開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）

次の実験の全体的な目標は、個々の代謝経路、遺伝的変化、および/または薬理学的治療によって引き起こされる解糖、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸回路内の動物全体でのリアルタイムの代謝変化を非侵襲的に監視することです。これは、安定同位体を生きた線虫に供給することで達成され、より多くの代謝産物に十分な同位体濃縮を提供し、中間代謝経路の遺伝的および/または薬理学的変化の定量を可能にします。第2のステップとして、大気中および溶存二酸化炭素中の同位体取り込みは、ガス比質量分析法によって測定され、短期間の中間代謝フラックスをより直接的に評価することができます。

次に、HPLCを用いた全線虫フリーアミノ酸分析、およびGCMSによるアミノ酸および有機酸の同位体濃縮による全線虫フリーアミノ酸分析のために、線虫の代謝フラックス変化を定量するためにサンプルを処理します。安定同位体曝露後、野生型線虫における同位体曝露の変動期間、細菌の除去、および代替線虫の混乱が中間代謝物の同位体存在量を調べる効果を示す結果が得られます。方法との戦争は、中間代謝に対する帆への洞察を提供することができます。

また、哺乳類の細胞株や組織などのシステムにも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、HPLCによる遊離線虫アミノ酸分析で一貫した異常が観察され、一次呼吸変化における中間代謝フラックスの障害を示唆する機能を観察したときでした。この手順を開始します。

発達中または成体期に安定同位体標識代謝前駆体に曝露された線虫は、1.5ミリリットルのプラスチック遠心分離管に集められます。通常、ワームを1ミリリットルあたり1000ワームの濃度に希釈します。イプシロンアミノカプロン酸を内部標準として含む60%perの塩素酸をワームに添加し、最終濃度が4%perの塩素酸および20ナノモルの内部標準液となるようにします。

ワームを重力で5分間沈殿させ、上清を取り出して別のチューブに保存します。次の手順は、この手順の最も重要な側面の 1 つです。フリー代謝物分析の前にスクリーニングすることにより、ワームを完全に破壊する必要があります プラスチックホモジナイザーと電動ドリルを使用して、ウォームサンプルを15秒間粉砕します。

光学顕微鏡でウォームの破壊を視覚的に確認し、必要に応じて粉砕を繰り返します。この画像では、パネルAとBは粉砕前のワームを示しています。パネルCとDがウォームを示すのとは対照的に、粉砕後に以前に保存した上清をワームホモジネート遠心分離機で1.5ミリリットルのプラスチック遠心チューブに移します。

サンプルは2、250 RPM 1300 Gで5分間。遠心分離後、上清を新しい7ミリリットルのガラス管に移します。ペレットは、後でタンパク質濃度アッセイで使用するために保存してください。

次に、サンプルのpH範囲が7〜8遠心分離機になるまで、4つの正常水酸化カリウムをSUPERNATに加えます。2、250 RPM 1300 Gで7ミリリットルのガラス管で中和されたサンプルを5分間 塩分を除去するには、各サンプルから上清を新鮮な7ミリリットルのガラス管に移します。中和されたサンプルは、高速液体クロマトグラフィーまたはHPLCによる代謝物定量、およびHPLC用のガスクロマトグラフィー、質量分析、またはGCMSによって調製できます。

中和された各サンプルを50マイクロリットルに分けて、HPLCに直接注入します。遊離アミノ酸の定量は、アルアルデヒドによるプレカル誘導体化および蛍光検出を使用して行います。前述のように、残りの中和されたサンプルは、次のセクションに示すように、GCMS用のイオン交換樹脂を使用して抽出され、アミノ酸と有機酸の同位体濃縮が決定されます。

ビーズを調製するには、GビーズとG50ビーズに1つの正常塩酸を別々に追加します。1リットルのビーカーで、各フラスコを磁気攪拌で30分間攪拌します。その後、洗浄液のpHが水のpHと等しくなるまで、ビーズを脱イオン水で10回洗浄します。

次に、ガラスピペットを使用してカスタムメイドの低コストカラムを調製する方法を紹介します。既製のカラムも市販されています。カラムを準備するには、鉗子を使用して牧草地のピペットチップの最も狭い部分のすぐ上に綿栓を挿入し、有機酸抽出用のG OneビーズとG 50ビーズを使用します。

アミノ酸抽出の場合は、各カラムをカラム高さの約3分の1まで充填します。サンプルがすでに中性のpHにある場合は、AG Oneカラムにサンプルをインプットする前に、サンプルに何も添加しません。有機酸を抽出してアミノ酸を抽出するには、0.1 個の正常塩酸を 1 ミリリットルサンプルに加えてから、AG 50 カラムに塗布します。

次に、以前に調製した中和サンプルを各カラムに適用します。洗浄が中性になるまで、各カラムを水で10回洗浄します。洗浄が完了したら、各カラムを新鮮なラベル付き4ミリリットルガラスサンプルバイアルに溶出します 有機酸抽出のために、AG 1カラムに3ミリリットルの3つの正常塩酸を加えます。

これにより、3つの炭素種、4つの炭素種、5つの炭素種、および6つの炭素種における標識炭素の総数の同位体濃縮度を分析できます。アミノ酸抽出には、3ミリリットルの4つの正常水酸化アンモニウムをa G 50カラムに加えます。これにより、3つの炭素種と5つの炭素種における標識炭素の総数の同位体濃縮度を解析することができます。

有機酸とアミノ酸の両方の抽出が完了したら、サンプルバイアルを反応性アプリ3の蒸発器に一晩置いて、乾くまで待ちます。その後、サンプルは der され、プロトコルのテキストに詳述されているように GCMS によって分析されます。この手順は、1,000匹の若年成虫を、普遍的に標識された炭素13グルコースと大腸菌を含む実験的な35ミリメートルNGMアグリプレートに移すことから始めます。

次に、実験用NGMプレートをカバーなしで置きます。カスタムガラスチャンバーには、密閉された3方向ストップコックが取り付けられており、正確な雰囲気のサンプリングと交換が可能です。光学的に透明なガラスディスクがプレート上にあるシールを高真空グリースで覆います。

チャンバーをガラスディスクで密封し、時間を記録します。時間ゼロとして、30分後、20ミリリットルの注射器を使用して、ガラスチャンバーの3方向ストップコックで10ミリリットルの大気をサンプリングします。

ストップコックをチャンバーに閉じます サンプリング後、0.1モルの水酸化ナトリウムに1ミリリットルの重炭酸ナトリウムが入った赤い浴槽の真空ガラス管にサンプルを移します。次に、3方向ストップコックを介してガラスチャンバーに10ミリリットルの空気を注入します。20ミリリットルのシリンジを使用して、ストップコックをチャンバーに閉じます 雰囲気を再注入した後、インキュベーションを再開する前に、ガラスチャンバーから60分、90分、120分で雰囲気のサンプリングを繰り返します。

ガス比質量分析計を使用して標識された炭素濃縮のためのこれらの大気中の二酸化炭素サンプルを分析し、プロトコルのテキストに記載されているように、安定した同位体は、大気中の二酸化炭素で測定された標識付き炭素によってここで証明されるように、若い成虫に2時間後によく組み込まれ、生きているか、UV照射されたOP 50 e大腸菌を供給されたワームの溶解したワームの二酸化炭素。炭素13二酸化炭素と炭素12二酸化炭素の比率は、放出された大気中の二酸化炭素と比較して、溶解したワーム二酸化炭素画分の方が大きかった。幼虫期からの安定同位体への長期曝露と、その後のNGM Aateでの寄生虫の除去により、若年寄生虫の遊離グルタミン酸の同位体濃縮が増加することが観察されました。

このグラフでは、L oneは、L one幼虫期から959細胞若年成人期YAまで、普遍的にラベル付けされた炭素13グルコースおよびOP50細菌を供給された線虫を表し、産卵若年成人期の初日に達した時点から48時間、炭素13グルコースおよびOP50細菌を供給された線虫を表しています。x 軸は各グルタミン酸種中の標識された炭素原子の総数を示し、Y 軸は濃縮率を示します。すべての動物は、下流のサンプル調製前に過剰な同位体標識を除去しました。

GCMS 分析の場合、緑色のバーは、PCA 抽出の 2 時間前に NGM プレートに OP 50 大腸菌を給餌することにより、同位体曝露後に除去された線虫を示しています。青色と灰色のバーは、同位体曝露の時間経過に関係なく、PCA抽出の2時間前または6時間前に、NGMプレート上で同位体曝露後に除去された線虫を示しています。中間代謝産物の同位体濃縮には、動物をプレート上で2時間または6時間透明にした場合、有意差は観察されませんでした。

両方の同位体曝露コースでは、動物を標識されていない細菌に2時間与えて除去した場合、中間代謝物でより少ない同位体濃縮が観察されました。したがって、同位体を含む細菌拡散N GMプレート上で増殖した線虫の最適な透明化プロトコルは、中間代謝産物の濃縮率を最適化するために、拡散していないNGMプレート上で2時間透明化することが決定されました。バクテリアを含まない1つの6炭素13グルコースを用いて液体培養で24時間治療した後。

この図に示すように、超音波処理のみまたは超音波処理と粉砕によって破壊されたワームサンプルの比較が行われました。超音波処理と粉砕によって破壊された線虫は、超音波処理によってのみ破壊されたサンプルよりも大きな同位体濃縮を有し、最終的に生きた線虫に安定同位体前駆体を供給するか、プレート上のL一段階からの開発中に、または卵の初日に開始し、液体培養物で24時間若年成人として産卵した。解糖系によるフラックスを示す代謝産物間の同位体濃縮の高感度分析を可能にし、その開発後のトリカルボン酸サイクルにおけるピルビン酸代謝

この技術は、ミトコンドリア病への道を開き、海の優雅さにおける中間代謝フラックスを探求するための研究を行っています。このビデオを見た後、安定同位体、中間代謝のプロファイリング、線虫の代謝フラックス、エレガンスの実行方法についてよく理解しているはずです。