のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

この手順の全体的な目標は、2次元ゲル分析を使用して、複製がDNA損傷に遭遇したときに発生するDNA構造中間体を視覚化することです。これは、まず、複製阻害病変が誘導された活発に分裂している細胞からDNAを単離することによって達成されます。次に、ゲル電気泳動を使用して、サイズに基づいて回収されたDNAを分離します。

次に、レーンを切り取り、サイズと形状の両方に基づいてDNAをさらに分離する第2のゲルで水平にリキャストします。最後に、サザン解析を使用して、UV誘起損傷の導入前および導入後のさまざまな時点でDNA断片の複製に関連するDNA構造を視覚化します。最終的に、この手順を使用して、特定の変異体でDNA損傷を処理できないことがDNA修復中間体の蓄積をもたらすことを示すことができます。

こんにちは、私の名前はアーサー・イアンです。私はポートランド州立大学のコレラ研究室の出身です。こんにちは、私の名前はブランド彼女です、私もコレララボから来ました。

今日は、2次元ゲル電気泳動の手順をお見せします。当研究室では、この手順を用いてDNA複製や修復中間体を研究しています。それでは始めましょう。

この手順を開始するには、プラスミドPBR 3 22を含む大腸菌の200マイクロリットルの一晩培養物をDGC大腿部培地でアンピシリンを摂氏37度で培養します。DGC太もも培地を使用することで、UV遮蔽が最小限に抑えられます。一晩インキュベーションした後、細胞を14, 000 RRP Mで30秒間ペレット

次に、アンピシリンを欠く200マイクロリットルのDG C培地に細胞ペレットを再懸濁し、接種します。20ミリリットルのDG C大腿部培地は、アンピシリン選択なしで培養物を増殖させます。摂氏37度からOD 600までの0.5の振とうインキュベーターでは、これは約5倍に相当します 10 から 8番目の細胞 アンピシリンを使用しない1ミリリットルの成長は、一部の変異体で生じる可能性のある異常または非生産的な複製中間体に対する選択を回避します。

また、紫外線を用いてダメージを与える場合、アンピシリンはこれらの波長で強く吸収し、遮蔽するため、媒体からアンピシリンを除去する必要があります。細胞が成長している間、細胞はUVの有効線量を減らします。UVC光度計を使用して、15ワットの殺菌ランプからの距離を決定します。このランプは、1メートルあたり1JUULの平方を1秒あたり約1JUULの露光率で

その後のステップは、UV照射後のフォトリアーゼによるシクロブタンペリンダイマーの光再活性化反転を防ぐため、黄色光の下で実行する必要があります。所望の細胞密度に達したら、ピペットを使用して、回転プラットフォーム上の直径15cmのシャーレに培養物を移し、細胞集団全体に均一に照射します。次に、1メートルあたり50ジュールの正方形で培養物を照射し、すぐに滅菌予熱フラスコに移し、摂氏37度の振とうのあるインキュベーターに戻します。

実験期間中、この用量では、検査する各時点について、一本鎖DNAの4.5キロベースごとに、平均して1つのシクロブタンペリンダイマーが生成されます。0.75ミリリットルの文化のアリコートを0.75ミリリットルの氷冷ネット30にピペットで移します。バッファネット30は、複製およびヌクレオチド除去修復が進行するのを防ぐストップバッファとして機能する。

ストップバッファーを追加すると、サンプルはタイムコースが終了するまで氷上に保持できます。経時経過後、各サンプルをペレット化し、ペレットを再懸濁します。150マイクロリットルの溶解緩衝液中で、攪拌せずに37°Cで細胞を20分間溶解します。

一本鎖領域または分岐点を持つ複製構造はせん断の影響を受けやすいため、カミソリの刃でピペットの先端を切断して口を広げ、せん断力を最小限に抑えます。一般に、ピペッティングと攪拌は、DNAが制限酵素で消化されるまで最小限に抑え、溶解後、プロテイナーゼKとサルカス細胞を添加し、インキュベーションを1時間継続させる必要があります。これにより、タンパク質に関連するDNA断片が放出されます。

活性複製DNAはタンパク質または膜複合体に結合することが多いため、複製フラグメントの収量を増やすのに役立ちます。1時間後、各サンプルに2容量のフェノールを加え、チューブを5分間静かに反転させてサンプルを抽出します。次に、2容量のクロロホルム、イソアミル、アルコールを加え、チューブをさらに5分間静かに反転させます。

次に、マイクロ遠心分離機で14, 000 RPMでサンプルを5分間遠心分離し、各サンプルの上部水相を新しいチューブに移します。次に、4容量のクロロホルムISOアルコールを加え、再びチューブを5分間静かに反転させます。サンプルを 14, 000 RPM で 5 分間再度遠心分離します。

ビーカーに250ミリリットルの0.1xteの上に透析膜を置き、各サンプルの100マイクロリットルを膜にスポットします。透析後1時間、サンプルを透析します。各サンプルの80マイクロリットルを、20マイクロリットルの酵素ミックスが入った新鮮な1.5ミリリットルのチューブに入れます。

サンプルを摂氏37度で一晩分解します。PV 2は、複製の起点からすぐ下流のプラスミドを線形化します。アグロスゲルをロードする前に、100マイクロリットルのクロロホルムと20マイクロリットルのブロモを含む6×ローディング色素を追加します。

フェノールブルーとキシレンシアンを各サンプルに添加し、クロロホルムを混合すると、DNA末端に結合した残りのPV2が剥がれ落ちます。2次元のarosゲル分析を開始するには、制限されたDNAサンプルを最初の次元に通します。まず、ラムダハインド3サイズマーカーを、1つのXTBEで事前に調製した0.4%agrosゲルの最初のレーンにロードします。

次に、各サンプルにローディング色素を含む水相を40マイクロリットルロードし、レーンをスキップしてゲルスライスを容易にします。電気泳動後、最初の次元を1ボルト/センチメートルで約12〜15時間実行します。低電圧で低パーセントのAGROSゲルは、主にサイズに基づいてDNA断片を分離する役割を果たします。

最初の次元が実行された後、大きな肉屋のナイフを使用して、ラムダの後部3マーカーを含む最初のレーンを切り取り、臭化アテリウムで染色します。2 番目の次元では、Lambda Hind 3 マーカーをガイドクロップとして使用して、大型の肉屋ナイフを使用してゲルレーンをスライスし、各レーンで線形化されたプラスミドが走ると予想される領域を下の領域を破棄します。2 番目の次元をキャストするには、空のゲルキャスターの上部に各スライスを水平に配置します。

1つのXTBEに1%AROSの溶液を調製し、摂氏55度に冷却します。冷めたら、ゲル溶液を注いで2次元をキャストし、ゲルスライスを完全に覆うようにします。ジェルを注ぐ前に、スライスが均等に向き合っていることとキャスターのレベルであることを確認することが重要です。

ゲルが固まったら、2次元を電気泳動ユニットで6.5vols/センチメートルで5時間半から7時間実行し、バッファーが高電圧を再循環させ、高パーセントのAgrosゲルがDNA断片の形状とサイズに基づいて効果的に分離します。非線形形状は、電気泳動後、2次元をよりゆっくりと進行します。ゲルを水で一度すすぎ、次に400ミリリットルの0.25モル塩酸で15分間穏やかに攪拌しながら2回洗浄します。

酸洗浄は、DNA分子を部分的に小さな断片に切り込み、南方分析中により効率的に移動し、DNA複製中間体のサイズが大きく、形状が珍しいために必要です。アルカリ転写用のゲルを調製するには、ゲルを水で再度すすぎ、次いで400ミリリットルの0.4モル水酸化ナトリウムで30分間2回洗浄する。次いで、ゲル中のDNAを、この手順の書面部分に記載されているように、0.4モルの水酸化ナトリウムを用いた下向きのアルカリ転写システムを使用して、高結合のnプラスナイロン膜に転写し、DNA転写後6〜12時間、DNA転写を、書面のプロトコルに概説されているようにプローブハイブリダイゼーションを継続させる。

メンブレンをプローブして洗浄したら、液体が目に見えて消えるまでメンブレンをペーパータオルの上に置きます。次に、メンブレンをポリ塩化ビニルプラスチックラップで包み、リン酸化イメージャースクリーンにさらします。最後に、放射能は、ストームエイト40とそれに関連する画像定量を使用して視覚化および定量化できます。

2D aros gel analysisによって観察されたPV 2消化PBR 3 22プラスミドの遊走パターンを図示します。非複製線形プラスミドは、線形4.4 KBフラグメント複製プラスミドとして実行され、Y字型構造を形成し、サイズが大きく非線形形状であるため、非複製フラグメントよりも移動が遅くなります。この移動パターンは、UV照射後に線形領域からウェルに向かって伸びる円弧を形成します。

二重Y形またはX形の分子は、円錐領域で観察され、Y形の分子の弧よりもゆっくりと移動します。P32標識PBR322でプローブした2Dゲルの南方解析の一例を、UV照射直後およびUV照射直後のUV照射直後の細胞について示している。全血漿DNAの約1%は、放射線照射後の指数関数的段階で細胞が急速に成長しているYアークに存在します。

YS形状の分子の一時的な増加は、ブロックされた複製フォークが損傷した部位に蓄積するにつれて観察されます。L字型の複製中間体も一過性に蓄積し、病変が修復される時期と相関する時間まで持続します。今回は、2次元ゲル電気泳動を使用してDNA修復中間体を可視化する方法を紹介しました。

この手順を実行するときは、歩留まりを低下させる可能性のあるせん断力に注意し、すべてのサンプルとゲルに優しくすることが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。