注入する手法は、1960年代まで遡る最も古い手法です。その他のアプローチとしては、1992年のルベラウイルス由来の可溶性糖タンパク質の注入、2002年の下垂体へのアデノウイルスの直接定位注入、そして2010年のあるラット系統の下垂体を別のラット系統の腎被膜下に移植する方法があります。フロレンスのアジュバント法による主な利点は、現代において侵襲性が低く、再現性が高く、そして何よりも、ヒトの疾患に極めて近い疾患を誘導する精度が高いことです。1960年代から報告されているものの、下垂体炎を誘導するための異種アジュバント法は十分な成果を上げていませんでした。私が博士課程の研究を始めた際、既報の異種アジュバントプロトコルを用いては、下垂体炎の発症率および重症度は限定的なものでした。しかし、エマルションに含まれる下垂体タンパク質の量を10倍に増やすという着想を得たことで、状況は大幅に改善されました。この手法は自己免疫性下垂体炎の病態生理に関する知見を提供しますが、自己抗原が未同定である他の自己免疫性疾患の研究にも応用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、手技的なスキル、時間、そして集中力が必要となる最後のステップであるマージンの調製に最も苦労します。したがって、適切なエマルションをどのように調製すべきかを理解するためには、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。この手法の意義は、自己免疫の分野に留まりません。免疫のための抗原調製法を習得することは、モノクローナル抗体の作製や新しいワクチンの試験にも応用可能です。本手法の実演は、私の研究室のS Zoo heroic UraおよびMayland al gatoが行います。マウスの下垂体は円筒形の腺であり、頭蓋底にある蝶形骨の陥凹（トルシカ）に位置しています。この腺は、外側を三叉神経に、前方を視神経交叉に囲まれています。下垂体は、より大きな前葉と、より小さな中葉および後葉で構成されています。下垂体を単離するには、はさみを用いて安楽死させたマウスの頸部を切断し、頭蓋骨の後方から前方に向かって平行に切開します。脳を持ち上げて後方に反転させ、下垂体を露出させます。下垂体は、下垂体自体を底辺、三叉神経を両辺、視神経交叉を頂点とする二等辺三角形のような形状の中に、円柱状に現れます。閉じたピンセットの先端で腺の周囲を円状に囲むようにし、周囲の髄膜を破ります。次に、微細ピンセットを用いて下垂体をトルコ鞍から取り出し、ドライアイス上のプラスチックチューブに入れます。1回の調製につき、マウス下垂体を300個回収してください。この採取作業には約9人時を要します。採取完了後、下垂体は使用時まで-80°Cで保存してください。15 mLのFalconチューブを氷浴に置きます。チューブに250 µLのホモジナイズ緩衝液を加えます。ホモジナイズ直前に回収した下垂体100個につき、マウス下垂体を緩衝液に加えます。次に、マウス下垂体と緩衝液が入ったFalconチューブの底に、直径5 mmのジェネレーターを備えたポリトロンホモジナイザーのチップを設置し、最大速度で30秒間ホモジナイズします。チューブを氷上に置いたまま、ゆっくりと上下に動かします。その後、ホモジネートを氷上で1分間静置します。ホモジナイズと冷却の工程をさらに2回繰り返します。この緩やかなホモジナイズにより、核を破壊することなく細胞を破砕し、タンパク質を放出させます。ホモジナイズした液を、4 °Cで約1000 Gの低速で10分間遠心分離し、核、未破砕組織、および結合組織や変性タンパク質複合体などの不溶性物質を沈殿させます。その際、ペレットを乱さないように注意してください。現在、核後上清（PNS）と呼ばれる上清を、新しいFalconチューブに移して保存します。氷上のPNSにおいて、前回と同量のホモゲナイズ緩衝液を用いてペレットを再懸濁し、前回と同様にホモゲナイズおよび遠心分離を行います。2つのPNSサンプルを合わせた後、溶液を複数のマイクロ遠心チューブに分注します。マイクロ遠心チューブは、使用時まで-80°Cで保存してください。このタンパク質調製物は-80°Cで安定していますが、徐々に活性が低下します。そのため、調製から6か月以内に使用することが推奨されます。PNSの少量を分注して保存し、ビウレット法によってタンパク質の収量および濃度を決定します。次に、平均総重量約570 mgであるマウス下垂体300個から得られた試料を用い、ゲル電気泳動によってタンパク質の品質を決定します。下垂体タンパク質の収量は60 mg、あるいは組織10 mgあたり1 mgのタンパク質となることが予想されます。タンパク質濃度は通常、1 mLあたり約40 mgです。ここではマウス10匹を免疫する場合の例を示します。各マウスに、1 mgの下垂体タンパク質を含むエマルション100 µLを注射することを計画し、調製中のロス分としてマウス2匹分を追加し、計12 mgのタンパク質エマルションを調製します。まず、凍結したタンパク質分注液を手で温めて迅速に融解させます。PBSを用いて、タンパク質濃度を20 mg/mLに調整します。次に、12 mgに相当する600 µLの下垂体タンパク質抽出液を2.5 mLのGas Tite Hamiltonシリンジに吸引し、5 mg/mLの加熱死滅させたmycobacterium tuberculosisを含む完全フロイントアジュバント（CFA）を加えて、手で振って再懸濁させます。次に、600 µLのCFAを別の2.5 mLハミルトンシリンジに吸い取ります。CFAを満たしたシリンジに22ゲージのマイクロ乳化針を取り付け、固定します。プランジャーをゆっくりと押し、針の中をCFAで満たします。次に、針のもう一方の端を、下垂体タンパク質抽出液を満たしたもう一方のシリンジに取り付け、固定します。シリンジ内に気泡が入らないように注意してください。CFAシリンジのプランジャーをゆっくりと押し、油性成分を下垂体抽出液（水性）に注入し、少量だけが混合されるようにします。次に、下垂体抽出液用シリンジのプランジャーを押し込み、CFAシリンジ内へ注入します。全量が混合されるまで、この操作を繰り返して徐々に混合量を増やしてください。この白く均一に分散した物質が、水と油のエマルションとなります。エマルションが形成されたら、往復サイクルを少なくとも500回繰り返します。最終サイクル後、シリンジ内には水とオイルが1:1の割合で混ざったエマルションが保持され、下垂体タンパク質濃度は10 mg/mLとなります。これでエマルションの使用準備が整いました。エマルションの品質を確認するには、水を満たしたビーカーにエマルションを1滴落としてください。正しく調製されていれば、滴は表面で凝集したまま密な状態を維持します。エマルションの品質が低い場合、広がり、より小さな液滴に分裂します。このエマルションを調製当日にSJLマウスに注射し、実験的自己免疫性下垂体炎を誘導します。このプロトコルの詳細は、付随するJoVEビデオに記載されています。下垂体を集め、手技に習熟すれば、迅速に氷上で作業することを忘れずに、1時間でタンパク質抽出を行うことができます。このステップの浸漬調製には、約1時間を要します。初期の混合段階では、ゆっくりと忍耐強く作業することを心掛けてください。この手法は、自己反応性リンパ球が標的器官を認識し浸潤するメカニズムを解明しようとする自己免疫分野の研究者に道を開きました。このビデオを視聴することで、マウス下垂体からタンパク質抽出液を調製する方法と、それをComplete Freund's adjuvant（完全フロイントアジュバント）と混合して免疫原として使用可能なエマルションを調製する方法を十分に理解できるはずです。注射器および不活化乾燥結核菌を含むComplete Freund's adjuvantを取り扱う際は、誤って針を刺すと危険であることに十分注意してください。したがって、この手順を実施する際は、常にグローブを着用し、針を適切に廃棄してください。

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