ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

この手順の全体的な目標は、Corning Hypersスタック容器の正しいクローズドシステムの使用方法を実証することです。これは、最初に重力供給法で容器に培地を接種し、充填することによって達成されます。次に、細胞懸濁液を各層で単離し、細胞をインキュベートします。

インキュベーション後、使用済み培地は除去されます。手順の最後のステップは、ハイパースタック血管から細胞を採取することです。最終的に、ガス拡散の結果が得られ、hypers スタック クローズド システムを使用した場合、細胞が成長中に酸素にアクセスする能力が示され、流暢

ガス透過性材料を使用したハイパーススタック容器の主な利点は、細胞増殖のための表面積を増加させることです。容器内のヘッドスペースをなくすことで、同僚のp pardoは、ハイパースタック容器を使用するためのクローズドシステムプロトコルを実演します。hypersスタック容器は、トッププレートとガス透過性フィルムで構成された個々の細胞培養コンパートメントであるスタットで構成されています。

細胞はこのコンパートメント内で培養されます。液体マニホールドは、モジュール内で各エッテ層を一緒に接続します。モジュールはチューブで接続され、12層の倍数で容器を形成します。

マニホールドにより、ユーザーは容器全体に対して1回の流体操作を行うことができます。エアマニホールドも統計層を接続しますが、流体の追加が発生したときに容器から空気を置換するために使用され、各層間の充填中に使用するための充填ラインが含まれています。統計層は気管空間と呼ばれる開放空間で、各層のガス透過膜を通じてガス交換が行われます。

リキッドハンドリングチューブはリキッドマニホールドに接続されており、無菌性を維持しながら過剰な空気を放出するためのすべてのクローズドシステム流体操作を行うために使用されるカスタマイズ可能なコンポーネントです。ベントチューブを使用しています。ベントチューブはエアマニホールドに接続され、エアフィルターが含まれています。

リキッドハンドリングチューブに接続されているのはチェイスチューブとフィルターで、容器に充填した後にリキッドハンドリングチューブから液体を排出するために使用されます。また、このプロトコルでは、使用中に容器を正しい位置に配置するのを支援するハンドリングデバイスであるCorning StackマニピュレータまたはCSMも使用されます。このデモンストレーションでは、気体透過性36層容器の閉鎖系細胞培養を実演します。

ただし、A CSMを使用して、充填ウェッジを使用して12層容器でこの手順を実行するための詳細は、付属の書面によるプロトコルに記載されています。メディアチューブに接種する前に、3.9リットルの袋詰めされたメディアを準備することから始めます。血清バッグを培地バッグに濡らし、十分に混合して目的の血清濃度にします。.

clamp 大きなバッグclを使用して、バッグ内のメディアの約300ミリリットル。これにより、充填中にすべての接種細胞が使用され、培地バッグに細胞が残っていないことが保証されます。メディアをバッグスタンドに置き、メディアに接種します。

チューブに取り付けられたシリンジに細胞懸濁液を充填します。細胞懸濁液の入ったシリンジをチューブ溶接で培地バッグに取り付けます。シリンジからバッグまでの16インチ以上のチューブが3本あります。

細胞懸濁液を培地バッグに注入し、よく混合します。接種されたメディアバッグは、チューブ溶接または多目的コネクタを使用して、容器の3オーバー8インチのリキッドハンドリングチューブに取り付けることができます。今日はチューブ溶接を使用します。

clを閉じますamp 容器の液体取り扱いとチェイスチューブの。36層の容器を積み位置のACSMに配置します。ベントフィルターチューブをCSMの保持clに引っ掛けますamp。

蓋を締め、CSMを充填位置に移動して、エアフィルターを最高位置に配置し、充填作業中の濡れを防ぎます。10度の角度はまた、充填ラインから透明な空気を充填する際に、液体の層への平衡化を可能にします。メディアバッグを容器と同じ高さに配置し、チェイスチューブクランプを閉じたままにします。

リキッドハンドリングチューブclを開きますamp とメディアバッグclamp 液体が容器に入るのを待ちます。バッグスタンドを使用して、培地バッグを持ち上げ、細胞懸濁液が容器に流れ込むのを助けます。接種したすべての培地が容器に入るまで、容器を満たします。

メディアバッグの上部には、まだ300ミリリットルのメディアが含まれている必要があります。メディアバッグからclを取り外すamp 液体が上気マニホールドに近づくにつれて容器の充填を続けます。メディアバッグを下げて充填速度を遅くし、過剰充填を防ぎます。

液体レベルをゆっくりと充填ラインに持って行き、液体処理チューブを凝集させます。CSMの容器を分離位置に持ってきて、両方のマニホールドセットを最も高い位置に配置します。メディアバッグを容器の高さより下に下げます。

チェイスフィルターを直立位置に保持した状態で、チェイスチューブclを開きますamp.これにより、リキッドハンドリングチューブ内のメディアが空になるか、追い詰められてメディアバッグに戻ります。チューブが空になったら、メディアバッグチューブのクランプを閉じます。

チェイスチューブフィルターを直立位置に保ちます。clを開きますamp 容器の液体処理チューブの上で、残りの液体が容器内に入り、平衡化できるようにします。これが発生するまで 1 分から 2 分待ちます。

次に、マニホールドが左側にくるようにCSMで容器を回転させます。容器をCSMの負荷位置まで下げます。clを閉じますamp チェイスチューブとリキッドハンドリングチューブの両方。

メディアバッグは、容器から取り外すことも、収穫手順の後半で使用するために取り付けたままにしておくこともできます。付属のメディアバッグを保管するには、メディアバッグを転がして、容器の保管トレイの保持バンドの下に置きます。最後に、容器をインキュベーターに移動します容器を運ぶときは、液体がエアベントフィルターに入らないように注意してください。

これは、マニホールドの端を少し上に傾けることによって達成されます。収穫手順チューブを開始するには、セルを溶接します 協会溶液とクエンチバッグ 一緒に収穫バッグアセンブリを形成するには、すべてのチューブクランプが閉じていることを確認してください。容器をインキュベーターから取り出し、CSMのロード位置に置きます。

メディアバッグを保持バンドの下から外し、バッグに掛けます。次に立ち、蓋を締めて容器を固定します。ベントチューブを保持クランプに引っ掛け、CSMを充填位置に移動します。

バッグスタンドのメディアバッグが容器よりも下にぶら下がっていることを確認してください。clを開きますamp メディアバッグチューブと容器のリキッドハンドリングチューブの メディアを付属のバッグに流し込みます。船が約4分の3空になったら、CSM設定を最終的な空の位置に変更します。

容器とリキッドハンドリングチューブが空になったら、チューブを持ち上げて、使用済みメディアバッグチューブのクランプを超えてメディアを追いかけます。次に、リキッドハンドリングチューブのクランプと使用済みメディアバッグチューブのクランプの両方を閉じます。使用済みメディアバッグをチューブ溶接でハーベスティングバッグアセンブリと交換します。

バッグスタンドを使用して、セル解離バッグアセンブリの高さを容器の高さより上に上げます。CSM を塗りつぶし位置に配置します。細胞解離溶液チューブクランプとハーベストバッグアセンブリクランプを開き、溶液を容器に移します。

移送が完了したら、リキッドハンドリングチューブと細胞解離溶液チューブのクランプを閉じます。次に、水平位置決めレバーを開いたままCSMを負荷位置に持ってきます。ホイールを使用して容器を左右に静かに揺さぶり、溶液を細胞層に分配します。

容器は、溶液の均等な分布を維持するために、揺動中に充填位置に戻ることがあります。溶液が適切に分散されたら、CSMのレバーを放して充填位置にロックします。細胞に必要な解離時間中、血管をこの位置に置いておきます。

濁度をガイドとして使用して、細胞の剥離を判断します。取り外したら、CSMをロード位置に移動します。クエンチバッグclを開きますamp とリキッドハンドリングチューブclamp クエンチ媒体が容器に入るようにします。

clを閉じますamp リキッドハンドリングチューブの。移乗が完了したら、CSMを積載位置に戻し、水平位置決めレバーを押し続けて船舶を左右に揺らします。バッグスタンドを使用して、ハーベストバッグアセンブリの位置を容器のレベルより下に下げます。

CSMを空の位置に調整します。容器の液体処理チューブクランプを開き、セル溶液をクエンチバッグに戻します。CSMをロード位置に戻し、チューブシーラーを使用してハーベストバッグアセンブリを容器から外します。

これで、細胞溶液は従来の細胞増殖システムで処理する準備が整いました。Headspaceを使用すると、メディア内の酸素は3日間で平均50%枯渇します。培養では、この図は、同じ成長システム内の細胞レベルでの酸素1リットル当たりのミリグラムの減少を示しており、3ミリメートルの培地高さを通る酸素勾配は、細胞層よりも培地とヘッドスペース接合部でほぼ50%大きい。

細胞増殖中のハイパースタックの気管腔内の酸素の割合が示されています。この図は、96時間にわたって、各ガス透過性フィルムの底部に供給する層間の酸素の割合が一定に保たれていることを示しています。これは、細胞が成長中に酸素にアクセスする能力を同等に流暢に行うことを示しています。

このビデオを見れば、クローズドシステムでのCorning Hypersスタック容器の充填方法と収穫方法について十分に理解できるはずです。