ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

この手順の全体的な目的は、Corning Hypersスタック容器を閉鎖系として正しく使用する方法を実演することです。まず、重力供給法を用いて容器に培地を充填し、接種を行います。次に、各層に細胞懸濁液を分離させ、細胞をインキュベートします。

インキュベーション後、使用済みの培地を除去します。手順の最終ステップとして、hypers stack 容器から細胞を回収します。最終的に、hypers stack 密閉システムを使用した際に、細胞が共流的に増殖する過程で酸素を取り込む能力を示すガス拡散結果を得ます。

ガス透過性材料を用いたhypers stack vesselの主な利点は、細胞増殖のための表面積を拡大できることです。容器内のヘッドスペースをなくすことで、同僚のp pardoがhypers stack vesselを用いた閉鎖系プロトコルについて実演します。hypers stack vesselは、トッププレートとガス透過性フィルムで構成される個別の細胞培養コンパートメントであるstatで構成されています。

細胞はこのコンパートメント内で培養されます。液体マニホールドは、モジュール内の各ette層を互いに接続します。モジュールはチューブで接続され、12層の倍数で構成される容器を形成します。

マニホールドにより、ユーザーは容器全体に対して一度の流体操作を行うことができます。エアマニホールドは各静止層（stat layer）を接続していますが、流体添加時に容器から空気を追い出すために使用され、層間の充填時に使用する充填ラインを備えています。静止層は気管腔（tracheal space）と呼ばれる開放的な空気空間であり、各層のガス透過性フィルムを通じてガス交換が行われます。

液体ハンドリングチューブは液体マニホールドに接続されており、無菌性を維持しながら余分な空気を放出させ、閉鎖系でのすべての液体操作を行うために使用されるカスタマイズ可能なコンポーネントです。ベントチューブが使用されます。ベントチューブはエアマニホールドに接続されており、エアフィルターを備えています。

液体ハンドリングチューブには、容器への充填後にチューブ内の液体を排出するためのチェイスチューブとフィルターが接続されています。また、本プロトコルでは、使用中に容器を正しい位置に配置するのを補助するハンドリングデバイスであるCorning Stack manipulator（CSM）を使用します。本デモンストレーションでは、ガス透過性のある36層容器を用いた密閉系細胞培養について解説します。

ただし、CSMを使用する場合、フィリングウェッジを用いて12層の容器でこの手順を行うための詳細は、付属の書面プロトコルに記載されています。まず、メディアチューブに接種する前に、3.9 litersのバッグ入り培地を準備します。血清バッグを培地バッグに接続し、十分に混合して目的の血清濃度にします。

大型のバッグクランプを使用して、バッグ内の培地約300 millilitersをクランプして遮断します。これにより、充填時に接種されたすべての細胞が使用され、培地バッグ内に細胞が残らないようにします。培地をバッグスタンドに設置し、培地に接種を行います。

チューブが装着されたシリンジに細胞懸濁液を満たします。細胞懸濁液が入ったシリンジを、チューブウェルディングによって培地バッグに接続します。シリンジからバッグまでのチューブの長さは16インチにします。

細胞懸濁液を培地バッグに注入し、よく混合します。接種済みの培地バッグは、チューブ溶着または汎用コネクタを使用して、装置の3/8インチ液体ハンドリングチューブに接続できます。今回はチューブ溶着を使用します。

容器の液体ハンドリングチューブおよびチェイスチューブのクランプを閉じます。36層容器をCSMのロードポジションに設置します。ベントフィルターチューブをCSMの保持クランプに掛けます。

蓋をしっかりと締め、CSMを満たし位置に移動させてエアフィルターを最高位置に配置し、充填操作中の浸水を防ぎます。また、10度の角度をつけることで、充填時に充填ラインから空気を追い出し、液体の層への平衡化を可能にします。チェイスチューブのクランプを閉じたまま、培地バッグを容器と同じ高さに配置してください。

液体ハンドリングチューブのクランプと培地バッグのクランプを開き、液体が容器内に流入するようにします。バッグスタンドを使用して培地バッグを高く上げ、細胞懸濁液が容器に流れ込むのを促進します。接種用培地がすべて容器に入るまで充填してください。

培地バッグの上部には、まだ300 millilitersの培地が残っているはずです。液体が上部エアマニホールドに近づいたら、培地バッグからクランプを取り外し、容器への充填を続けます。過充填を防ぐため、培地バッグを下げることで充填速度を遅くしてください。

液面をゆっくりと充填線まで上げ、液体ハンドリングチューブをクランプします。CSM内の容器をアイソレーションポジションまで移動させ、両方のマニホールドセットを最高位置に配置します。培地バッグを容器の高さより低い位置まで下げます。

チェイスフィルターを垂直に保持した状態で、チェイスチューブクランプを開きます。これにより、液体ハンドリングチューブ内の培地が培地バッグへと排出（チェイス）されます。チューブ内が空になったら、培地バッグ側チューブのクランプを閉じます。

チェイスチューブフィルターを垂直に保持します。容器の液体ハンドリングチューブのクランプを開き、残っている液体が容器内に流入して平衡状態になるようにします。これが完了するまで1〜2分間待ちます。

次に、マニホールドが左側にくるようにCSM内の容器を回転させます。容器をCSMのロードポジションまで下げます。チェイスチューブと液体ハンドリングチューブの両方のクランプを閉じます。

培地バッグを容器から取り出しても構いませんし、後の回収工程で使用するために取り付けたままにすることも可能です。取り付けたままの培地バッグを保管する場合は、バッグを丸めて容器の保管トレイにある固定バンドの下に配置してください。最後に、容器をインキュベーターに移動させます。容器を運ぶ際は、エアベントフィルターに液体が入らないよう注意してください。

これは、マニホールド端をわずかに上向きに傾けることで達成されます。回収手順を開始するには、細胞結合溶液チューブとクエンチバッグを溶着させ、回収バッグアセンブリを形成します。その際、すべてのチューブクランプが閉じていることを確認してください。容器をインキュベーターから取り出し、CSMのロードポジションに設置します。

固定バンドの下から培地バッグを取り出し、バッグスタンドに掛けます。その横に立ち、蓋を締めて容器を固定します。ベントチューブを保持クランプに掛け、CSMを満充填位置に移動させます。

バッグスタンド上の培地バッグが、容器よりも低い位置に吊り下げられていることを確認します。培地バッグのチューブおよび容器の液体ハンドリング用チューブのクランプを開き、培地が接続されたバッグに流れ込むようにします。容器が約4分の3空になったら、CSMの設定を最終的な空の状態（empty position）に変更します。

容器と液体ハンドリングチューブの中身が空になったら、チューブを持ち上げて、廃培地バッグチューブのクランプを越えて培地を押し出します。その後、液体ハンドリングチューブのクランプと廃培地バッグチューブのクランプの両方を閉じます。チューブ溶着により、廃培地バッグを回収バッグアセンブリに交換します。

バッグスタンドを使用して、細胞解離バッグアセンブリの高さを容器よりも高く上げます。CSMを充填位置に配置します。細胞解離溶液チューブのクランプと回収バッグアセンブリのクランプを開き、溶液を容器に転送します。

移送が完了したら、液体ハンドリングチューブと細胞解離溶液チューブのクランプを閉じます。次に、水平位置決めレバーを開いたまま、CSMをロード位置まで移動させます。ホイールを使用して容器を左右にゆっくりと揺らし、溶液を細胞層全体に行き渡らせます。

溶液を均等に分散させ続けるため、ロッキング操作中に容器を時々充填位置に戻す場合があります。溶液が十分に分散したことを確認したら、CSMのレバーを放して充填位置で固定します。細胞に必要な解離時間の間、容器はこの位置に保持してください。

濁度を指標として細胞の剥離を確認します。剥離後、CSMをロード位置に移動させます。クエンチバッグのクランプと液体ハンドリングチューブのクランプを開き、クエンチ培地を容器内に導入します。

液体ハンドリングチューブのクランプを閉じます。移送が完了したら、CSMをロード位置に戻し、水平位置決めレバーを保持して容器側を左右に揺らします。バッグスタンドを使用して、回収バッグアセンブリの位置を容器のレベルより下に下げます。

CSMを空の位置に調整します。ベッセル液体ハンドリングチューブクランプを開き、細胞溶液をクエンチバッグに戻します。CSMをロード位置に戻し、チューブシーラーを用いて、ハーベストバッグアセンブリをベッセルから切り離します。

これで、細胞溶液を従来の細胞培養システムで処理する準備が整いました。ヘッドスペース（Headspace）法では、培地中の酸素は3日間で平均50%消費されます。培養において、この数値は同一の培養システムにおける細胞レベルでの酸素濃度の経時的な減少（mg/L）を示しており、培地高さ3 mmにおける酸素勾配は、細胞層よりも培地とヘッドスペースの接合部においてほぼ50%高くなります。

細胞増殖中のハイパースタックの気管スペースにおける酸素濃度（％）を示す。この図から、各ガス透過性フィルムボトムに供給される層間の酸素濃度が、96時間にわたって一定に保たれていることがわかる。これは、細胞がコンフルエントになるまで、増殖過程で酸素を利用できることを示している。

このビデオを視聴することで、クローズドシステムにおけるCorning Hypersスタック容器への充填および回収方法について十分に理解することができます。