Name: サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中 E。大腸菌蛍光プレッサーオペレータシステムの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ蛍光プレッサーオペレーターシステムを用いた大腸菌におけるレプリケーション閉塞法。TetR-YFPタンパク質による可逆的な複製フォーク停止と二次元ゲル電気泳動によるDNA構造解析の手法を解説します。

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<ol><li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+at+natural+impediments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li>
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<li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li>
<li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li>
<li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li>
<li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli%3A+mechanism+and+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

染色体の複製中、複製機構はその進行を妨げるさまざまな障害に遭遇します。単一起源の染色体全体が確実に複製されるようにするために、細菌はDNAを修復するための多数の経路を持ち、レプリソームをリロードすることができます20,21。病変、一本鎖切断、二本鎖切断、およびDNAにしっかりと結合したタンパク質は、それぞれ専用の経路を使用して対処できますが、これらの経路には大幅な重複がある可能性があります。生細胞におけるレプリソームに対する最も一般的な障害は、核タンパク質ブロック2です。しかし、レプリソームと核タンパク質遮断の衝突を研究する際の2つの長年の困難は、イベントを染色体上の既知の位置に局在化する方法と、詳細な分析を可能にするためにイベントを十分に頻繁に行う方法でした。大 腸菌 が停滞/崩壊した複製フォークにどのように対処するかについての知識の大部分は、DNA損傷剤としてのUVの使用から来ています。 
ここで説明するFROSプロトコルは、レプリソームが複製中に染色体にしっかりと結合したタンパク質に遭遇したときに遭遇するものと同様...

DNA複製時には、レプリソームは、その進行を阻害し、DNA上の障害に直面しています。病変とのギャップだけでなく、異常な構造を含むDNA損傷は、1を進むからレプリソームを防ぐことができます。最近、DNAに結合したタンパク質は、フォークの進行2を複製する障害の最も一般的な供給源であることが見出されました。核ブロックでレプリソームの出会いを次のイベントの知識は以前から知られている場所で生きている細胞の染色体にそのようなブロックを誘導することができないことによって制限されてきた。 インビトロ分析は、速度論的挙動の理解を強化しましたそれは核閉塞3、ならびにレプリソーム自体4,5のメカニズムの詳細を満たしているアクティブレプリソームの。レプリケーションの修理の現在の理解は、一般的に、インビボ 6-8 にプラスミドDNAを用いて、損傷剤としてのUVで行われ、研究されています</s&gt;アップ。それはin vivoで核ブロックに遭遇した後、DNAの修復に関与することができるタンパク質は、一般的に複製ブロックの明確な原因による修復経路内の分子イベントにばらつきがあるかどうか、これらの研究から理解されているがまだ残っています決断される。 ここでは、核のブロックは蛍光プレッサーオペレータシステム（FROS）を使用して、染色体の特定の場所に確立することを可能にするシステムを説明します。私たちは、Eの歪みを利用します9番染色体に組み込まれた240 のtetO部位の配列を持っていた大腸菌 。アレイ内のそれぞれのtetO部位は、アレイ内のRecA媒介性の再結合を防止することにより、配列の安定性を高めるために、それに隣接する10塩基対のランダムな配列を有します。この配列、およびそれの変形は、元々 E.を理解するために使用しました。 大腸菌染色体ダイナミクス10,11が、その後preveに適応させましたntのin vivoでの複製12。アレイは安定に維持されるとのTetR 10,12によって結合されたときに複製フォークの100％に近いブロックすることが見出されています。 in vitroでの類似のlacO配列の使用は、この短い配列は生体内 13 にはあまり効果的であったが、22のサイトは、複製の90％を阻止するのに十分であったとして、いくつかのを発見しました。核の閉塞を作成するために、アレイを適応させるために、リプレッサータンパク質は非常にそれがその後、バリケードを作成するために、配列に特異的に結合する最適化された条件の下で過剰生産されなければなりません。 Tetリプレッサーの蛍光タグ付けされた変異体が使用される場合、閉塞の形成、およびその後の放出は、蛍光顕微鏡を使用することによって監視することができます。各セルの複製のステータスが単一焦点が配列のコピーは1つだけのセル内に存在すると、複数の病巣がアクティブ複製の指標である意味見病巣の数によって示されています。このアクティブ再核の閉塞がレプリソームは、配列を続行するために十分なオペレーター部位のためのTetRの結合親和性を低下させる無償誘導物質の添加により逆転されたときに襞が有効になっています。リプレッサータンパク質は、まだアレイの現在複数のコピーを可視化することができる十分に高い親和性でDNAに結合することができます。 核の閉塞でのイベントのより複雑な詳細は中立中立的な2次元アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーション14-16を使用して検出することができます。これらの技術は、集団を横切るDNA構造の分析を可能にします。複製イベントの間に形成される中間体、および潜在的に修復されないままであるが、可視化することができます。複製フォークが17,18を退行する際に利用制限酵素およびプローブを変化させることにより、中間体は、アレイ領域ではなく、アレイの上流だけでなく可視化することができます。ザ回帰はレプリソーム解離に続いて行われます。先頭とラギング新生鎖は4ウェイDNA構造（ホリデイジャンクショ​​ン）で得られたテンプレート鎖同時に再アニールとして互いにテンプレート鎖とアニールとは別。 このシステムを使用して、このブロック18を検出したときに複製フォークが安定しないことが示されています。また、レプリソーム部品の温度に敏感な誘導体は、それが崩壊した後、複製フォークの再読み込みを防止するために利用することができます。ブロックが確立されると、歪みがレプリソームの同期失活及びリロードの制御予防を確実にするために、非許容温度にシフトすることができます。この温度誘導不活性化は、所定の時間で崩壊した集団内のフォークのすべてを確実にし、レプリソームは、DNAがどのように処理されるか、崩壊、そして何を再する必要があるときに何が起こるかの評価を可能にしますDNA複製のプロセスを開始します。 ここで説明するシステムの利点は、核のブロックが完全に可逆的であるということです。従って、核ブロックから回復する細胞の能力を追跡することが可能です。細胞へのアンヒドロを添加すると、複製フォークが通過進行させる、タイトなリプレッサーの結合を軽減し、細胞は生存能力を取り戻すために。閉塞の緩和は5分後、10分以内に顕微鏡によって中性中性二次元アガロースゲル電気泳動により可視化することができます。また、生存率分析は、複製閉塞から回復する株の能力を明らかにし、増殖し続けることができます。 ここに記載の実験手順で使用される菌株の遺伝的背景を変更することによって、閉塞のこのタイプの修復経路を解明することができます。

<table><tbody><tr><td>トリプトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>成長培地成分;カリウム緩衝液成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>成長培地成分;カリウム緩衝成分</td></tr><tr><td>L-アラビノース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>TetR-YFP産生の誘導用</td></tr><tr><td>アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>複製ブローケージの解放</td></tr><tr><td>Axioskop 2 蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>452310</td><td>細胞の可視化</td></tr><tr><td>eYFPフィルターセット</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>YFP</td></tr><tr><td>CCDカメラの</td>可視化 <td>浜松</td><td>オルカAG</td><td>細胞の可視化</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;ソフトウェア(分子デバイス)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 この原稿の準備に使用</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイオライン</td><td>BIO-41025</td><td>アガロースプラグおよびゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>オリジナルガラス撥水剤(Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>アガロースプラグ製造用</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td></td><td>VWRC103157P TE、TBE緩衝液</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA 二ナトリウム塩溶液を NaOH で pH 8.0 に調整</td></tr>。<tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>静菌剤</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE緩衝液成分</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>細胞溶解緩衝液成分</td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩(サルコシル)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>細胞溶解およびESP緩衝液成分</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>細胞溶解バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>細胞溶解バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>サブセルモデル 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>電気泳動システム</td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>DNA</td></tr><tr><td>の可視化臭化エチジウム</td><td>バイオラッド</td><td>1610433</td><td>DNAの可視化</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE成分</td></tr><tr><td>Hybond-XL ナイロン memrbane</td><td>アマシャム</td><td>RPN203S</td><td>ゼータプローブ Memrbane (BioRad 1620159) 3MM</td></tr><tr><td>Whatman クロマトグラフィー 論文</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>DNAの架橋とサ</td></tr><tr><td>ケの精子からのハイブリダイゼーション デオキシリボ核酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>ハイブリダイゼーション緩衝液成分</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>変性緩衝液成分</td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>転写バッファー</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>洗浄緩衝液成分</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>ハイブリダイゼーション緩衝液成分</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマープライマー</td><td>バイオライン</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>クレノウフラグメント</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP セット</td><td>バイオライン</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸-32P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage 蛍光体スクリーン</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E 多目的スタンダード 35 cm x 43 cm スクリーン</td></tr><tr><td>台風 FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>ブロットの可視化</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションボトル</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; e。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

密結合タンパク質と様々な病変を含むDNA上に存在する障害物は、深刻な細胞の複製機構の進行を阻害することができます。レプリソームの失速は、複製フォークの崩壊につながる、一部または全部のいずれか、染色体からの解離につながることができます。この崩壊からの回復は、細胞に対して正確に完全な染色体重複、その後分割の必要性です。崩壊が発生したときしたがって、細胞はDNAのフォークを復元し、レプリケーションが高い忠実度で完了することができるようにするために行われる多様な機構を進化させました。以前は、細菌におけるこれらの複製修復経路は、既知の部位に局在化されていないという欠点を有するUVダメージを用いて研究されています。この原稿は、foは複製の失速と崩壊を誘導することができる部位特異的なタンパク質のブロックを作成するために、蛍光プレッサーオペレータシステム（FROS）を利用するシステムを説明します大腸菌でRKS。複製の状態は、蛍光顕微鏡およびDNA複製中間体を用いて、単一の生細胞内で可視化することができる方法のプロトコルの詳細は、2次元のアガロースゲル電気泳動によって分析することができます。レプリソーム構成要素（ 例えば DnaBts）の温度感受性変異体は、複製フォークの同期崩壊を誘導するためにシステムに組み込むことができます。さらに、これらのプロセスに関与している組換えタンパク質およびヘリカーゼの役割は、このシステム内での遺伝子ノックアウトを用いて研究することができます。

FROSは、生きた細胞12,18で可視化することが複製中間体を可能に誘導、サイト固有の核ブロックです。細胞をサンプリングするための一般的な実験設計は、図1に示されている。遺伝的背景におけるサンプリングおよび変化のタイミングは、このようなブロックの修復を研究するための汎用性の高いシステムにします。概略的には、18以前に使用されてきたようなDNAB TSとdnaCの TSと温度感受性変異体は、本システムで利用することができる方法を示しています。 FROSの誘導はE.で行いました図1に示すように、 大腸菌株 非温度感受性株のために。核ブロックが確立されたことを確認するために、細胞を0.1％アラビノースにおける増殖の1時間後に、蛍光顕微鏡を用...

ここでは、大腸菌の複製フォークを失速させ崩壊させるための、部位特異的で可逆的なin vivoタンパク質ブロックを利用するシステムについて説明します。複製ブロックの確立は蛍光顕微鏡法で評価し、中性-中性2次元アガロースゲル電気泳動を使用して複製中間体を可視化します。

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

本実験の全体的な目的は、ヌクレオプロテインブロックで複製フォークを停止させ、ブロック部位におけるDNA構造を観察することで、DNA修復経路を研究することです。この手法は、細胞の複製装置がタンパク質のロードブロックに遭遇した際にDNAがどのように処理されるかなど、DNAの複製と修復に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞集団全体において、染色体上の特定の部位で複製フォークを可逆的に停止させることができる点にあります。この手順を実演するのは、私の研究室のメンバーであるKarla Mettrick博士、大学院生のGeorgia Weaver、およびTayla-Ann Corocherです。本手順では、pKM1プラスミドにテトラサイクリンオペレーターアレイを持つE.coli株を使用します。pKM1は、誘導可能な黄色蛍光タンパク質タグ付きテトラサイクリン抑制タンパク質であるTetR-YFPをコードしています。このE.coli株の新鮮なオーバーナイト培養物を、選択に必要な抗生物質を含む希釈複合培地を用いて、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.01になるまで希釈します。培養物を30 °Cで振盪培養し、OD₆₀₀が0.05から0.1になるまで増殖させます。非誘導コントロールとして使用するため、10 mLのサンプルを分取して取り除きます。残りの培養液に0.01%アラビノースを添加し、pKM1からのTetR-YFPの産生を誘導します。非誘導および誘導した両方の培養液を、30 °Cで振盪培養し続けます。1時間後、蛍光顕微鏡を用いて、誘導した培養液の各細胞内に単一の焦点が存在することを確認します。誘導細胞の70%以上に単一の焦点が認められ、細胞の停止が確認された場合は、吸光度を記録し、二次元ゲル電気泳動による分析のためにサンプルを7.5 milliliters採取します。同様に、非誘導コントロール培養液からも同量のサンプルを採取します。蛍光顕微鏡観察の前に、可視化中の細胞の移動を防ぐためのアガロースパッドを準備します。各アガロースパッドについて、融解したアガロース500 µLを顕微鏡スライドに分注し、アガロースが凝固する直前にカバーガラスを被せます。スライドは、使用するまで濡れたティッシュの間で4 °Cで保存します。細胞を確認するタイミングになったら、アガロースパッドからカバーガラスを取り除き、細菌培養液10 µLをパッドの中央に分注します。約5分後、アガロースパッドが乾燥したら、カバーガラスを戻します。カバーガラスの上に浸油を1滴滴下し、スライドを光学系にセットします。位相差顕微鏡を用い、100倍の倍率で細胞を観察します。イメージングソフトウェアのAcquireダイアログボックスで、Exposure Timeを100 millisecon

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。...

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可...

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。...

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

出典: Mettrick, K. A., Lawrence ら、 蛍光抑制子オペレーターシステムを用いて 大腸菌 における部位特異的複製遮断の誘導。 J. Vis. Exp. (2016年)この動画では、アラビノース誘導による黄色蛍光色標識タンパク質TetRの発現を用いて、大 腸...

大腸菌における蛍光標識リプレッサーによるタンパク質媒介複製阻害

このビデオでは、RNA結合タンパク質(RBP)とRNAの相互作用を研究するための細菌のin...

標的遺伝子の翻訳制御を研究するためのレポーター遺伝子抑制アッセイ

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています...

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。...

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

ヒートショック法による大腸菌へのプラスミドDNAの形質転換

学ぶ蛍光プレッサーオペレーターシステムを用いた大腸菌におけるレプリケーション閉塞法。TetR-YFPタンパク質による可逆的な複製フォーク停止と二次元ゲル電気泳動によるDNA構造解析の手法を解説します。

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中

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