ストレス誘発細菌から単離した(p)ppGppヌクレオチドの薄層クロマトグラフィーに基づく分離

ストレス誘導の前後に細菌培養物から得られた放射性標識ヌクレオチド抽出物から始めます。

ストレス下では、細菌酵素はグアノシン三リン酸とグアノシン二リン酸をストレス誘発ヌクレオチドであるグアノシン五リン酸とグアノシン四リン酸に変換します。

固定相としてカチオン性ポリマーで事前にコーティングされた薄層クロマトグラフィープレートに抽出物をスポットします。

移動相として緩衝液を含むチャンバーにプレートを置き、液体がスポットの下にとどまるようにして早期拡散を防ぎます。

毛細管現象によって緩衝液を上昇させ、負に帯電したヌクレオチドを電荷とサイズに基づいて異なるバンドに分離します。

現像後、プレートを取り外し、自然乾燥させ、上部をトリミングして遊離同位体を除去し、バックグラウンド信号を低減します。

プレートを放射線に敏感なスクリーンにさらして、放射性信号を検出します。

ストレス誘導後の四りん酸グアノシンと五りん酸グアノシンの濃度の増加はグアノシンヌクレオチドプールの動的シフトを明らかにする

まず、20 x 20センチメートルのPEIセルロースTLCプレートをセットします。

はさみで上部の5センチを取り除き、柔らかい鉛筆で端から1センチの原点線に印を付けます。各サンプルの5マイクロリットルの液滴をPEI表面に塗布します。

スポットが乾く前に、プレートを原点サンプルスポットに触れないほど浅い1.5モルのリン酸一カリウムの層を含むタンクに移します。タンクを気密シールで覆い、15センチメートルのトリミングシートの上部まで液体を上昇させます。この後、完全に現像したクロマトグラムを取り出し、室温で自然乾燥させます。

遊離P32を含むクロマトグラムの上部を切断し、放射性廃棄物に廃棄します。蛍光体スクリーンを使用して、オーディオX線撮影フィルムを一晩露光します。翌日、フィルムを現像し、蛍光体イメージャーを使用して蛍光体の緑色の信号を捕捉して定量します。

次に、ImageJソフトウェアを使用して放射性スポットを定量します。