GFPタグ付けSKN-1を用いた C. elegans における病原体誘発性酸化ストレスの可視化

まず、緑色蛍光色のタンパク質標識されたSKN-1を発現させる C. elegans の線虫を2枚のプレートから始めます。これは腸の細胞質に局在する転写因子です。これらの寄生虫には自己蛍光を示す腸内リポフスシン顆粒も含まれています。

一方のプレートは非病原性細菌を対照群として、もう一方は病原性細菌をテスト基としてシードします。

試験群では、病原体が産生する過酸化水素が酸化ストレスを引き起こし、SKN-1を腸核への転座を引き起こします。

対照群では、SKN-1の大部分が細胞質内に広まって分布しています。

各プレートをバッファーで洗い、ワームをチューブに移します。

遠心分離機でワームを分離し、バッファーを取り除きます。

麻酔のためにアジ化ナトリウムを含む培地を加えます。

ミミズをアガロースパッドに取り付け、カバースリップを置き、蛍光顕微鏡で観察します。自己蛍光を使って核の境界を可視化します。

検査中の強い核SKN-1シグナルは対照群の拡散細胞質シグナルに対して見られ、核の再局在化を示し、病原体誘発性の酸化ストレスを裏付けます。

ピペットを使い、THYの連鎖球菌シードプレートとNGM 大腸菌 シードプレートに約100匹のL4幼虫を追加します。細菌株ごとに3枚のプレートを使いましょう。

プレートを25度Cで2〜3時間孵化させます。その後、インキュベーターからプレートを取り出します。M9Wで洗い、15ミリリットルの円錐形チューブにミミズを集めます。

遠心工程で行ったようにミミズを3回洗います。M9Wの大部分を吸引で外してください。そして、麻酔用に2ミリモラーアジドナトリウムまたはテトラミソール塩酸塩を含むM9Wを500マイクロリットル追加します。

チューブをミミズペレットと共に室温で15分間孵化させます。次に、準備されたアガロースパッドに15マイクロリットルのミミズ懸濁液を落とします。蛍光顕微鏡下で、FITCおよびDAPIフィルターを用いてSKN-1の局在を観察します。

イメージワームは10倍と20倍の倍率で見られます。ミミズの評価は3つの局在化レベルに基づいて評価します。低局在(核の局在が見られない)、中局在(SKN-1 BCGFPが線虫の前方または後方)、高局在(全ての腸細胞で核局在が観察される)です。