Name: ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶガス透過性材料を用いたHYPERStack培養容器のクローズドシステム細胞培養法。重力供給法による培地充填と効率的な細胞回収技術を解説し、汚染リスク低減と高収率培養を実現する方法を紹介します。

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著者らは、クローズドシステムの知識、バッグのデザイン、バッグシーラーや溶接機のローンだけでなく、HYPERStackの回路図に袋を作成すると彼らの支援についてロンザウォーカーに感謝します。

1。 HYPERStack容器 - ガス透過性材料技術の背景<ol><li> HYPERStack容器は、細胞代謝のために76.2micronガス透過性高分子膜を介してガス交換に依存している細胞の閉鎖系培養のための多層容器です。 </li><li> HYPERStack容器は、容器内の細胞を上記の"ヘッドスペース"を持っていないという点で、従来の細胞培養容器とは異なります。むしろ容器内のガス交換のためのこの"ヘッド"を含むより、ガス透過性の製品は大気に開放されている各培養チャンバーの下に空気のスペースを（"気管"のスペースと呼ばれる）がある。 </li><li>この気管スペースは、同等のガス交換を持っている容器の各細胞培養室で増殖する細胞を可能にします。 </li><li>ガス透過性フィルムは、無菌環境を維持しながら、ガス交換が発生することができます。複数の層のそれぞれについて、すべての流体の操作は、単一のエントリのポートを介して行われる。 </li></ol> 2。 HYPERStackの船舶のコンポーネントの概要<ol><li> Stacketteは、トッププレートとガス透過膜で構成されている個々の細胞培養のコンパートメントです。細胞は、このコンパートメント内で培養される。 </li><li>液体マニホールドはHYPERStackモジュール内で一緒に12 stacketteの層のそれぞれを接続します。モジュールは、12層の倍数で血管を形成するために配管で接続されています。マニホールドは、ユーザーが全体の容器に一つの流体操作を行うことができます。 </li><li>エアマニホールドはまた一緒にstacketteの層を接続しますが、それは流体の追加が発生したときに容器から空気を置換するために使用。それは、充填時に使用する上限ラインが含まれています。 </li><li>気管スペースには、ガス交換は、各レイヤー"ガス透過膜を介して行うことが可能なため、各stackette層との間にオープンエアの空間です。 </li><li>液体ハンドリングチューブを液体マニホールドに接続され、すべてのクロー​​ズドシステムの流体操作を行うために使用されます。このコンポーネントは、カスタマイズすることができます。 </li><li>ベントチューブは、空気マニホールドに接続してエアフィルタが含まれており、無菌性を維持しながら、余分な空気を解放するために使用されています。 </li><li>チェースチューブは、フィルタとクランプがあり、液体ハンドリングのチューブに接続されており、容器に充填した後、液体ハンドリングチューブからの流体を排気するために使用されます。 </li><li>コー​​ニングのスタックマニピュレータまたはCSMは、使用中に正しい位置に船を置くことを支援するためのハンドリング装置です。 </li><li>充填ウェッジは、手動でHYPERStack容器に充填する際に使用するステンレス鋼アシストです。 </li></ol> 3。 HYPERStackの船舶に使用されるガス透過膜を介してガスの拡散の結果<ol><li>ベントヘッドスペースと伝統的な細胞増殖のシステムでは、メディア内の酸素は、培養の3日間で50％の平均を消耗しています。 （図1） </li><li>同じ細胞増殖システムでは、メディア3mmの高さで酸素勾配は、細胞層にあるよりも、ヘッドスペースの接合部へのメディアではほぼ50％大きくなります。 （図2） </li><li> 76.2micronのガス透過性のポリスチレン膜を介して酸素の拡散は、メディアの2.6ミリメートルを介して拡散に等しいです。 HYPERStack船で使用されるガス透過膜は、ガス交換は、細胞層で発生することができます。 </li><li>細胞がコンフルエントに成長するにつれてHYPERStack船の気管空間における酸素の％は一定に保たれます。 （図3） </li></ol> 4。メディアバッグの準備<ol><li> HYPERStack - 12層の血管は、メディアの1.3Lを受け取り、HYPERStack - 36層の血管は、メディアの3.9Lを取ります。 </li><li>前に袋詰めメディアを接種するために血清を使用する場合、チューブはメディアの袋に血清袋を溶接してよく混ぜる。 </li><li>大きなバッグのクランプを使用してバッグ内のメディアの約300 mLをオフクランプ。これは、すべての接種した細胞を充填し、どれもメディアの袋に残っていない時に使用されるようになります。袋のスタンドにメディアの袋を置きます。 </li></ol> 5。接種メディア<ol><li>細胞懸濁液を取り付けたチューブと注射器を埋める。チューブ溶接3 / 16"メディアのバッグに細胞懸濁液を含む注射器からチューブ。 </li><li>メディアのバッグに細胞懸濁液を注入し、よく混合する。 </li></ol> 6。手順を埋める<ol><li>チューブはHYPERStack容器の3 / 8"液体ハンドリングのチューブに接種したメディアの袋を溶接。（無菌接続するか、多目的で接続する（MPCは）を使用して、また容器へのメディアの袋を添付することができます）。 </li><li> HYPERStackで液体ハンドリングとチェースチューブのクランプを閉じます。 </li><li>フックベントフィルターチューブCSM上に保持するクランプに、負荷の位置でCSMにHYPERStack 36レイヤの容器を置きます。蓋を締めて、塗りつぶしの位置にCSMを移動する。正しい充填位置に容器を入れて、エアフィルターは、格納操作中に濡れを防ぐために、最も高い位置に今である。 10 °の角度許可equilibr充填時の層への液体について注意深く検討する必要があります。充填ウェッジで、その側に置かHYPERStack - 12層の容器は、充填のための正しい位置にあります。 </li><li> HYPERStack容器（より高いではない）と同じレベルに袋を置いて充填ラインから澄んだ空気。チェースチューブクランプを保つことは閉じ、容器を入力して流体を許可する液体処理管クランプとメディアのバッグのクランプを開きます。 </li><li>袋のスタンドを使用して、容器内への細胞懸濁液の流れを支援するメディアのバッグを引き上げる。 </li><li>接種したメディアのすべてが血管に入るまで、容器を充填します。媒体の300mLのは、まだメディアの袋の上部に残るはずです。容器の充填継続するメディアの袋からクランプを外します。液体は、上側の空気のマニホールドに近づくと、充填にわたって防止するために、メディアの袋を下げて充填速度を遅くする。徐々に充填ラインへの液体レベルをもたらし、液体ハンドリングのチューブをクランプする。 </li></ol> 7。層に液体をロックする分離方法<ol><li>多様体の両​​方のセットが最も高い位置になるように、分離位置にCSMのHYPERStackの容器を持参し、容器の高さの下にメディアの袋を下げてください。 HYPERStack - 12層の容器は、容器の側面に手を置き、充填くさびを持ち上げるために他を使用して分離位置に持ち上げることができます。 </li><li>直立した状態で開催されたチェイスのフィルタで、チェイスチューブクランプを開きます。これはメディアの袋に戻し、液体ハンドリングのチューブでメディアを空にするか、追うだろう。チューブが空になると、メディアのバッグのチューブのクランプを閉じてください。 </li><li>直立した状態で追いかけるチューブフィルタを保ち、残りの液体が容器に入ると平衡できるようにHYPERStackに液体ハンドリングのチューブにクランプを開きます。これが発生するために1-2分待ちます。 </li><li>多様体が左にあるように、CSMでHYPERStack容器を回して。 CSMの負荷の位置に容器を下げます。少し左にHYPEStack - 12層の血管をロッキングすること充填ウェッジの削除を許可します。チェイスと液体ハンドリングチューブの両方にクランプを閉じます。 </li><li>メディアのバッグは、今や容器から除去することも、後で収穫の手順で使用するために取り付けられて残ることがあります。添付されたメディアの袋を格納するために、HYPERStack容器の収納トレイに保持バンドの下に空の袋と袋に残っているメディア、および場所をロールバックします。 </li><li>インキュベーターにHYPERStack容器を移動する。血管の世話を運ぶときにエアベントフィルターに入るから液体なるように注意する必要があります。これは、わずかに上向きHYPERStackのマニホールドの端を傾けることによって達成される。 </li></ol> 8。収穫プロトコル<ol><li>収穫の手順を開始するには、チューブは、収穫袋のアセンブリを形成するために一緒に細胞解離液とクエンチの袋を溶接。すべてのチューブのクランプが閉じていることを確認します。 （実証するために漫画を使用してください） </li><li>インキュベーターからHYPERStack容器を削除、保持バンドの下からのメディアの袋を解放し、袋のスタンドにハングアップする。負荷の位置でCSMに容器を置き、血管を保護するために蓋を締めます。保持クランプにベントチューブをフックし、フィルの位置にCSMを移動する。 </li><li>メディアの袋チューブとメディアが添付された袋に流れるように容器の液体ハンドリングチューブのクランプを開き、袋のスタンドのメディア袋がHYPERStackより低くぶら下がっていることを確認して。 </li><li>一度船が約である¾空の、最後の空の位置にCSMの設定を変更してください。 HYPERStack容器と液体ハンドリングチューブが空のときに、費やされるメディアのバッグのチューブのクランプを過ぎてメディアを追跡するためにチューブを持ち上げ、その後液体ハンドリングチューブのクランプと過ごしたメディアバッグのチューブのクランプの両方を閉じます。 </li><li>管の溶接による収穫袋のアセンブリと過ごしたメディアの袋を交換して、袋のスタンドを使用してHYPERStackの高さは上記の細胞解離バッグのアセンブリの高さを上げる。 </li><li>平衡の位置にCSMを置きます。細胞解離液のチューブのクランプを開き、HYPERStackにソリューションを移す。転送が完了すると、液体ハンドリングチューブと細胞解離液をチューブにクランプを閉じます。 </li><li>負荷の位置にCSMをもたらす。水平方向の位置決めレバーが開いて保持することにより、穏やかに細胞層を介してソリューションを配布し、ホイールを使用して側に船の側を揺らし。容器は、時折ソリューションの平等な分配を維持するためにロッキングの間に平衡の位置に戻されることがあります。それは、層が完全にコーティングされていることを視覚的に明らかでないかもしれませんが、解離液は均等に細胞の表面に分散されます。解決策が十分に分散されると、負荷の位置でHYPERStackをロックするためにCSMのレバーを離します。この位置でHYPERStackを残すあなたの細胞に必要な解離時間の間。 </li><li>細胞がはがれるしたら、ガイドとして濁度を用いて、平衡の位置にCSMを移動する。ケアは、以上の細胞を消化しないように注意してください。クエンチ袋クランプとクエンチメディアが血管を入力できるようにするHYPERStackの液体ハンドリングのチューブクランプを開きます。転送が完了したらHYPERStackの液体ハンドリングのチューブのクランプを閉じます。 </li><li>負荷の位置にCSMを戻し、サイドに船の側の岩に水平方向の位置決めレバーを押し続けます。 </li><li>袋のスタンドを使用して、HYPERStackのレベル以下に収穫袋のアセンブリの位置を下げる。 、空の位置にCSMを調整して容器の液体ハンドリングのチューブのクランプを開き、バッククエンチ袋に細胞溶液を移す。負荷の位置にCSMを戻し、チューブシーラーを用いて容器から収穫袋のアセンブリを取り外してください。細胞溶液は、処理の準備ができています。 </li></ol> 9。代表的な結果<ul><li>標準ポリスチレンの表面からのガス透過性ポリスチレン表面への変換時に最適化される時間のニーズを収穫。細胞はHYPERStack製品でより速く解放する傾向がある。 </li><li>顕微鏡下で細胞を表示するには通気口と液体ハンドリングのチューブは、オフクランプする必要があります。マニホールドは、顕微鏡のステージ上で、下向きのと、上下逆さまにHYPERStackの容器を置きます。 </li><li>予防のステップは、それらが機能停止の原因となる使用中にフィルターを湿潤を避けるために撮影することができます。しないことでHYPERStack容器を充填し、通気口と追いかけチューブを保つ上から濡れが発生しないはず、クランプが開いているときに上昇。 </li><li>チューブ上の閉鎖クランプの圧力は、クランプが開かれた後、それが閉じたままになります。反対方向にチューブをつまんでは、それを開くでしょう。 </li><li>重力のフィードを介してHYPERStackの容器を出入りするメディアフロー時間はHYPERStack容器内のメディアの最上位レベルの間にメディアの高さの違いとメディアのコンテナ内のメディアのトップレベルに基づいています。距離感が大きくなればなるほど、流れ速い。最大流量は1.5L/minのフィルタの定格によって制限されます。 </li><li> HYPERStack容器内の適切な充填量を維持することが細胞増殖のチャンバー内の空気気泡の形成を防ぐことができます。気泡は、サンプリングや蒸発水損失によるunhumidified環境でインキュベートすることにより発生することができます。追加の流体がエンドユーザによって追加する必要がある場合は、サンプリング量と周波数だけでなく、インキュベーションの条件が決定されます。 </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1標準的な細胞培養容器内のメディアの酸素欠乏。図は3日以上の細胞のレベルでの酸素のmg / Lの減少を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2標準的な細胞培養容器の培地中の酸素勾配。図は、酸素のmg / Lは細胞層よりもヘッドスペースの交差点へのメディアで最大であることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。細胞増殖中HYPERStackの気管空間における酸素の割合。図は、96時間にわたって、それぞれのガス透過膜の底部を供給する層との間の酸素の割合は、、一定であることを示しています。これは、コンフルエントに成長中に酸素をアクセスするために細胞の能力を示しています。

7745209：HYPERStack容器のガス透過性の技術は米国特許＃の下に覆われている。著者は、この記事で使用する楽器を生成するコーニングライフサイエンス、Incの従業員です。

HYPERStack容器は、正常に成長し、プライマリおよび幹細胞を設計しています。容器内への流体の追加は、重力供給によって、また、無菌のメディアのコンテナからポンプによる無菌バッグの接続を介して行われている。容器は、同じ体積のフットプリントの積層板製品の対成長領域にある以上の2.5倍に増加しています。 HYPERStack - 12が6,000 cm 2の成長分野を持っている、HYPERStack - 36は、18,000 cm 2の成長分野を持っており、HYPERStack - 120は、成長地域の60,000 cm 2としています。表面積を増やすことにより、ユーザは同一の細胞集団またはロットからの複数のセルを生産し、ばらつきを削減することができます。彼らはまた、同じセルの出力を達成するため、または人々、クリーンルームのスイート、またはインキュベータを追加することなく、セルの出力を高めるためにより少ない容器を使用して領域および/または労働を節約することができます。システムは、低微粒子アセンブリのメソッドを使用して、接着剤を使用せずに生成されます。それは、チューブセットとフィルターにあらかじめ組み込まれていますクローズドシステム、トリプル重包装と滅菌に提供されています。

<table><tbody><tr><td>1.5L バッグ入り培地</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350ml 培地 + 150ml 血清（必要な場合）</td></tr><tr><td>4.0L バッグ入り培地</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600ml 培地 + 400ml 血清（必要な場合）</td></tr><tr><td>HYPERStack Vessel-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>HYPERStack Vessel-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>フィリングウェッジ</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>スタックマニピュレーター</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>HyQtainer サブアセンブリサンプリングデバイス</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>600ml バッグ入り培地クエンチャー (10% FBS IMDM)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>600ml 細胞解離溶液</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

ガス透過性材料技術とhyperstackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

マイクロビーズが最適な選択ではない場合、大容量接着細胞培養は、現在スタックプレートの細胞増殖製品の標準化されています。 HYPERStack船は、現在のスタックプレート製品からのクローズドシステムのスケールアップが可能と同じ体積のフットプリントで、&gt; 2.5倍以上のセルを実現。 HYPERStack船ガス交換が発生することができるガス透過性材料を介して関数は、したがって、容器内の内部ヘッドスペースが不要になります。ヘッドスペースの除去は細胞増殖を最小限にするために発生するコンパートメントは、同じ体積のフットプリント内で細胞増殖の表面積の複数の層をできるように、スペースを減らすことができます。 このような細胞療法やワクチンの生産などの多くのアプリケーションでは、クローズドシステムは、細胞の成長と収穫のために必要です。 HYPERStack容器は、メディアの袋または他の方法からチューブを介して細胞と試薬の追加および削除することができます。 このプロトコルは、細胞、クローズドシステムの細胞増殖のプロトコル、および様々な収穫方法の代謝のニーズを満たすためにHYPERStack船、ガスの拡散の結果で使用されるガス透過性材料の背後にある技術について説明します。

技術、プロトコル、および高収率で接着細胞の培養に使用コーニングHYPERStack船と付属品の取り扱いへの導入。プロトコルは、現在のスタック板製品を介して細胞の回収を増加させるための閉鎖系容器を使用する方法について説明します。

ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

マイクロキャリアビーズが最適な選択肢ではない場合、現在、大量の接着細胞培養はスタックプレート細胞増殖製品を用いて標準化されています。

この手順の全体的な目的は、Corning Hypersスタック容器を閉鎖系として正しく使用する方法を実演することです。まず、重力供給法を用いて容器に培地を充填し、接種を行います。次に、各層に細胞懸濁液を分離させ、細胞をインキュベートします。インキュベーション後、使用済みの培地を除去します。手順の最終ステップとして、hypers stack 容器から細胞を回収します。最終的に、hypers stack 密閉システムを使用した際に、細胞が共流的に増殖する過程で酸素を取り込む能力を示すガス拡散結果を得ます。ガス透過性材料を用いたhypers stack vesselの主な利点は、細胞増殖のための表面積を拡大できることです。容器内のヘッドスペースをなくすことで、同僚のp pardoがhypers stack vesselを用いた閉鎖系プロトコルについて実演します。hypers stack vesselは、トッププレートとガス透過性フィルムで構成される個別の細胞培養コンパートメントであるstatで構成されています。細胞はこのコンパートメント内で培養されます。液体マニホールドは、モジュール内の各ette層を互いに接続します。モジュールはチューブで接続され、12層の倍数で構成される容器を形成します。マニホールドにより、ユーザーは容器全体に対して一度の流体操作を行うことができます。エアマニホールドは各静止層（stat layer）を接続していますが、流体添加時に容器から空気を追い出すために使用され、層間の充填時に使用する充填ラインを備えています。静止層は気管腔（tracheal space）と呼ばれる開放的な空気空間であり、各層のガス透過性フィルムを通じてガス交換が行われます。液体ハンドリングチューブは液体マニホールドに接続されており、無菌性を維持しながら余分な空気を放出させ、閉鎖系でのすべての液体操作を行うために使用されるカスタマイズ可能なコンポーネントです。ベントチューブが使用されます。ベントチューブはエアマニホールドに接続されており、エアフィルターを備えています。液体ハンドリングチューブには、容器への充填後にチューブ内の液体を排出するためのチェイスチューブとフィルターが接続されています。また、本プロトコルでは、使用中に容器を正しい位置に配置するのを補助するハンドリングデバイスであるCorning Stack manipulator（CSM）を使用します。本デモンストレーションでは、ガス透過性のある36層容器を用いた密閉系細胞培養について解説します。ただし、CSMを使用する場合、フィリングウェッジを用いて12層の容器でこの手順を行うための詳細は、付属の書面プロトコルに記載されています。まず、メディアチューブに接種する前に、3.9 litersのバッグ入り培地を準備します。血清バッグを培地バッグに接続し、十分に混合して目的の血清濃度にします。大型のバッグクランプを使用して、バッグ内の培地約300 millilitersをクランプして遮断します。これにより、充填時に接種されたすべての細胞が使用され、培地バッグ内に細胞が残らないようにします。培地をバッグスタンドに設置し、培地に接種を行います。チューブが装着されたシリンジに細胞懸濁液を満たします。細胞懸濁液が入ったシリンジを、チューブウェルディングによって培地バッグに接続します。シリンジからバッグまでのチューブの長さは16インチにします。細胞懸濁液を培地バッグに注入し、よく混合します。接種済みの培地バッグは、チューブ溶着または汎用コネクタを使用して、装置の3/8インチ液体ハンドリングチューブに接続できます。今回はチューブ溶着を使用します。容器の液体ハンドリングチューブおよびチェイスチューブのクランプを閉じます。36層容器をCSMのロードポジションに設置します。ベントフィルターチューブをCSMの保持クランプに掛けます。蓋をしっかりと締め、CSMを満たし位置に移動させてエアフィルターを最高位置に配置し、充填操作中の浸水を防ぎます。また、10度の角度をつけることで、充填時に充填ラインから空気を追い出し、液体の層への平衡化を可能にします。チェイスチューブのクランプを閉じたまま、培地バッグを容器と同じ高さに配置してください。液体ハンドリングチューブのクランプと培地バッグのクランプを開き、液体が容器内に流入するようにします。バッグスタンドを使用して培地バッグを高く上げ、細胞懸濁液が容器に流れ込むのを促進します。接種用培地がすべて容器に入るまで充填してください。培地バッグの上部には、まだ300 millilitersの培地が残っているはずです。液体が上部エアマニホールドに近づいたら、培地バッグからクランプを取り外し、容器への充填を続けます。過充填を防ぐため、培地バッグを下げることで充填速度を遅くしてください。液面をゆっくりと充填線まで上げ、液体ハンドリングチューブをクランプします。CSM内の容器をアイソレーションポジションまで移動させ、両方のマニホールドセットを最高位置に配置します。培地バッグを容器の高さより低い位置まで下げます。チェイスフィルターを垂直に保持した状態で、チェイスチューブクランプを開きます。これにより、液体ハンドリングチューブ内の培地が培地バッグへと排出（チェイス）されます。チューブ内が空になったら、培地バッグ側チューブのクランプを閉じます。チェイスチューブフィルターを垂直に保持します。容器の液体ハンドリングチューブのクランプを開き、残っている液体が容器内に流入して平衡状態になるようにします。これが完了するまで1〜2分間待ちます。次に、マニホールドが左側にくるようにCSM内の容器を回転させます。容器をCSMのロードポジションまで下げます。チェイスチューブと液体ハンドリングチューブの両方のクランプを閉じます。培地バッグを容器から取り出しても構いませんし、後の回収工程で使用するために取り付けたままにすることも可能です。取り付けたままの培地バッグを保管する場合は、バッグを丸めて容器の保管トレイにある固定バンドの下に配置してください。最後に、容器をインキュベーターに移動させます。容器を運ぶ際は、エアベントフィルターに液体が入らないよう注意してください。これは、マニホールド端をわずかに上向きに傾けることで達成されます。回収手順を開始するには、細胞結合溶液チューブとクエンチバッグを溶着させ、回収バッグアセンブリを形成します。その際、すべてのチューブクランプが閉じていることを確認してください。容器をインキュベーターから取り出し、CSMのロードポジションに設置します。固定バンドの下から培地バッグを取り出し、バッグスタンドに掛けます。その横に立ち、蓋を締めて容器を固定します。ベントチューブを保持クランプに掛け、CSMを満充填位置に移動させます。バッグスタンド上の培地バッグが、容器よりも低い位置に吊り下げられていることを確認します。培地バッグのチューブおよび容器の液体ハンドリング用チューブのクランプを開き、培地が接続されたバッグに流れ込むようにします。容器が約4分の3空になったら、CSMの設定を最終的な空の状態（empty position）に変更します。容器と液体ハンドリングチューブの中身が空になったら、チューブを持ち上げて、廃培地バッグチューブのクランプを越えて培地を押し出します。その後、液体ハンドリングチューブのクランプと廃培地バッグチューブのクランプの両方を閉じます。チューブ溶着により、廃培地バッグを回収バッグアセンブリに交換します。バッグスタンドを使用して、細胞解離バッグアセンブリの高さを容器よりも高く上げます。CSMを充填位置に配置します。細胞解離溶液チューブのクランプと回収バッグアセンブリのクランプを開き、溶液を容器に転送します。移送が完了したら、液体ハンドリングチューブと細胞解離溶液チューブのクランプを閉じます。次に、水平位置決めレバーを開いたまま、CSMをロード位置まで移動させます。ホイールを使用して容器を左右にゆっくりと揺らし、溶液を細胞層全体に行き渡らせます。溶液を均等に分散させ続けるため、ロッキング操作中に容器を時々充填位置に戻す場合があります。溶液が十分に分散したことを確認したら、CSMのレバーを放して充填位置で固定します。細胞に必要な解離時間の間、容器はこの位置に保持してください。濁度を指標として細胞の剥離を確認します。剥離後、CSMをロード位置に移動させます。クエンチバッグのクランプと液体ハンドリングチューブのクランプを開き、クエンチ培地を容器内に導入します。液体ハンドリングチューブのクランプを閉じます。移送が完了したら、CSMをロード位置に戻し、水平位置決めレバーを保持して容器側を左右に揺らします。バッグスタンドを使用して、回収バッグアセンブリの位置を容器のレベルより下に下げます。CSMを空の位置に調整します。ベッセル液体ハンドリングチューブクランプを開き、細胞溶液をクエンチバッグに戻します。CSMをロード位置に戻し、チューブシーラーを用いて、ハーベストバッグアセンブリをベッセルから切り離します。これで、細胞溶液を従来の細胞培養システムで処理する準備が整いました。ヘッドスペース（Headspace）法では、培地中の酸素は3日間で平均50%消費されます。培養において、この数値は同一の培養システムにおける細胞レベルでの酸素濃度の経時的な減少（mg/L）を示しており、培地高さ3 mmにおける酸素勾配は、細胞層よりも培地とヘッドスペースの接合部においてほぼ50%高くなります。細胞増殖中のハイパースタックの気管スペースにおける酸素濃度（％）を示す。この図から、各ガス透過性フィルムボトムに供給される層間の酸素濃度が、96時間にわたって一定に保たれていることがわかる。これは、細胞がコンフルエントになるまで、増殖過程で酸素を利用できることを示している。このビデオを視聴することで、クローズドシステムにおけるCorning Hypersスタック容器への充填および回収方法について十分に理解することができます。

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