光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

この手順の全体的な目的は、生存している細菌細胞内において、DNA結合タンパク質の活性を直接可視化し定量化することです。これは、目的のDNA結合タンパク質に光活性化蛍光タンパク質を融合して発現させた細胞を可視化することで達成されます。本手順の第2段階では、イメージングを行いながら個々のタンパク質が光活性化される様子を動画で取得します。

その後、データを解析してタンパク質の局在を決定し、単一細胞内でのタンパク質の挙動を追跡します。単一タンパク質が染色体に接触した際の拡散係数の変化によって、DNA結合イベントを特定します。最終的に、細胞あたりの結合タンパク質数と拡散タンパク質数をカウントすることで、単一細胞レベルでのタンパク質とDNAの相互作用を定量的に評価することができます。

この手法は、in vivoでの修復速度や修復部位の空間分布など、DNA修復分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。ここでは、生きたE. coli細胞におけるDNAポリメラーゼIの修復活性を測定することで、本手法を実演します。まず、500 °Cの加熱炉で1時間加熱し、背景に蛍光粒子がないカバーガラスを作成します。厚さ番号1.5のカバーガラスのストックを焼成し、アルミホイルに包んで室温で保存してください。

これらは数週間にわたって使用可能です。次に、AB 1157 poly a PA m cherry 株の対数増殖期初期の E coli 1 mL を 1.5 mL マイクロ遠心チューブに入れ、2,300 G で 5 分間遠心分離して濃縮します。

上清を除去し、細胞ペレットを20 µLの残留培地で再懸濁し、ボルテックスミキサーで細胞を溶解させます。次に、蒸留水を用いて1.5%低蛍光アガロース溶液を作成します。メチルメタンスルホナート（MMS）を用いたDNA損傷実験を行う際は、細心の注意を払いながら、融解したアガロース500 µLと2倍濃縮最小培地500 µLを混ぜ、ピペッティングで数回ゆっくりと混合します。

混合液が冷める前に、500 µLの最小培地に8.3 µLのMMSを加え、arosと混合します。これを焼成済みのカバーガラス上に広げます。気泡が入らないように注意しながら、中央に均一に広げてください。

2枚目の焼成済みカバーガラスでパッドを平らにします。冷却後、パッドから上のカバーを取り除き、濃縮細胞懸濁液を1 µL加えます。新しい焼成済みカバーガラスでパッドを覆い、非常に軽く押さえて細胞を固定します。

細胞が乾燥するため、45分以内にイメージングを行う必要があります。DNA損傷実験においてこの時間を延長したい場合は、パッドをシリコンガスケット内で密閉することができます。イメージングを開始する前に、細胞をパッド上で20分間インキュベートしてください。

室温の加湿容器内において、顕微鏡は405 nmの光活性化レーザーと561 nmの励起レーザーを備えています。高傾斜照明を用いてカバースリップ表面上の薄い断面内にある蛍光分子のみを励起させることで、単一分子感度を達成し、蛍光放出を電子増倍CCDカメラで記録します。試料を顕微鏡ステージに設置し、細胞にピントを合わせます。

透過光照明下で、データサイズを削減しカメラの読み出し速度を向上させるため、クロップした視野を設定します。サンプルを周囲光から遮断し、単一蛍光体の検出のために電子増倍CCDカメラのゲインをオンにします。フレームレートを1フレームあたり15.26 millisecondsに設定します。

これには0.26ミリ秒のカメラ読み出し時間が含まれます。モーションブラーを抑えて鮮明な蛍光スポットを観察するには、露光時間を十分に短く設定する必要があります。一方で、結合した分子と拡散している分子を明確に区別するためには、十分な時間間隔でトラックをサンプリングする必要があります。それでは、カメラデータを表示してダークバックグラウンド信号を確認してください。

561 nmレーザーをオンにし、励起バックグラウンド信号を確認します。Paul one PA M cherry融合タンパク質を光活性化させるため、405 nmレーザーをオンにし、単一分子の蛍光スポットが現れるまで強度を上げます。次に、励起ビームの角度を調整し、サンプルの薄い断面のみを照射するようにします。

カバーガラスの表面を閉じます。この手法は、単一の蛍光タンパク質の検出と精密な局在化に依存するため、データの品質には顕微鏡の最適なアライメントと感度が極めて重要になります。そのために、レーザービームを100倍、開口数1.4の対物レンズの後焦点面に集光させてください。

集光レンズをビームに対して垂直方向に移動させると、焦点が対物レンズの中心からずれ、ビームが対物レンズを斜めに通過することになります。蛍光強度を最大化し、背景ノイズを最小限に抑えるようにビームを調整してください。透過光顕微鏡モードで細胞の新しい視野を探し、像に焦点を合わせます。

カメラでスナップショットを撮影し、細胞の輪郭を記録します。561 nmレーザーをオンにし、細胞の自家蛍光およびカバーガラス上のバックグラウンドスポットを数秒間漂白します。

データ収集を開始する前に、561 nmの連続励起下でパームムービーの撮影を開始します。405 nmレーザーをオンにし、撮影が進むにつれて強度を徐々に上げ、最大1 W/cm²まで到達させます。細胞の自家蛍光を引き起こすような、それ以上の405 nm強度にならないように注意してください。

蛍光分子の密度に注意してください。各フレームで蛍光スポットが明確に分離されるよう、活性化率を低く抑えることが重要です。1つのムービーにつき約10,000フレームを記録します。視野をクロップした場合、通常、時間は最大3分、ハードディスクの容量は最大1GBになります。

一度視野の撮影が行われると、pa m cherry蛍光分子は不可逆的に退色し、観察できなくなることに注意してください。繰り返しになりますが、以下の手順ではmatlabのカスタムソフトウェアを使用します。単一の蛍光分子は、点像分布関数（psf）として現れます。

動画では、まず直径7ピクセルのガウスカーネルを用いたバンドパスフィルタ処理画像からPSFを特定しています。背景の標準偏差の4.5倍以上のピーク画素強度を持つ位置を、PSFの候補位置としています。候補となる各PSFの中で局所的に最も明るい画素を、楕円ガウス関数のフィッティングにおける初期推定値として使用します。自由フィッティングパラメータは、X座標、Y座標、X幅、Y幅、回転角、振幅、および背景オフセットです。

楕円形ガウシアンマスクは、露光時間中の分子の動きを考慮したものであり、これによりPSFプロットのぼけや歪みが生じます。PALMムービーの全フレームから得られたXYローカライゼーションを、同一視野の透過光顕微鏡画像上に重ね合わせると、PAM CherryのローカライゼーションはE. coli細胞の中央領域内に現れるはずです。自動トラッキングによってタンパク質の移動を測定しますが、トラッキングウィンドウを適切に選択することが極めて重要です。

まず、一連のトラッキングウィンドウパラメータを用いてトラッキングアルゴリズムを実行します。1細胞あたりの計測トラック数をトラッキングウィンドウに対してプロットし、トラックの分断が起こらない最小のトラッキングウィンドウを特定します。得られたトラックを、同一視野の透過光顕微鏡像上に表示します。細胞内における分子運動の空間分布を可視化します。適切に設定されていれば、トラックは単一細胞内に限定された拡散を示すはずです。一部のトラックが細胞間を跨いでいるように見える場合は、トラッキングウィンドウが大きすぎるか、あるいは光活性化率が高すぎたため、別々の分子が誤ってリンクされたことを示唆しています。

連続する局在点間のステップ長の累積分布をプロットします。トラッキングウィンドウが十分に大きい場合、曲線は緩やかに上昇して飽和しますが、ウィンドウが小さすぎるとカットオフエッジが現れます。適切なトラッキングウィンドウを選択した後、Paul oneの拡散特性を解析できます。

nステップの合計を持つ各トラックについて、連続する局在化点間の平均二乗変位（MSD）を算出します。MSDの統計的不確かさを低減するため、局在化点が5点以上あるトラックのみを使用してください。次に、MSDからトラックごとの見かけの拡散係数を計算します。第2項は、推定された局在化誤差を補正するためのものです。

これらは第2項の値です。この例では、非損傷細胞におけるpol oneおよびMMSによるDNA損傷処理を施した細胞におけるpol oneについて、視野内のすべてのトラックから測定された拡散係数の値のヒストグラムをプロットします。赤色のバーは、染色体に結合していると考えられ、0.15 square microns per second未満で拡散する個々のpol one分子の集団を示しています。一方、自由に拡散する分子は0.9 square microns per second前後で移動します。

結合したPol $\nu$分子を同定した後、結合部位の位置を、損傷のない細胞およびmmMSによる損傷を受けた細胞で可視化することができます。観察された全トラック数に対する結合トラックの割合は、Pol $\nu$のDNA修復活性の直接的な定量的指標となります。

生きたE. coli細胞を用いて、Pol I-PA-mCherry融合タンパク質のin vivo光活性化を行いました。光活性化を単一細胞内の1つのPA-mCherry蛍光タンパク質に限定することも可能であり、光活性化率を高めることでより多くの蛍光分子が検出されました。PALM動画の各フレームに対して局在解析を実施しました。

固定細胞内の不動分子、または生細胞内の結合分子を用いて精度を測定した結果、理論的な予測と一致する40 nanometersであった。次に、局在化しきい値を設定したが、この値が低すぎると、背景ノイズのランダムなピークが誤って候補位置として選択され、逆にしきい値が高すぎると、一部のスポットが見逃された。

得られたPaul oneの局在は細胞の中央領域に位置しており、E. coliヌクレオイドの空間的組織化をおおむね再現していました。損傷のない細胞におけるPaul one軌跡の大部分は拡散を示します。典型的な細胞には数百本のPaul one軌跡が含まれており、これはE. coli細胞1個あたり約400分子というPaul oneのコピー数と一致しています。

さまざまな種類の分子運動は、一連のラグタイムにわたるMSD値を算出することで識別できます。方向性を持った運動は放物線を描き、ブラウン運動は直線で表されるのが特徴です。また、制限拡散曲線はプラトー（一定値）に達し、不動粒子のMSD曲線のオフセットは局在化の不確かさを表します。

得られたPaul oneのMSD曲線は、短いラグ時間ではブラウン運動を示す直線的な上昇を示し、長いラグ時間では細胞の閉じ込め効果により飽和しました。これらの手法を用いて、未損傷細胞における外来性DNAアルキル化損傷に対するPaul oneのDNA修復活性を測定しました。Paul oneの拡散係数ヒストグラムでは、拡散分子の主要な集団が示されています。

少数の結合分子は、100 millimolarのMMSによる持続的な損傷下でのDNA複製および内因性DNA損傷の修復に関与している可能性があります。拡散係数がほぼゼロであるトラックの頻度が著しく増加しています。これは、変異原が存在する場合、DNA修復により多くのPaul one分子が関与しなければならないというモデルを支持するものであり、本手順に従った結果となります。

細胞内におけるタンパク質の空間分布を定量化し、DNA修復に関与するより大きなタンパク質複合体の存在を調査するために、局在化やクラスター解析などの他のデータ解析手法を実施することができます。