サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中

本実験の全体的な目的は、ヌクレオプロテインブロックで複製フォークを停止させ、ブロック部位におけるDNA構造を観察することで、DNA修復経路を研究することです。この手法は、細胞の複製装置がタンパク質のロードブロックに遭遇した際にDNAがどのように処理されるかなど、DNAの複製と修復に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞集団全体において、染色体上の特定の部位で複製フォークを可逆的に停止させることができる点にあります。

この手順を実演するのは、私の研究室のメンバーであるKarla Mettrick博士、大学院生のGeorgia Weaver、およびTayla-Ann Corocherです。本手順では、pKM1プラスミドにテトラサイクリンオペレーターアレイを持つE.coli株を使用します。pKM1は、誘導可能な黄色蛍光タンパク質タグ付きテトラサイクリン抑制タンパク質であるTetR-YFPをコードしています。

このE.coli株の新鮮なオーバーナイト培養物を、選択に必要な抗生物質を含む希釈複合培地を用いて、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.01になるまで希釈します。培養物を30 °Cで振盪培養し、OD₆₀₀が0.05から0.1になるまで増殖させます。非誘導コントロールとして使用するため、10 mLのサンプルを分取して取り除きます。

残りの培養液に0.01%アラビノースを添加し、pKM1からのTetR-YFPの産生を誘導します。非誘導および誘導した両方の培養液を、30 °Cで振盪培養し続けます。1時間後、蛍光顕微鏡を用いて、誘導した培養液の各細胞内に単一の焦点が存在することを確認します。

誘導細胞の70%以上に単一の焦点が認められ、細胞の停止が確認された場合は、吸光度を記録し、二次元ゲル電気泳動による分析のためにサンプルを7.5 milliliters採取します。同様に、非誘導コントロール培養液からも同量のサンプルを採取します。蛍光顕微鏡観察の前に、可視化中の細胞の移動を防ぐためのアガロースパッドを準備します。

各アガロースパッドについて、融解したアガロース500 µLを顕微鏡スライドに分注し、アガロースが凝固する直前にカバーガラスを被せます。スライドは、使用するまで濡れたティッシュの間で4 °Cで保存します。細胞を確認するタイミングになったら、アガロースパッドからカバーガラスを取り除き、細菌培養液10 µLをパッドの中央に分注します。

約5分後、アガロースパッドが乾燥したら、カバーガラスを戻します。カバーガラスの上に浸油を1滴滴下し、スライドを光学系にセットします。位相差顕微鏡を用い、100倍の倍率で細胞を観察します。

イメージングソフトウェアのAcquireダイアログボックスで、Exposure Timeを100 millisecondsに設定します。Acquireを選択して画像をキャプチャします。ステージは動かさないでください。

[Acquired]ダイアログボックスで、カメラに連動する外部シャッターの照明としてYFPを選択します。露出時間を1,000ミリ秒に設定します。ステージ照明を消灯し、[Acquire]を選択して蛍光画像を撮影します。

この手順を開始するには、あらかじめ回収しておいた培養サンプルにアジ化ナトリウムを最終濃度 0.1% となるように加え、氷上で少なくとも5分間インキュベートします。細胞を 5,000 ×g で10分間遠心分離し、上清を捨てます。

各細胞ペレットを200 µLのPIVバッファーで再懸濁し、細胞をマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心分離機で細胞をペレット化し、上清を捨てます。顕微鏡スライドに、適切なガラス用撥水剤またはシリコン溶液を40 µL処理します。

スライドをティッシュで拭き、乾燥させます。最も細胞密度の低い細胞を 50 µL の PIV で再懸濁し、ヒートブロックを用いて 50 °C で保持します。その他のすべてのサンプルについては、各チューブの最終的な細胞密度が同一になるように PIV の量を調整します。

サンプルに、PIVで調製したばかりの0.8%アガロース溶液を同量加えます。凝固を防ぐため、サンプルをヒートブロックに入れ、50 °C以上に保ちます。処理済みのスライド上に細胞アガロース懸濁液を20 µLずつ滴下し、半球状のプラグを作成します。

プラグが凝固したら、1つのサンプルからすべてのプラグを慎重に1本のマイクロ遠心チューブに移し、1 mLの細胞溶解バッファーを加えます。37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、細胞溶解バッファーを除去し、1 mLのEDTA-Sarkosyl-Proteinase K（ESP溶液）を加えます。

50 °Cで一晩、またはプラグが透明になるまでインキュベートします。プラグが透明になったら、ESPバッファーを除去し、プラグを15 mLチューブに移します。12 mLのTEバッファーを加え、30分間静置します。

TEバッファーでプラグを計5回洗浄します。1 mLのTEバッファーに入れ、4°Cでプラグを保存します。複製中間体を解析するために、アガロースプラグ中のDNAを、目的領域に適した制限酵素で消化します。

この例では、EcoRVがアレイの直前、アレイ内、およびアレイの直後でDNAを切断し、目的領域に5.5 kbと6.7 kbの断片を生成します。この手順を開始するには、アガロースプラグを新しいマイクロ遠心チューブに移し、150 µLの制限酵素バッファーを加えます。25〜100 unitsの制限酵素を加え、37 °Cで6〜8時間消化させます。

4°Cで0.4%アガロースゲルを調製します。溶融したアガロース300 mLを、約25×25 cmのゲル台に流し込みます。プラグの直径とほぼ同じ幅のウェルを作るため、コームを挿入します。

ゲルが凝固したら、コームを取り除き、ゲルを室温に戻します。白金耳（接種ループ）を使用して、消化済みのあがろーすプラグの1つをウェルに滑り込ませ、DNAがゲルに進入する側のウェルの壁面にプラグの平坦な面が接するように配置します。同様の手順で、1つおきのウェルにプラグを1つずつ挿入します。

溶解した0.4%アガロースをウェルにピペットで注入し、プラグを固定します。空のウェルに1 kb DNAラダーをロードし、ラダーとサンプルの間に間隔を空けます。1xTBEを用いて、室温で一晩ゲル電気泳動を行います。

翌日、0.3 µg/mLのエチジウムブロミドを含むウォーターバス中でゲルを20分間染色します。長波長UVトランスイルミネーターを用いてDNAを可視化し、各レーンの断片を、レーンの両側に余分なアガロースが含まれないよう直線的に均等に切り出します。切り出したゲルのレーンを、DNAの泳動方向に対して90度の角度でゲル台に配置します。

次のステップは、2次元目のゲル用にアガロースを300 milliliters調製することです。アガロースが50 degrees celsiusまで冷却されたら、溶解したアガロースをゲルスライス周囲にピペッティングし、位置を固定します。残りのアガロースを、ゲルスライスと同等以上の深さになるまでトレイに流し込みます。

ゲルが凝固したら、0.3 µg/mLのエチジウムブロマイドを含む1xTBE中で、DNAが約10 cm移動するまで4 °Cで電気泳動を行います。ゲノムDNAが存在するブロックを、不可視のDNAも含めるためにその上のゲル部分と共に切り出します。ゲル内のDNAは、その後、テキストプロトコルに記載されているサザンハイブリダイゼーションによって可視化されます。

本システムでは、細胞内のアレイ1コピーに対応するフォーカスを1つ持つ細胞が多数存在することで、複製ブロックが確認されました。アンヒドロテトラサイクリンの添加によりブロックが解除され、その後のアレイの重複は、複数のフォーカスを持つ細胞の蓄積として可視化されました。また、複製がブロックされた細胞では増殖抑制が見られましたが、これはアンヒドロテトラサイクリン存在下でその後に培養することで回復しました。

複製中間体を解析するため、DNAを1次元目に電気泳動しました。その後、目的のDNAを切り出し、2次元目に電気泳動を行った結果、線状DNAが対角線上に現れました。アレイDNAのサザンハイブリダイゼーションにより、ブロッキングを行っていないサンプルにおいて、アレイの期待される5.5kbおよび6.7kbのフラグメントに対応する2つのスポットが検出されました。

ブロッキングしたサンプルでは、5.5kbのスポットが減少し、Y字型DNAの蓄積を示す楕円形のシグナルが追加されました。anhydrotetracyclineを添加すると、Y字型DNAのシグナルが消失しました。もう一つの一般的な中間体はホリデイ接合であり、Y字弧の上端にある円錐状のシグナルと、Y字弧の末端にある線状DNAからのスパイクとして可視化されます。

この手法を習得すれば、適切に実施することで8日間で完了させることができます。2次元の手法ではありますが、DNA構造を最適に可視化するためには、DNAプラグの品質が極めて重要であることを忘れてはいけません。