サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中 E。大腸菌蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

この実験の全体的な目標は、DNA修復経路を研究する目的で、核タンパク質ブロックで複製フォークを停止させ、ブロックの部位でDNA構造を観察することです。この方法は、細胞の複製装置がタンパク質の障害に遭遇したときにDNAがどのように処理されるかなど、DNAの複製と修復に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞の全集団の染色体上の特定の位置で複製フォークを可逆的に停止できることです。

この手順を実演するのは、私の研究室のメンバーであるKarla Mettrick博士と大学院生のGeorgia Weaver、Tayla-Ann Corocherです。この手順には、pKM1プラスミドにテトラサイクリンオペレーターアレイを保有する大腸菌株を使用します。pKM1は、誘導性黄色蛍光タンパク質タグ付きテトラサイクリン抑制タンパク質であるTetR-YFPをコードします。

この大腸菌株の新鮮な一晩培養物を、選択に必要な抗生物質を含む希薄な複合培地で0.01の600ナノメートルの光学密度に希釈します。30°Cで培養物を600ナノメートルの光学濃度0.05〜0.1まで振とうしながら培養します。10ミリリットルのサンプルを取り出して、非誘導コントロールとして使用します。

残りの培養物に0.01%アラビノースを添加して、pKM1からTetR-YFPの産生を誘導します。無誘導培養物と誘導培養物の両方を摂氏30度で振とうしながら成長させ続けます。1時間後、蛍光顕微鏡を使用して、誘導された培養の各細胞内に単一の焦点が存在することを確認します。

誘導された細胞がブロックされていることが確認された場合、70%以上の細胞が単一焦点を有することが示され、光学密度を記録し、2次元ゲル電気泳動による分析のためにサンプルの7.5ミリリットルを除去します。非誘導対照培養物から同等のサンプルを取り出します。蛍光顕微鏡検査の前に、可視化中の細胞の動きを防ぐためのアガロースパッドを準備します。

各アガロースパッドについて、500マイクロリットルの溶融アガロースを顕微鏡スライドにピペットで移動し、アガロースが固まる直前にカバーガラスを覆います。必要になるまで、湿ったティッシュの間にスライドを摂氏4度で保管します。細胞をチェックするときは、アガロースパッドからカバースリップをはがし、10マイクロリットルの細菌培養物をパッドの中央にピペットで移します。

約5分後、アガロースパッドが乾いたら、カバースリップを交換します。カバーガラスに液浸油を一滴垂らし、スライドを光学部品の下に置きます。位相顕微鏡を100倍の倍率で細胞を可視化します。

イメージングソフトウェアの[取得]ダイアログボックスで、[露光時間]を100ミリ秒に設定します。[取得] を選択して画像をキャプチャします。ステージを動かさないでください。

[集録]ダイアログボックスで、カメラに連動している外部シャッターの照明としてYFPを選びます。「Exposure Time」を 1, 000 ミリ秒に設定します。ステージライトをオフにし、「取得」を選択して蛍光画像をキャプチャします。

この手順を開始するには、以前に採取した培養サンプルにアジ化ナトリウムを最終濃度0.1%まで加え、氷上で少なくとも5分間インキュベートします。細胞を5, 000倍gで10分間遠心分離します。上清を捨てます。

各細胞ペレットを200マイクロリットルのPIVバッファーに再懸濁し、細胞をマイクロチューブに移します。微量遠心分離機で細胞をペレット化し、上清を廃棄します。顕微鏡スライドを40マイクロリットルの適切なガラス撥水剤またはシリコーン溶液で処理します。

スライドが乾くまでティッシュでこすります。細胞密度が最も低い細胞を50マイクロリットルのPIVに再懸濁し、摂氏50度でヒートブロックに置きます。他のすべてのサンプルについては、PIVの容量を調整して、各チューブの最終的な細胞密度が同じになるようにします。

新たに調製した0.8%アガロース溶液をPIV溶液に等量加えます。固化を防ぐために、サンプルをヒートブロックに保持して、摂氏50度以上になるようにします。処理されたスライド上に20マイクロリットルの細胞アガロース懸濁液を滴下して、半球状のプラグを作製します。

プラグが固まったら、1つのサンプルからすべてのプラグを1本のマイクロチューブにゆっくりとスライドさせ、1ミリリットルの細胞溶解バッファーを追加します。摂氏37度で2時間インキュベートします。2時間後、細胞溶解バッファーを取り出し、1ミリリットルのEDTA-Sarkosyl-Proteinase KまたはESP溶液を加えます。

摂氏50度で一晩またはプラグが透明になるまでインキュベートします。プラグが透明になったら、ESPバッファーを取り外し、プラグを15ミリリットルのチューブに移します。12ミリリットルのTEバッファーを追加し、30分間放置します。

プラグをTEバッファで合計5回洗浄します。プラグは、1ミリリットルのTEバッファに摂氏4度で保管します。複製中間体を解析するために、アガロースプラグ内のDNAを、目的領域に適した制限酵素で消化します。

この例では、EcoRVはアレイの直前、アレイ内、およびアレイの後でDNAを切断し、関心領域に5.5 kbと6.7 kbのフラグメントを生成します。この手順を開始するには、アガロースプラグを新しいマイクロチューブに移し、150マイクロリットルの制限酵素バッファーを追加します。25〜100単位の制限酵素を加え、摂氏37度で6〜8時間消化します。

0.4%アガロースゲルを摂氏4度で調製します。300ミリリットルの溶融アガロースを約25×25cmのゲルトレイに注ぎます。コームを挿入して、ウェルの幅をプラグの直径とほぼ同じにします。

ゲルがセットされたら、コームを取り外し、ゲルを室温に移します。接種ループを使用して、消化されたアガロースプラグの1つをウェルにスライドさせ、プラグの平らな面をDNAがゲルに入るウェルの側面に当てます。同じ方法で1つのプラグを2本ごとにウェルに挿入します。

0.4%アガロースを溶かしたウェルにピペットで入れ、プラグを所定の位置にシールします。1 kbのDNAラダーを空のウェルにロードし、ラダーとサンプルの間に隙間を空けます。ゲルを室温で1xTBEで一晩泳ぎます。

翌日、臭化エチジウム1ミリリットルあたり0.3マイクログラムを含む水浴でゲルを20分間染色します。長波UVトランスイルミネーターでDNAを可視化し、各レーンフラグメントをストレートイーブンカットで切り取り、レーンの両側に過剰なアガロースが含まれるのを最小限に抑えます。切除したゲルレーンをDNA移動方向に対して90度のゲルトレイに置きます。

次のステップは、2次元ゲル用に300ミリリットルのアガロースを調製することです。アガロースが摂氏50度に冷却されたら、溶融したアガロースをゲルスライスの周りにピペットで移動して、ゲルスライスの位置を固めます。残りのアガロースをトレイに、少なくともゲルスライスと同じ高さの深さまで注ぎます。

ゲルが固まったら、DNAが約10センチメートル移動するまで、4°Cのエチジウムブロマイド1ミリリットルあたり0.3μgを含む1xTBEで電気泳動します。ゲノムDNAが存在するブロックを、その上のゲルを含めて切り取り、目に見えないDNAを含めます。ゲル内のDNAは、続いて、テキストプロトコルに記載されているように、サザンハイブリダイゼーションによって可視化されます。

このシステムでは、複製ブロックは、セル内のアレイの1つのコピーに対応する1つの焦点を含むセルの過半数によって確認されました。アンヒドロテトラサイクリンの添加によりブロックが逆転し、その後のアレイの重複は、複数の病巣を持つ細胞の蓄積として視覚化されました。複製がブロックされた細胞も増殖阻害を示し、これはその後のアンヒドロテトラサイクリン存在下での増殖によって逆転しました。

複製中間体を分析するために、DNAを1次元で電気泳動しました。次に、目的のDNAを切除し、2次元電気泳動により、直鎖状DNAの対角線が得られました。アレイDNAのサザンハイブリダイゼーションにより、ブロックされていないサンプル中に、アレイの予想される5.5kbおよび6.7kbのフラグメントに対応する2つのスポットが明らかになりました。

ブロックされたサンプルは、5.5kbのスポットの減少と、Y字型DNAの蓄積を示す楕円形のシグナルの追加を示しました。アンヒドロテトラサイクリンの添加により、Y字型DNAシグナルが除去されました。もう1つの一般的な中間体は、Yアークの頂部にあるコーンシグナルと、Yアークの末端にある線状DNAからのスパイクとして視覚化されたホリデイジャンクションです。

このテクニックを習得すると、適切に準備されていれば8日で完了します。2D手順ではありますが、DNA構造を最適に視覚化するには、DNAプラグの品質が重要であることを覚えておくことが重要です。