Name: 開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans） /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学ぶ、Caenorhabditis elegansを用いた安定同位体プロファイルによる中間代謝フラックス解析法。ガス比質量分析とHPLC・GCMSで代謝変化を定量化し、ミトコンドリア病研究や他の生物系への応用が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、国立衛生研究所（K08 - DK073545とNICHDが支援する知的発達障害研究センター新奨励賞）、フィラデルフィア財団、およびペンシルベニア州マケイブ賞の大学（MJF）だけでなく、トリスタンの一部で賄われていたミューレン基金（MJFとMY）。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

中間代謝物の同位体存在度を測定する質量分析法を適用すると、重要な生化学的変化5の素晴らしく詳細な画像が得られる。ここで、我々は遺伝的に汎用性の高いモデル動物、Cで中間代謝フラックスを評価するために、この高感度および特定の方法論を活用するための詳細なプロトコルを提供しているエレガンス 。下流の代謝物の同位体濃縮を測定する際に実際に、安定同位体標識された代謝前駆体（例えば、13 C -グルコースのような）で生きている動物を餌と中間代謝経路のフラックスに新たな洞察を可能にします。我々は、解糖、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクルを通じてフラックスの堅牢な分析を得るために信頼性の高い方法論を開発した。これは、初期の幼虫の発育段階から安定同位体を与えられた動物や有糸分裂後の成人期に始まる両方達成することができます。以前に無料のワームのアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミンの異なる種の絶対的な同位体濃縮を決定するために、4を説明するように別の代謝産物の種の同位体濃縮は、高速液体クロマトグラフィーにより全体ワーム遊離アミノ酸のプロファイリングと一緒に勉強することができます。 1,000〜2,000若い成人同期ワームのアリコートでアミノ酸と有機酸の分析物を測定する際に実際に、同位体濃縮の一貫したパ​​ターンが得られる。そのような方法論は、敏感に、野生型ワームへの相対核遺伝子ベースのミトコンドリア変異株では異常な中間フラックスを区別することができます。 このテクニックは、代謝の一般的な先天との関連性の特定の生化学的経路に磁束の変化を調査するために値を保持します。特に、安定同位体で標識されたグルコースの利用率は、ミトコンドリア病との関連性の中心的な代謝経路を介して炭素フラックスを通知します。確かに、私たちのデータではそのような方法論の適用は、敏感に、野生型ワームへの相対核遺伝子ベースのミトコンドリア複合体IIIのサブユニット変異株（ISP - 1（qm150））における異常な中間フラックスを識別することができます示唆している。 同位体の暴露が数日に一つの期間に完了するので、細胞ベースのモデルで決定される可能性があるので、定量同位体濃縮が定義された期間にわたって、&quot;定常状態&quot;濃縮値ではなく、定量化可能なフラックスを表していることを認識することが重要です。数分から数時間の間、同位体にさらされる。線虫の開発の過程で経路のフラックスを問い合わせるの別の潜在的な制限は、特定の変異株で発生する幼虫の発育の長さが異なるにも関する。例えば、多くの重篤なミトコンドリアの変異は、サード（L3）幼虫のステージ6で停止を引き起こすことが知られている。従って、唯一の成人期まで生存する動物の同位体の取り込みの分析は、全​​体の変異体集団を代表できない場合があります。しかし、この方法論は、特定の幼生期（例えばL2など）ではなく、動物が成体段階に到達するのを待つで中間代謝物の同位体の取り込みを評価するために適合させることができる。同様に、dauerとして知られている別の幼虫期に入る動物はおそらく大幅にfour幼生段階を経て直接進む動物に（可能性低い）代謝フラックスの相対的に変更している。今後の研究はまた、直接の異なる遺伝的背景のdauer段階の動物の同位体の取り込みを評価するために行うことができた。動物は若い成人の段階に達すると開始一定時間（ここで、24〜48時間）のための安定同位体に動物を公開すること（のようなプロトコールBで詳述）変数発達期間の影響を除去。 13 C -グルコースのみが解糖、ピルビン酸代謝およびトリカルボン酸サイクルのフラックスに問い合わせをしながら、他の同位体トレーサーは、潜在的に線虫への関心の他の経路を介して生化学的経路のフラックスを調べるために評価することができます。例えば、15 N -グリシンは、線虫におけるアミノ酸の代謝回転を評価するために利用される場合があります。 このアプローチのもう一つの潜在的な制限は、代謝物の検出感度のレベルです。我々の経験は500​​若い成人の線虫の最小が正常にここで採用さHPLCとGC / MS法によって同位体の取り込みを定量化するために必要な示唆している。我々はこれが単一のワームから代謝物の種に代謝物と同位体の取り込みの信頼性の高い定量を許可する可能性は低い予想がこのような超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）のような高感度、と手段の利用、研究動物の数のさらなる削減を許可することがあります。我々は確実にそれぞれの菌株で低濃度の代謝物を検出するために見つけたの実験あたり1,000の動物のワームの集団を、研究。しかし、そのようなGABAのようないくつかの代謝物が、、唯一の確実のために、線虫のより大きな集団で定量することができる1 × 10 6匹4。 要約すると、安定同位体のプロファイリングは、長い先天性代謝異常を研究するために利用されている非侵襲的で安全な（非放射性）アプローチを提供します。 C.にこの方法論の適用線虫は、個々の遺伝性疾患および/ ​​または薬理学的エージェントの暴露に起因する生体 、全体の動物のレベルで発生するリアルタイム、代謝の変化、 で調査するために新たな能力を提供します。

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - 59ページ</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>プロトコル B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>プロトコル A および C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>プロトコル B</td></tr><tr><td>NGMアガー</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>プロトコル A、B、および C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C グルコース（全標識）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>プロトコル A および C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C グルコース（1,6位標識）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>プロトコル B</td></tr><tr><td>60% 過塩素酸 (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-アミノカプロン酸（内部標準）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>プロトコル E</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>プロトコル E</td></tr><tr><td>AG 1-X8, 100-200, 塩化物形樹脂</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>プロトコル A および B（有機酸抽出）</td></tr><tr><td>AG 50W-X8, 100-200, 水素形樹脂</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>プロトコル A および B（アミノ酸抽出）</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>プロトコル C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>プロトコル C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>プロトコル A</td></tr><tr><td>0.1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>ヘリウム</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>プロトコル C2</td></tr><tr><td>SMZ-800 ズーム実体顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>プロトコル A、B、および C</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>卓上遠心機 - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>インキュベートプラットフォームシェーカー</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>プロトコル B</td></tr><tr><td>Mini LabRoller ローテーター</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>ペッスル</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>ドリル</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>1 L ガラスビーカー</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>1 L 三角フラスコ</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 三角フラスコ</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>プロトコル B</td></tr><tr><td>7ml 丸底ガラスチューブ + ゴム栓</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>プロトコル A、B、および C1, C2</td></tr><tr><td>10 ml 丸底ガラスチューブ + ゴム栓</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>プロトコル C2</td></tr><tr><td>ブルーキャップチューブ</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 円錐形プラスチックチューブ</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>すべてのプロトコル</td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>プロトコル A および B</td></tr><tr><td>シリンジ（1 mL, 10 mL, 20 mL）</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>プロトコル C1 および C2</td></tr><tr><td>25ゲージ針</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>プロトコル C1 および C2</td></tr><tr><td>Poly-Prep クロマトグラフィーカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>パステゥールピペット</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>60mm ペトリ皿</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>プロトコル C</td></tr><tr><td>ガラスチャンバー（1 L フラスコの底をカットしたもの）、グリスシール3方コック付き</td><td>特注品</td><td></td><td>プロトコル C</td></tr><tr><td>光学的に透明なガラスプレート</td><td>特注品</td><td></td><td>プロトコル C</td></tr><tr><td>Reacti-Vap III エバポレーター</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>綿</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>高真空グリス</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>プロトコル C1</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>プロトコル B</td></tr><tr><td>タイマー</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>プロトコル C</td></tr><tr><td>ガス比質量分析計</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>プロトコル D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>プロトコル D</td></tr></tbody></table>

開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（caenorhabditis elegans）</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

安定同位体のプロファイリングが長い遺伝子の突然変異および/または細胞と哺乳動物モデルにおける薬物療法の代謝の結果の敏感な調査を許可しています。ここで、我々は線虫、 線虫（Caenorhabditis elegans）での中間代謝と代謝フラックスの安定同位体のプロファイリングを実行するための詳細な方法について説明します。様々な薬理学的治療にさらされたままの方法は、ラベル付けされた二酸化炭素は、標識有機酸、および若年成人のような線虫の増殖培地の寒天プレートまたは最初にどちらかの初期の開発から安定同位体に暴露された動物で標識されたアミノ酸は、全体のワーム遊離アミノ酸をプロファイリングするために記載されています液体培養インチ遊離アミノ酸は、4％過塩素酸で抽出された全体のワームのアリコートで、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量化されています。普遍的に13 C -グルコースまたは1,6のラベル- 13 C 2 -グルコースは、そのラベルの付いた炭素、二酸化炭素の質量分析法（大気および溶存両方）と同様の解糖を介して磁束を示す代謝物がトレースされる安定同位体前駆体として利用されている、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクル。代表的な結果は、同位体の露光時間、様々な細菌の決済プロトコル、および野生型線虫、ならびにとしてミトコンドリア複合体III変異体のワームの同位体の取り込みの相対的な範囲（ISP - 1（qm150）の代替ワームの破砕方法の効果を示すために含まれて）野生型ワームからの相対。生きている線虫における安定同位体プロファイルのアプリケーションは、個々の疾患の遺伝的および/または薬物療法によって引き起こされる全体の動物のレベルのリアルタイム代謝の変化に調査するために新たな能力を提供します。

中間代謝フラックスのガスクロマトグラフィー質量分析による安定同位体のプロファイリングは、線虫で説明されています<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;。メソッドは、二酸化炭素、有機酸、および開発中の寒天プレート上または液体培養における成人期のどちらかの同位体曝露後のアミノ酸の同位体濃縮を評価するために詳しく説明されています。

開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）</em

安定同位体プロファイリングは、...における遺伝子変異および/または薬理学的治療が代謝に及ぼす影響を感度高く調査することを長年可能にしてきました。

本実験の全体的な目的は、個々の代謝経路、遺伝的改変、または薬理学的処置によって引き起こされる、解糖系、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸回路における全動物レベルでのリアルタイムな代謝変動を非侵襲的にモニタリングすることです。これは、生存している線虫に安定同位体を投与し、より多くの代謝物に十分な同位体濃縮を行うことで、中間代謝経路における遺伝的または薬理学的改変の定量化を可能にすることによって達成されます。第二のステップとして、大気中および溶解した二酸化炭素への同位体取り込みをガス比質量分析法で測定し、これにより短期間における中間代謝フラックスのより直接的な評価を行います。次に、線虫における代謝フラックスの変化を定量化するため、HPLCを用いた全虫遊離アミノ酸分析、およびGCMSを用いたアミノ酸および有機酸の同位体濃縮分析を行い、試料を処理します。安定同位体への曝露後、野生型虫において、同位体曝露時間の変動、細菌の除去、および代替的な虫の破砕が中間代謝物の同位体存在量に及ぼす影響を示す結果が得られます。この手法により、中間代謝に関する知見を得ることが可能です。本手法は、哺乳類細胞株や組織などの我々の系にも適用可能です。もともとこの手法を考案したのは、HPLCによる遊離線虫アミノ酸分析において、一次呼吸機能の変化に伴う中間代謝フラックスの障害を示唆する一貫した異常を観察したときでした。それでは、本手順を開始します。発生期または成体期に安定同位体標識された代謝前駆体に曝露させた線虫を、1.5 mLのプラスチック製遠心チューブに回収します。通常、線虫の濃度が1 mLあたり1000匹になるように希釈します。内部標準としてε-アミノカプロン酸を含む60%過塩素酸を線虫に加え、最終濃度が4%過塩素酸および20 nMの内部標準となるように調製します。重力で線虫を5分間静置させた後、上清を取り除き、別のチューブに保存します。次のステップはこの手順において最も重要な工程の一つです。遊離代謝物の分析を行う前に、スクリーニングによって線虫を完全に破砕する必要があります。プラスチック製ホモジナイザーと電動ドリルの使用により、線虫サンプルを15秒間粉砕します。光学顕微鏡で虫体が破砕されたことを視覚的に確認し、必要に応じて研磨を繰り返します。この画像において、パネルAとBは研磨前の虫体を示しています。研磨後の虫体を示すパネルCおよびDとは対照的に、あらかじめ保存しておいた上清を1.5 milliliterのプラスチック製遠心チューブに移し、虫体ホモジネートを遠心分離します。サンプルを2,250 RPM、1,300 Gsで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい7 mLのガラスチューブに移します。ペレットは、後のタンパク質濃度測定で使用するため保存しておきます。次に、サンプルのpH範囲が7～8になるまで、上清に通常濃度の水酸化カリウムを4回分加えます。塩を除去するため、7 mLガラスチューブに入れた中和済みサンプルを2,250 RPM（1,300 G）で5分間遠心分離します。各サンプルの上清を新しい7 mLガラスチューブに移します。これで、中和済みサンプルを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）による代謝物定量に用いる準備が整いました。HPLCについては以下の通りです。中和した各サンプルから 50 µL を分注し、HPLC に直接注入します。遊離アミノ酸の定量は、アルデヒドを用いた事前誘導体化と蛍光検出を用いて行います。既報の通り、残りの中和サンプルは、次節に示すように、アミノ酸および有機酸の同位体濃縮度を決定するための GCMS 分析に向けて、イオン交換樹脂を用いた抽出に供します。ビーズを調製するために、1N 塩酸をG1およびG50ビーズにそれぞれ加えます。1Lビーカー内で、マグネチックスターラーを用いて各フラスコを30分間撹拌します。その後、洗浄液のpHが水のpHと等しくなるまで、脱イオン水でビーズを10回洗浄します。次に、ガラスピペットを用いた低コストのカスタムメイドカラムの作製方法を説明します。既製のカラムは市販もされています。カラムを作製するには、ピンセットを使用してパストゥールピペットチップの最も狭い部分の直上にコットンプラグを挿入し、有機酸抽出用のG 1ビーズおよびG 50ビーズを使用します。アミノ酸抽出には、各カラムの高さを約3分の1まで満たします。試料がすでに中性pHである場合は、AG 1カラムに適用する前に試料に何も添加しません。アミノ酸抽出のために有機酸を抽出する場合は、AG 50カラムに適用する前に、試料に0.1 normal 塩酸を1 mL添加します。あらかじめ調製した中和済みサンプルを各カラムに適用します。洗浄液が中性になるまで、各カラムを水で10回洗浄します。洗浄完了後、各カラムを、ラベルを貼った新しい4 mLガラスサンプルバイアルに溶出させます。有機酸の抽出を行う場合は、AG 1カラムに3 N塩酸を3 mL加えます。これにより、3炭素種、4炭素種、5炭素種、および6炭素種の各炭素種におけるラベル化炭素の総数の同位体濃縮度の分析が可能になります。アミノ酸抽出には、4 Nの水酸化アンモニウム3 mLをG 50カラムに加えます。これにより、3炭素種および5炭素種のラベル化炭素の総数における同位体濃縮度の分析が可能になります。有機酸およびアミノ酸の抽出が両方完了した後、サンプルバイアルを反応性アプリ3蒸発器に入れ、乾燥するまで一晩放置します。その後、サンプルを誘導体化し、プロトコルの本文に詳述されている通りにGCMSで分析します。まず、ユニバーサルラベル化された13CグルコースとE. coliを含む実験用35 mm NGMアガープレートに、1,000匹の若成虫の線虫を移すことからこの手順を開始してください。次に、カバーを外した実験用NGMプレートを配置します。これは、正確な大気のサンプリングと置換を可能にするために、密閉された3方コックを備えたカスタムガラスチャンバー内で行います。光学的に透明なガラスディスクがプレートに接するシール部分を、高真空グリースで覆います。ガラスディスクでチャンバーを密閉します。時間を記録してください。0分として、30分後に20 milliliterシリンジを用い、三方活栓からガラスチャンバー内の雰囲気ガスを10 millilitersサンプリングします。チャンバーへのストップコックを閉じます。サンプリング後、サンプルを0.1 M水酸化ナトリウム溶液中の一ミリリットルの重曹を含む真空レッドトップガラスチューブに移します。次に、三方コックを介してガラスチャンバーに10 mLの空気を注入します。20 mLシリンジを使用して、チャンバーへのストップコックを閉じます。大気を再注入した後、インキュベーションを再開する前に、60分、90分、120分でガラスチャンバーから大気のサンプリングを繰り返します。プロトコルの本文に記載されている通り、ガス比質量分析計を用いて、これらの大気中二酸化炭素サンプルのラベル化炭素濃縮を分析します。ここでは、生きたOP 50 E. coliまたはUV照射で死滅させたOP 50 E. coliを餌として与えた虫体において、大気中の二酸化炭素および虫体内の溶解二酸化炭素で測定されたラベル化炭素により、若成虫への安定同位体の取り込みが2時間後に十分に行われていることが示されています。炭素13二酸化炭素と炭素12二酸化炭素の比率は、放出された大気中の二酸化炭素と比較して、虫体内の溶解二酸化炭素画分でより高い値を示しました。幼虫期から安定同位体に長時間曝露させ、その後、細菌を含まないNGMプレートで虫体を洗浄することで、若成虫における遊離グルタメートの同位体濃縮が増加することが観察されました。このグラフにおいて、L1は、L1幼虫期から若成虫期の959細胞段階まで、普遍的に標識された13CグルコースおよびOP50細菌を給餌した線虫を表しています。YAは、産卵開始1日目の若成虫期に達した時点から48時間、13CグルコースおよびOP50細菌を給餌した線虫を表しています。X軸は各グルタミン酸種の標識炭素原子の総数を示し、Y軸は濃縮率（%）を示しています。すべての個体は、後続の試料調製前に、過剰な同位体標識を洗浄して除去しています。GCMS分析において、緑色のバーは、PCA抽出の2時間前にNGMプレート上のOP 50 E. coliを給餌して同位体曝露を行い、その後洗浄した虫を示しています。青色と灰色のバーは、同位体曝露の時間経過に関わらず、PCA抽出の前に細菌を含まないNGMプレート上でそれぞれ2時間または6時間同位体曝露を行い、その後洗浄した虫を示しています。動物をプレート上で2時間または6時間洗浄した際、中間代謝物の同位体濃縮に有意な差は見られませんでした。いずれの同位体曝露コースにおいても、動物に2時間、未標識の細菌を給餌して洗浄（クリアリング）を行った場合、中間代謝物における同位体濃縮度が低下することが観察されました。したがって、同位体を含む細菌塗布NGMプレートで育成した線虫において、中間代謝物の濃縮率を最適化するための最適な洗浄プロトコルは、未塗布のNGMプレートで2時間洗浄することであると決定されました。これは、細菌を含まない1個の6炭素13グルコースを含む液体培地で24時間処理した後に行われます。この図に示すように、超音波処理のみで行った破壊と、超音波処理に粉砕を加えた破壊による線虫サンプルの比較を行いました。超音波処理と粉砕を併用して破壊した線虫は、超音波処理のみで破壊したサンプルよりも高い同位体濃縮を示しました。最終的に、L1段階からのプレート上での発育中、または若成虫として液体培地中で産卵初日から24時間、安定同位体前駆体を生存線虫に投与しました。これにより、発育後の解糖系およびトリカルボン酸サイクルにおけるピルビン酸代謝のフラックスを示す代謝物の同位体濃縮について、感度の高い分析が可能となりました。この手法は、C. elegansにおける中間代謝フラックスを探索するミトコンドリア疾患研究への道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、線虫C. elegansにおける中間代謝の安定同位体プロファイリングおよび代謝フラックスの測定方法について十分に理解することができます。

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

線虫を維持し、伝播の容易さ...

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

私たちは、勉強のための堅牢な生化学的および顕微鏡的手法を提示...

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

タンパク質の恒常性、ストレス、老化の関係を研究するために、遺伝的に扱いやすい後生動物Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegansをモデル系として使用して、多細胞生物におけるタンパク質恒常性を研究する

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ...

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート...

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。...

そのまま線虫の酸素消費量の測定

プロテオスタティック低下は老化の特徴であり、神経変性疾患の発症を促進する。我々は、蛍光レポーターに融合したポリグルタミン反復の異種発現を通じて、2つの異なる カエノールハブディティス・エレガン...

カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

本研究は、C.エレガン複合体I病ガス-1(fc21)ワーム、すなわちZebraLab(中スループットアッセイ)とWormScan(ハイスループットアッセイ)における2つの半自動運動活動分析アプローチのプロトコルを提示し、ネマトデ挙動と統合神経筋機能を定量化するための広範な研究方法の間で比較分析を提供する。...

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫...

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

このプロトコルは、液体培養中の細菌のクリアランスの測定に基づいて 、線虫の...

細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

学ぶ、Caenorhabditis elegansを用いた安定同位体プロファイルによる中間代謝フラックス解析法。ガス比質量分析とHPLC・GCMSで代謝変化を定量化し、ミトコンドリア病研究や他の生物系への応用が可能です。

開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）

さらに動画を探す