がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

こんにちは、私の名前はケン・パラディソです。私は、ベセスダキャンパスのNIHにある国立神経疾患研究所および脳卒中学内プログラムでLing Gang Wuのために働いています。私はあなたにcalyがシナプス前録音パッチクランプを保持しているためのテクニックを紹介するつもりです。

だから準備するために 脳組織、ラットから脳を取り出します。この溶液の中は、氷のように冷たく、カルシウムの少ない溶液で、常に脳に酸素が供給されるように、カルボゲンで泡立ちます。また、ダメージの量を最小限に抑えるために、DAを最小限に抑えるために氷のように冷たくなければなりません。

ですから、脳は今、この解決策の中にいることになります。私たちはそれを取り出し、適切にカットしてブロックに載せ、サノコレまたはクレイジーグルーでブロックに取り付けますが、その後チャンバーを氷冷した低カルシウム溶液で満たし、泡立ててバイブレーターに置き、厚さ180〜190ミクロンでスライスを70ヘルツの周波数ブレード周波数と0.01〜0.02ミリメートルの前進速度でカットします秒。つまり、毎秒10〜20ミクロンになります。

各スライスが作成されたら、氷冷した生理食塩水からスライスを、通常のカルシウム溶液を含むこのチャンバーに移します。これは、私たちが記録しているのと同じ溶液で、生理学的温度が37度です。次に、回復のためにスライスをここに入れます。

生理学実験が実行される前に、30分から1時間ここにとどまります。だから、ここには脳があり、それを解決策から引き出すつもりです。つまり、これはデモンストレーション用の大きな脳なのです。

これはP 20ラットからのものです。ひっくり返します。私たちが興味を持っているのは脳幹です。

つまり、このエリアと萼が保持しているのは、まさにそのエリアのすぐそばにあるということです。そこで、これから行うことは、脳の残りの部分を切り取り、脳幹を分離し、スライスチャンバーのために脳幹を準備することです。では、脳の残りの部分を切り取り、脳幹を分離します。

私たちがどこにいるのかを示すために、それを裏返します。通常、私たちはこのようにはしませんが、繰り返しになりますが、その部分全体を取り除くことができます。裏返すと、脳幹が分離され、そこで別のカットを行うだけです。

さて、これで完了です。それが脳幹です。開催の萼はすぐそこらです。

これが脳幹です。繰り返しになりますが、少し押し戻します。小脳の片側を切り取り、脳幹をこのように横向きに座らせるようにします。

佐野アクリルのりを少し入れ、横に置いたまますぐに冷たい氷、冷たい低カルシウム溶液で満たします。できるだけ早く酸素ラインをそこに入れてください。今度はそれを拾い上げて、ビブラートに持っていきます。

脳の始まりに到達するために速く取り込み、脳の始まりに到達すると、速度を毎秒0.01ミリメートルに落とします。つまり、毎秒10マイクロです。ですから、信じられないほどゆっくりと動いています。

脳の最初の部分は、台形体の内側ナイルズであるmtbを持つ部分です。そして、それが入っている部分なので、トランスファーピペットに入れたら、できるだけピペットの先端に近づけるようにしています。そして、脳のスライスがあり、私はそれをかなり迅速にこのチャンバーに移しますが、そこには正常なカルシウムレベルとより高い温度の標準的な記録溶液が含まれています。

そして、これにより、生理学実験から準備が整ったスライス手順の後にスライスが回復します。さて、ここから先は、同じことが何度も繰り返されることになります。次の機器は、パッチクランプを行うために使用するものです。

固定ステージの正立顕微鏡があります。ステージは固定されているので、顕微鏡はマニピュレーターの上からその下を移動します。ウィッグとNewmanマイクロマニピュレーターを使用してステージを保持し、アンプのヘッドステージはHECAのEPC10パッチクランプアンプを使用しています。

そして、私が言及すべきだったのは、DICを赤外線で使用していることです。ここにはIRカメラがあり、CAEを探しているときには、見るものすべてが画面に表示されます。パッチクランプアンプは、パルスと呼ばれるこのソフトウェアによって制御され、これもHecaからであり、アンプと生理学実験のすべてを制御します。

この画面に結果が表示されます。保持している萼は大きなシナプス前末端であり、大きいため、物理的に終末にパッチを当てることができます。そのため、シナプス前録音を行うことができ、これは特に中枢神経系ではユニークなことです。

これにより、シナプス前に活性化されたカルシウムチャネルを測定できるようになったのです。また、がくにつながる神経を刺激したい場合、活動電位活動を測定することもできます。この研究室では、神経伝達物質を含む小胞と膜との融合であるエキソサイトーシスと呼ばれるプロセスを測定しています。

さて、これらの小胞はエキソサイトーシスと呼ばれる過程で膜と融合し、シナプス末端に膜を追加し、それを静電容量の変化として測定することができます。末端に膜を追加すると静電容量が増加しますので、今日紹介する実験は、膜が除去されたときのシナプス前の静電容量測定です。ですから、メンブレンをただ追加し続けるわけにはいかず、もちろん一部は取り除かなければなりません。

このプロセスは、エンドサイトーシスまたは膜の取り込みと呼ばれます。また、それを測定することもでき、それは静電容量レベルの減少として測定されますので、その例は後でお見せします。これにより、カルシウムチャネルの活性をモニターし、エキソサイトーシスやエンドサイトーシスに関与するタンパク質の一部をモニターして研究することができます。

エクソサイトーシスやエンドサイトーシスに関与するタンパク質をブロックするためのペプチドのようなものを入れることができます。同じことをする毒素を使用することもできます。また、終末に流入するカルシウムの量を調整することもできるので、エキソサイトーシスのプロセス、神経伝達物質の放出、そしてそのイベントに続く膜の取り込みを実際に研究することができます。

これが当社の細胞内記録液が入ったチューブです。私たちはそれを事前に準備し、それからそれを凍結します、そして私たちは通常、新しい解決策を作る前に数週間から1ヶ月使用することができます。繰り返しになりますが、レコーディングを行う直前に考えたのですが、チューブには常に一定量のダスト粒子やその他の種類の破片が

次の 2 つのいずれかを行うことができます。溶液を取り出してろ過するか、1〜2分間回転させてから溶液を引き抜き、底部に破片やその他の材料が残っている可能性があります。だから私はそれを回転させることを好みます、そして私は今それをします。

これが私たちの細胞内溶液が入ったチューブです。解凍されています。小さな遠心分離機で約2〜3分間スピンダウンしますが、それで溶液から大きな粉塵粒子を取り除くのに十分なはずです。

だから今は、紡いだばかりの溶液の上部を引き抜き、攪拌しないように注意しながら、きれいなチューブに移し、約90%を引き抜くだけです。私は二度としないようにしています、その最後の少しを取得します。だから、私はここでやめます。

これをすぐに氷の上に置いて、実験中も冷たく保つようにしました。これは非常に重要です。これは、これは私たちのピペットの一つです。

これを細胞内記録に利用しています。厚肉のボアシリカガラスで、外径は2ミリメートル、内径は1.16ミリメートルです。まず、ピペットを埋め戻します。

そこで、吸引力を注ぎ、ピペットを録音液に入れ、吸引力を加えてピペットの先端を埋めようとしますが、そうでなければ他の方法では満たされません。それが終わったら、キャピラリーチューブを取り、ピペットの裏側を取るだけで電極の残りの部分を充填します。これは標準的な生理学のテクニックであり、文字通りそれをはじきます。

ピペットの端が壊れる危険性がありますが、そうしないと気泡が発生することがよくあります。さて、今度はパッチプラントアンプのヘッドステージに接続されているピペットホルダーに取り付けます。そこには塩化銀のワイヤーがあります。

塩化銀線は細胞内溶液と接触し、シナプス前末端の電気的活性を測定することができます。そこで、私たちが行うことは、多くのCAEを含むスライスを見つけることです。CAEの高密度化が欲しい。

つまり、台形体の内側核、つまりMNTBを探しており、そこから、支持された萼を形成する末端、または萼アプリである萼がどのように見つけられるかです。そこで、スライスのスキャンを開始します。例えば、地表から少し深いところに萼があり、パッチを当てるものがあまりないので、私たちはただ私たちを横切ってスキャンし続けます。

だから、これは私たちが目指しているのがここです。私が作ったのは、ピペットが行く場所である画面上の2つのマークです。そして、ピペットが落ちてくると、私が行くことになる萼片があることがわかります。

萼に押し上げるように陽圧をかけ、その後、陽圧を和らげます。その後、萼がピペットを押し上げ、その時点で非常に穏やかに吸引し、メンブレンを吸って押したり、メンブレンをピペットの先端に密封したりしようとします。よし、正圧が和らいだ。

そして今度は吸引を当てます。つまり、ここではプロとして、5ミリボルトのパルス、または実際には4ミリボルトのパルスを適用しています。さて、これで完了です。大丈夫です。

次に、膜電位をマイナス80に下げ、高速過渡ブームをキャンセルします。今度は、全細胞で行っていきます。やさしく吸引して、卸売りをしてみます。

これらの帯電トランジェントは、彼がピペットとセルが連続していることを示しています。これも美しいショットです。つまり、明るい赤色は静電容量のトレースで、突然のジャンプがあり、その後減少したことがわかります。

さて、私はちょうどあなたががくで支持されたシナプス前終末から録音を得るための基本的なテクニックを示しました。台形体の内側核を含むスライスを作成する方法を示しました。そこには、萼が保持されているのがわかります。

そして、スライスを見るためのテクニックをお見せしました。各スライスを調べて、表面にあるケラの数が最も多いスライスを探します。次に、見つけることができる最大のcaly膜を探し、その上にクランプレコードをパッチします。

また、パッチクランプ録音のテクニックも紹介しましたが、これらは標準的なパッチクランプ録音技術です。