開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）

本実験の全体的な目的は、個々の代謝経路、遺伝的改変、および/または薬理学的治療によって引き起こされる、解糖系、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸回路における全個体レベルでのリアルタイムな代謝変動を非侵襲的にモニタリングすることです。これは、生存している線虫に安定同位体を投与し、より多くの代謝物において十分な同位体濃縮を行うことで、中間代謝経路における遺伝的および/または薬理学的な変動の定量化を可能にすることで達成されます。第二のステップとして、大気中および溶解した二酸化炭素中の同位体取り込みをガス比質量分析法で測定し、短時間における中間代謝フラックスのより直接的な評価を行います。

次に、線虫における代謝フラックスの変動を定量化するため、HPLCを用いた全虫遊離アミノ酸分析、およびGCMSを用いたアミノ酸と有機酸の同位体濃縮分析を行います。安定同位体への曝露後、野生型線虫において、同位体曝露時間の違い、細菌の除去、および異なる虫体破砕法が中間代謝物の同位体存在量に及ぼす影響を検討し、結果を得ます。この手法を用いることで、中間代謝に関する知見を得ることが可能です。

本手法は、哺乳類細胞株や組織などの系にも適用可能です。この手法を着想したのは、HPLCを用いた遊離虫体アミノ酸分析において、一次呼吸機能の変化に伴う中間代謝フラックスの障害を示唆する一貫した異常を観察したことがきっかけでした。本手順を開始します。

発生段階または成体期に安定同位体標識された代謝前駆体に曝露させた線虫を、1.5 mLのプラスチック製遠心チューブに回収します。通常、線虫を1 mLあたり1000匹の濃度に希釈します。内部標準としてε-アミノカプロン酸を含む60%過塩素酸を線虫に加え、最終濃度が4%過塩素酸および20 nMの内部標準となるようにします。

5分間、重力で虫を沈殿させた後、上清を除去して別のチューブに保存します。次のステップはこの手順において最も重要な工程の一つです。遊離代謝物分析を行う前に、スクリーニングによって虫を完全に破砕する必要があります。プラスチック製ホモジナイザーと電動ドリルを用い、虫のサンプルを15秒間すり潰します。

光学顕微鏡で蠕虫の破砕を確認し、必要に応じて粉砕を繰り返します。この画像では、パネルAとBは粉砕前の蠕虫を示しています。粉砕後の蠕虫を示すパネルCとDに対し、 previously saved supernatant を、蠕虫ホモジネート遠心分離機を用いて1.5 milliliterのプラスチック製遠心チューブに移します。

サンプルを 2,250 RPM、1300 Gs で 5 分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい 7 mL ガラスチューブに移します。ペレットは後のタンパク質定量アッセイに使用するため保存しておきます。

次に、サンプルのpH範囲が7～8になるまで、4通常の水酸化カリウムを上清に加えます。塩を除去するため、7 mLガラスチューブに入った中和済みサンプルを2,250 RPM（1,300 G）で5分間遠心分離します。各サンプルから上清を新しい7 mLガラスチューブに移します。これで、中和済みサンプルを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）によるメタボライト定量に向けて準備することができます。HPLCについては、

中和した各サンプルから50 µLを分注し、HPLCに直接注入します。遊離アミノ酸の定量は、アルデヒドによる前カラム誘導体化と蛍光検出を用いて行います。既報の通り、残りの中和サンプルは、次節に示すアミノ酸および有機酸の同位体濃縮度を決定するためのGCMS分析に向けて、イオン交換樹脂を用いた抽出に供します。

ビーズを調製するため、G1ビーズとG50ビーズにそれぞれ1N塩酸を加えます。1Lビーカーに入れ、マグネチックスターラーで各フラスコを30分間撹拌します。その後、洗浄液のpHが水のpHと等しくなるまで、脱イオン水でビーズを10回洗浄します。

次に、ガラスピペットを用いた低コストのカスタムカラムの作製方法を説明します。既製のカラムも市販されています。カラムを作製するには、ピンセットを使用してパストゥールピペットチップの最も狭い部分の直上にコットンプラグを挿入します。有機酸抽出にはG 1ビーズを、またG 50ビーズを使用します。

アミノ酸抽出を行う際は、各カラムの高さの約3分の1まで充填します。サンプルがすでに中性のpHである場合は、AG 1カラムに適用する前にサンプルに何も添加しません。アミノ酸抽出のために有機酸を抽出するには、AG 50カラムに適用する前に、サンプルに0.1 normal 塩酸を1 mL添加します。

previously prepared neutralized samples を各カラムに適用します。洗浄液が中性になるまで、各カラムを水で10回洗浄します。洗浄完了後、各カラムをラベル付きの新しい4 mLガラス試料バイアルに溶出させます。有機酸抽出の場合は、AG 1カラムに 3 N 塩酸を 3 mL 加えます。

これにより、3炭素種、4炭素種、5炭素種、および6炭素種の各炭素種における標識炭素の総数の同位体濃縮分析が可能になります。アミノ酸抽出のために、4 Nの水酸化アンモニウムを3 mL、G 50カラムに加えます。これにより、3炭素種および5炭素種における標識炭素の総数の同位体濃縮分析が可能になります。

有機酸とアミノ酸の両方の抽出が完了した後、サンプルバイアルを反応性アプリ3蒸発器に入れ、乾燥するまで一晩放置します。その後、サンプルを誘導体化し、プロトコルの本文に詳述されている通りにGCMSで分析します。まず、1,000匹の若い成体虫を、一様に13C標識されたグルコースとE. coliを含む実験用35 mm NGMアガープレートに移して、この手順を開始してください。

次に、蓋を外した実験用NGMプレートを、精密な雰囲気サンプリングと置換が可能な、密封された三方コック付きのカスタムガラスチャンバー内に設置します。光学的に透明なガラスディスクがプレートに乗るシール部分を、高真空グリースで覆います。

ガラスディスクでチャンバーを密封し、時間を記録します。これを0分とし、30分後に20 milliliter シリンジを用いて、三方活栓からガラスチャンバー内の雰囲気を10 milliliters サンプリングします。

チャンバーへのストップコックを閉じます。サンプリング後、サンプルを0.1 M水酸化ナトリウム中の1 mL重曹を含む赤管真空採血管に転送します。次に、三方停止コックを介してガラスチャンバーに10 mLの空気を注入します。20 mLシリンジを用いて、チャンバーへのストップコックを閉じます。大気を再注入した後、インキュベーションを再開する前に、60分、90分、および120分でガラスチャンバーから大気のサンプリングを繰り返します。

プロトコルの本文に記載されている通り、ガス比質量分析計を用いて、これらの大気中二酸化炭素サンプルのラベル化炭素濃縮度を分析します。ここでは、生きたOP 50 E. coliまたはUV照射で死滅させたOP 50 E. coliを餌として与えた虫体において、大気中の二酸化炭素および虫体内に溶解した二酸化炭素で測定されたラベル化炭素により、若成虫において安定同位体が2時間後に十分に取り込まれていることが示されています。13C二酸化炭素と12C二酸化炭素の比率は、放出された大気中の二酸化炭素分画と比較して、虫体内に溶解した二酸化炭素分画においてより高くなっていました。幼虫期から安定同位体に長時間曝露させ、その後、細菌を含まないNGMプレート上で虫体を洗浄することで、若成虫における遊離グルタマートの同位体濃縮度が増加することが観察されました。

このグラフにおいて、L1はL1幼虫期からYA（若成虫）段階まで、一様に$^{13}\text{C}$標識されたグルコースおよびOP50細菌を投与した虫を表し、YAは産卵第1日の若成虫段階に達してから48時間、$^{13}\text{C}$グルコースおよびOP50細菌を投与した虫を表しています。x軸は各グルタミン酸種の標識炭素原子の総数を示し、y軸は濃縮率（%）を示しています。すべての個体は、後続のサンプル調製前に過剰な同位体標識を除去しています。

GCMS分析において、緑色のバーは、PCA抽出前にNGMプレート上でOP 50 E. coliを2時間給餌して同位体曝露を行い、その後洗浄した虫を示している。青色と灰色のバーは、同位体曝露のタイムコースにかかわらず、PCA抽出前に細菌を含まないNGMプレート上でそれぞれ2時間または6時間同位体曝露を行い、その後洗浄した虫を示している。動物をプレート上で2時間または6時間洗浄した場合、中間代謝物の同位体濃縮に有意な差は見られなかった。

どちらの同位体曝露コースにおいても、未標識の細菌を2時間供給して動物を洗浄した場合、中間代謝物の同位体濃縮度は低下しました。したがって、同位体を含むNGMプレート上の細菌塗布状態で育成した線虫において、中間代謝物の濃縮率を最適化するための最適な洗浄プロトコルは、細菌を塗布していないNGMプレートでの2時間の洗浄であると決定されました。これは、細菌を含まない13C-グルコース（6個の炭素すべてを標識）を含む液体培地で24時間処理した後に行われました。

本図に示すように、超音波処理のみで破砕した虫サンプルと、超音波処理と研磨を併用して破砕した虫サンプルの比較を行いました。超音波処理と研磨を併用して破砕した虫は、超音波処理のみで破砕したサンプルよりも同位体濃縮度が高くなりました。最終的に、プレート上でのL1段階からの成長過程、または若齢成虫としての産卵初日から液体培地にて24時間、安定同位体前駆体を生存虫に投与しました。これにより、糖新生、ピルビン酸代謝、およびその後のトリカルボン酸回路におけるフラックスを示す代謝物の同位体濃縮度の高感度分析が可能になります。

この手法は、線虫（C. elegans）における中間代謝フラックスを探索するミトコンドリア疾患研究への道を切り開きました。このビデオを視聴することで、線虫における中間代謝の安定同位体プロファイリングおよび代謝フラックスの測定方法について、十分に理解することができるはずです。