Name: サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中 E。大腸菌蛍光プレッサーオペレータシステムの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ蛍光プレッサーオペレーターシステムを用いた大腸菌におけるレプリケーション閉塞法。TetR-YFPタンパク質による可逆的な複製フォーク停止と二次元ゲル電気泳動によるDNA構造解析の手法を解説します。

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<ol><li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+at+natural+impediments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li>
<li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li>
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<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li>
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<li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li>
<li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li>
<li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li>
<li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli%3A+visual+evidence+for+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li>
<li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li>
<li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li>
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<li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li>
<li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li>
<li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li>
<li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li>
<li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li>
<li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li>
<li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli%3A+mechanism+and+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

染色体の複製中、複製機構はその進行を妨げるさまざまな障害に遭遇します。単一起源の染色体全体が確実に複製されるようにするために、細菌はDNAを修復するための多数の経路を持ち、レプリソームをリロードすることができます20,21。病変、一本鎖切断、二本鎖切断、およびDNAにしっかりと結合したタンパク質は、それぞれ専用の経路を使用して対処できますが、これらの経路には大幅な重複がある可能性があります。生細胞におけるレプリソームに対する最も一般的な障害は、核タンパク質ブロック2です。しかし、レプリソームと核タンパク質遮断の衝突を研究する際の2つの長年の困難は、イベントを染色体上の既知の位置に局在化する方法と、詳細な分析を可能にするためにイベントを十分に頻繁に行う方法でした。大 腸菌 が停滞/崩壊した複製フォークにどのように対処するかについての知識の大部分は、DNA損傷剤としてのUVの使用から来ています。 
ここで説明するFROSプロトコルは、レプリソームが複製中に染色体にしっかりと結合したタンパク質に遭遇したときに遭遇するものと同様...

DNA複製時には、レプリソームは、その進行を阻害し、DNA上の障害に直面しています。病変とのギャップだけでなく、異常な構造を含むDNA損傷は、1を進むからレプリソームを防ぐことができます。最近、DNAに結合したタンパク質は、フォークの進行2を複製する障害の最も一般的な供給源であることが見出されました。核ブロックでレプリソームの出会いを次のイベントの知識は以前から知られている場所で生きている細胞の染色体にそのようなブロックを誘導することができないことによって制限されてきた。 インビトロ分析は、速度論的挙動の理解を強化しましたそれは核閉塞3、ならびにレプリソーム自体4,5のメカニズムの詳細を満たしているアクティブレプリソームの。レプリケーションの修理の現在の理解は、一般的に、インビボ 6-8 にプラスミドDNAを用いて、損傷剤としてのUVで行われ、研究されています</s&gt;アップ。それはin vivoで核ブロックに遭遇した後、DNAの修復に関与することができるタンパク質は、一般的に複製ブロックの明確な原因による修復経路内の分子イベントにばらつきがあるかどうか、これらの研究から理解されているがまだ残っています決断される。 ここでは、核のブロックは蛍光プレッサーオペレータシステム（FROS）を使用して、染色体の特定の場所に確立することを可能にするシステムを説明します。私たちは、Eの歪みを利用します9番染色体に組み込まれた240 のtetO部位の配列を持っていた大腸菌 。アレイ内のそれぞれのtetO部位は、アレイ内のRecA媒介性の再結合を防止することにより、配列の安定性を高めるために、それに隣接する10塩基対のランダムな配列を有します。この配列、およびそれの変形は、元々 E.を理解するために使用しました。 大腸菌染色体ダイナミクス10,11が、その後preveに適応させましたntのin vivoでの複製12。アレイは安定に維持されるとのTetR 10,12によって結合されたときに複製フォークの100％に近いブロックすることが見出されています。 in vitroでの類似のlacO配列の使用は、この短い配列は生体内 13 にはあまり効果的であったが、22のサイトは、複製の90％を阻止するのに十分であったとして、いくつかのを発見しました。核の閉塞を作成するために、アレイを適応させるために、リプレッサータンパク質は非常にそれがその後、バリケードを作成するために、配列に特異的に結合する最適化された条件の下で過剰生産されなければなりません。 Tetリプレッサーの蛍光タグ付けされた変異体が使用される場合、閉塞の形成、およびその後の放出は、蛍光顕微鏡を使用することによって監視することができます。各セルの複製のステータスが単一焦点が配列のコピーは1つだけのセル内に存在すると、複数の病巣がアクティブ複製の指標である意味見病巣の数によって示されています。このアクティブ再核の閉塞がレプリソームは、配列を続行するために十分なオペレーター部位のためのTetRの結合親和性を低下させる無償誘導物質の添加により逆転されたときに襞が有効になっています。リプレッサータンパク質は、まだアレイの現在複数のコピーを可視化することができる十分に高い親和性でDNAに結合することができます。 核の閉塞でのイベントのより複雑な詳細は中立中立的な2次元アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーション14-16を使用して検出することができます。これらの技術は、集団を横切るDNA構造の分析を可能にします。複製イベントの間に形成される中間体、および潜在的に修復されないままであるが、可視化することができます。複製フォークが17,18を退行する際に利用制限酵素およびプローブを変化させることにより、中間体は、アレイ領域ではなく、アレイの上流だけでなく可視化することができます。ザ回帰はレプリソーム解離に続いて行われます。先頭とラギング新生鎖は4ウェイDNA構造（ホリデイジャンクショ​​ン）で得られたテンプレート鎖同時に再アニールとして互いにテンプレート鎖とアニールとは別。 このシステムを使用して、このブロック18を検出したときに複製フォークが安定しないことが示されています。また、レプリソーム部品の温度に敏感な誘導体は、それが崩壊した後、複製フォークの再読み込みを防止するために利用することができます。ブロックが確立されると、歪みがレプリソームの同期失活及びリロードの制御予防を確実にするために、非許容温度にシフトすることができます。この温度誘導不活性化は、所定の時間で崩壊した集団内のフォークのすべてを確実にし、レプリソームは、DNAがどのように処理されるか、崩壊、そして何を再する必要があるときに何が起こるかの評価を可能にしますDNA複製のプロセスを開始します。 ここで説明するシステムの利点は、核のブロックが完全に可逆的であるということです。従って、核ブロックから回復する細胞の能力を追跡することが可能です。細胞へのアンヒドロを添加すると、複製フォークが通過進行させる、タイトなリプレッサーの結合を軽減し、細胞は生存能力を取り戻すために。閉塞の緩和は5分後、10分以内に顕微鏡によって中性中性二次元アガロースゲル電気泳動により可視化することができます。また、生存率分析は、複製閉塞から回復する株の能力を明らかにし、増殖し続けることができます。 ここに記載の実験手順で使用される菌株の遺伝的背景を変更することによって、閉塞のこのタイプの修復経路を解明することができます。

<table><tbody><tr><td>トリプトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>成長培地成分;カリウム緩衝液成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>成長培地成分;カリウム緩衝成分</td></tr><tr><td>L-アラビノース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>TetR-YFP産生の誘導用</td></tr><tr><td>アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>複製ブローケージの解放</td></tr><tr><td>Axioskop 2 蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>452310</td><td>細胞の可視化</td></tr><tr><td>eYFPフィルターセット</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>YFP</td></tr><tr><td>CCDカメラの</td>可視化 <td>浜松</td><td>オルカAG</td><td>細胞の可視化</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;ソフトウェア(分子デバイス)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 この原稿の準備に使用</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイオライン</td><td>BIO-41025</td><td>アガロースプラグおよびゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>オリジナルガラス撥水剤(Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>アガロースプラグ製造用</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td></td><td>VWRC103157P TE、TBE緩衝液</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA 二ナトリウム塩溶液を NaOH で pH 8.0 に調整</td></tr>。<tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>静菌剤</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE緩衝液成分</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>細胞溶解緩衝液成分</td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩(サルコシル)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>細胞溶解およびESP緩衝液成分</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>細胞溶解バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>細胞溶解バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>サブセルモデル 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>電気泳動システム</td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>DNA</td></tr><tr><td>の可視化臭化エチジウム</td><td>バイオラッド</td><td>1610433</td><td>DNAの可視化</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE成分</td></tr><tr><td>Hybond-XL ナイロン memrbane</td><td>アマシャム</td><td>RPN203S</td><td>ゼータプローブ Memrbane (BioRad 1620159) 3MM</td></tr><tr><td>Whatman クロマトグラフィー 論文</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>DNAの架橋とサ</td></tr><tr><td>ケの精子からのハイブリダイゼーション デオキシリボ核酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>ハイブリダイゼーション緩衝液成分</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>変性緩衝液成分</td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>転写バッファー</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>洗浄緩衝液成分</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>ハイブリダイゼーション緩衝液成分</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマープライマー</td><td>バイオライン</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>クレノウフラグメント</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP セット</td><td>バイオライン</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸-32P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage 蛍光体スクリーン</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E 多目的スタンダード 35 cm x 43 cm スクリーン</td></tr><tr><td>台風 FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>ブロットの可視化</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションボトル</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; e。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

密結合タンパク質と様々な病変を含むDNA上に存在する障害物は、深刻な細胞の複製機構の進行を阻害することができます。レプリソームの失速は、複製フォークの崩壊につながる、一部または全部のいずれか、染色体からの解離につながることができます。この崩壊からの回復は、細胞に対して正確に完全な染色体重複、その後分割の必要性です。崩壊が発生したときしたがって、細胞はDNAのフォークを復元し、レプリケーションが高い忠実度で完了することができるようにするために行われる多様な機構を進化させました。以前は、細菌におけるこれらの複製修復経路は、既知の部位に局在化されていないという欠点を有するUVダメージを用いて研究されています。この原稿は、foは複製の失速と崩壊を誘導することができる部位特異的なタンパク質のブロックを作成するために、蛍光プレッサーオペレータシステム（FROS）を利用するシステムを説明します大腸菌でRKS。複製の状態は、蛍光顕微鏡およびDNA複製中間体を用いて、単一の生細胞内で可視化することができる方法のプロトコルの詳細は、2次元のアガロースゲル電気泳動によって分析することができます。レプリソーム構成要素（ 例えば DnaBts）の温度感受性変異体は、複製フォークの同期崩壊を誘導するためにシステムに組み込むことができます。さらに、これらのプロセスに関与している組換えタンパク質およびヘリカーゼの役割は、このシステム内での遺伝子ノックアウトを用いて研究することができます。

FROSは、生きた細胞12,18で可視化することが複製中間体を可能に誘導、サイト固有の核ブロックです。細胞をサンプリングするための一般的な実験設計は、図1に示されている。遺伝的背景におけるサンプリングおよび変化のタイミングは、このようなブロックの修復を研究するための汎用性の高いシステムにします。概略的には、18以前に使用されてきたようなDNAB TSとdnaCの TSと温度感受性変異体は、本システムで利用することができる方法を示しています。 FROSの誘導はE.で行いました図1に示すように、 大腸菌株 非温度感受性株のために。核ブロックが確立されたことを確認するために、細胞を0.1％アラビノースにおける増殖の1時間後に、蛍光顕微鏡を用...

ここでは、大腸菌の複製フォークを失速させ崩壊させるための、部位特異的で可逆的なin vivoタンパク質ブロックを利用するシステムについて説明します。複製ブロックの確立は蛍光顕微鏡法で評価し、中性-中性2次元アガロースゲル電気泳動を使用して複製中間体を可視化します。

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

本実験の全体的な目的は、ヌクレオプロテインブロックで複製フォークを停止させ、ブロック部位におけるDNA構造を観察することで、DNA修復経路を研究することです。この手法は、細胞の複製装置がタンパク質のロードブロックに遭遇した際にDNAがどのように処理されるかなど、DNAの複製と修復に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞集団全体において、染色体上の特定の部位で複製フォークを可逆的に停止させることができる点にあります。この手順を実演するのは、私の研究室のメンバーであるKarla Mettrick博士、大学院生のGeorgia Weaver、およびTayla-Ann Corocherです。本手順では、pKM1プラスミドにテトラサイクリンオペレーターアレイを持つE.coli株を使用します。pKM1は、誘導可能な黄色蛍光タンパク質タグ付きテトラサイクリン抑制タンパク質であるTetR-YFPをコードしています。このE.coli株の新鮮なオーバーナイト培養物を、選択に必要な抗生物質を含む希釈複合培地を用いて、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.01になるまで希釈します。培養物を30 °Cで振盪培養し、OD₆₀₀が0.05から0.1になるまで増殖させます。非誘導コントロールとして使用するため、10 mLのサンプルを分取して取り除きます。残りの培養液に0.01%アラビノースを添加し、pKM1からのTetR-YFPの産生を誘導します。非誘導および誘導した両方の培養液を、30 °Cで振盪培養し続けます。1時間後、蛍光顕微鏡を用いて、誘導した培養液の各細胞内に単一の焦点が存在することを確認します。誘導細胞の70%以上に単一の焦点が認められ、細胞の停止が確認された場合は、吸光度を記録し、二次元ゲル電気泳動による分析のためにサンプルを7.5 milliliters採取します。同様に、非誘導コントロール培養液からも同量のサンプルを採取します。蛍光顕微鏡観察の前に、可視化中の細胞の移動を防ぐためのアガロースパッドを準備します。各アガロースパッドについて、融解したアガロース500 µLを顕微鏡スライドに分注し、アガロースが凝固する直前にカバーガラスを被せます。スライドは、使用するまで濡れたティッシュの間で4 °Cで保存します。細胞を確認するタイミングになったら、アガロースパッドからカバーガラスを取り除き、細菌培養液10 µLをパッドの中央に分注します。約5分後、アガロースパッドが乾燥したら、カバーガラスを戻します。カバーガラスの上に浸油を1滴滴下し、スライドを光学系にセットします。位相差顕微鏡を用い、100倍の倍率で細胞を観察します。イメージングソフトウェアのAcquireダイアログボックスで、Exposure Timeを100 millisecondsに設定します。Acquireを選択して画像をキャプチャします。ステージは動かさないでください。[Acquired]ダイアログボックスで、カメラに連動する外部シャッターの照明としてYFPを選択します。露出時間を1,000ミリ秒に設定します。ステージ照明を消灯し、[Acquire]を選択して蛍光画像を撮影します。この手順を開始するには、あらかじめ回収しておいた培養サンプルにアジ化ナトリウムを最終濃度 0.1% となるように加え、氷上で少なくとも5分間インキュベートします。細胞を 5,000 ×g で10分間遠心分離し、上清を捨てます。各細胞ペレットを200 µLのPIVバッファーで再懸濁し、細胞をマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心分離機で細胞をペレット化し、上清を捨てます。顕微鏡スライドに、適切なガラス用撥水剤またはシリコン溶液を40 µL処理します。スライドをティッシュで拭き、乾燥させます。最も細胞密度の低い細胞を 50 µL の PIV で再懸濁し、ヒートブロックを用いて 50 °C で保持します。その他のすべてのサンプルについては、各チューブの最終的な細胞密度が同一になるように PIV の量を調整します。サンプルに、PIVで調製したばかりの0.8%アガロース溶液を同量加えます。凝固を防ぐため、サンプルをヒートブロックに入れ、50 °C以上に保ちます。処理済みのスライド上に細胞アガロース懸濁液を20 µLずつ滴下し、半球状のプラグを作成します。プラグが凝固したら、1つのサンプルからすべてのプラグを慎重に1本のマイクロ遠心チューブに移し、1 mLの細胞溶解バッファーを加えます。37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、細胞溶解バッファーを除去し、1 mLのEDTA-Sarkosyl-Proteinase K（ESP溶液）を加えます。50 °Cで一晩、またはプラグが透明になるまでインキュベートします。プラグが透明になったら、ESPバッファーを除去し、プラグを15 mLチューブに移します。12 mLのTEバッファーを加え、30分間静置します。TEバッファーでプラグを計5回洗浄します。1 mLのTEバッファーに入れ、4°Cでプラグを保存します。複製中間体を解析するために、アガロースプラグ中のDNAを、目的領域に適した制限酵素で消化します。この例では、EcoRVがアレイの直前、アレイ内、およびアレイの直後でDNAを切断し、目的領域に5.5 kbと6.7 kbの断片を生成します。この手順を開始するには、アガロースプラグを新しいマイクロ遠心チューブに移し、150 µLの制限酵素バッファーを加えます。25〜100 unitsの制限酵素を加え、37 °Cで6〜8時間消化させます。4°Cで0.4%アガロースゲルを調製します。溶融したアガロース300 mLを、約25×25 cmのゲル台に流し込みます。プラグの直径とほぼ同じ幅のウェルを作るため、コームを挿入します。ゲルが凝固したら、コームを取り除き、ゲルを室温に戻します。白金耳（接種ループ）を使用して、消化済みのあがろーすプラグの1つをウェルに滑り込ませ、DNAがゲルに進入する側のウェルの壁面にプラグの平坦な面が接するように配置します。同様の手順で、1つおきのウェルにプラグを1つずつ挿入します。溶解した0.4%アガロースをウェルにピペットで注入し、プラグを固定します。空のウェルに1 kb DNAラダーをロードし、ラダーとサンプルの間に間隔を空けます。1xTBEを用いて、室温で一晩ゲル電気泳動を行います。翌日、0.3 µg/mLのエチジウムブロミドを含むウォーターバス中でゲルを20分間染色します。長波長UVトランスイルミネーターを用いてDNAを可視化し、各レーンの断片を、レーンの両側に余分なアガロースが含まれないよう直線的に均等に切り出します。切り出したゲルのレーンを、DNAの泳動方向に対して90度の角度でゲル台に配置します。次のステップは、2次元目のゲル用にアガロースを300 milliliters調製することです。アガロースが50 degrees celsiusまで冷却されたら、溶解したアガロースをゲルスライス周囲にピペッティングし、位置を固定します。残りのアガロースを、ゲルスライスと同等以上の深さになるまでトレイに流し込みます。ゲルが凝固したら、0.3 µg/mLのエチジウムブロマイドを含む1xTBE中で、DNAが約10 cm移動するまで4 °Cで電気泳動を行います。ゲノムDNAが存在するブロックを、不可視のDNAも含めるためにその上のゲル部分と共に切り出します。ゲル内のDNAは、その後、テキストプロトコルに記載されているサザンハイブリダイゼーションによって可視化されます。本システムでは、細胞内のアレイ1コピーに対応するフォーカスを1つ持つ細胞が多数存在することで、複製ブロックが確認されました。アンヒドロテトラサイクリンの添加によりブロックが解除され、その後のアレイの重複は、複数のフォーカスを持つ細胞の蓄積として可視化されました。また、複製がブロックされた細胞では増殖抑制が見られましたが、これはアンヒドロテトラサイクリン存在下でその後に培養することで回復しました。複製中間体を解析するため、DNAを1次元目に電気泳動しました。その後、目的のDNAを切り出し、2次元目に電気泳動を行った結果、線状DNAが対角線上に現れました。アレイDNAのサザンハイブリダイゼーションにより、ブロッキングを行っていないサンプルにおいて、アレイの期待される5.5kbおよび6.7kbのフラグメントに対応する2つのスポットが検出されました。ブロッキングしたサンプルでは、5.5kbのスポットが減少し、Y字型DNAの蓄積を示す楕円形のシグナルが追加されました。anhydrotetracyclineを添加すると、Y字型DNAのシグナルが消失しました。もう一つの一般的な中間体はホリデイ接合であり、Y字弧の上端にある円錐状のシグナルと、Y字弧の末端にある線状DNAからのスパイクとして可視化されます。この手法を習得すれば、適切に実施することで8日間で完了させることができます。2次元の手法ではありますが、DNA構造を最適に可視化するためには、DNAプラグの品質が極めて重要であることを忘れてはいけません。

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学ぶ蛍光プレッサーオペレーターシステムを用いた大腸菌におけるレプリケーション閉塞法。TetR-YFPタンパク質による可逆的な複製フォーク停止と二次元ゲル電気泳動によるDNA構造解析の手法を解説します。

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