V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

この手順の全体的な目標は、ウイルスエンベロープ遺伝子のV 3領域を配列決定して患者の血漿からH-I-V-R-N-Aを抽出し始めることにより、HIV感染患者のウイルス指向性を推測することです。次に、ネスティングされたR-T-P-C-Rを使用して、HIV GP one 20のV3領域を増幅します。次に、ゲル電気泳動を使用して製品の存在を特定し、続いて増幅されたV 3製品のポピュレーションベースのシーケンシングを行います。

最後に、ベースコールソフトウェアを使用して配列を解析し、ゲノムからフェノへのアルゴリズムを使用して共受容体の使用を推測します。最終的に、これらの結果は、HIVV 3ループの集団ベースのシーケンシングを通じて、患者のウイルス群がR5であるか非R5であるかを示すことができます。したがって、この技術の主な利点は、表現型細胞ベースのアッセイなどの既存の方法に対する軍隊アッセイであり、シーケンシング装置を備えた任意の実験室で実施でき、より少ない出発材料でより短い時間でコストを削減できることです。

この技術は、患者のウイルス集団が500マイクロリットルの血漿からCCR5拮抗薬に反応する可能性が高いかどうかを特定できるため、抗レトロウイルス療法による治療に関連しています。簡単なマグ自動抽出器を使用して、H-I-V-R-N-Aを抽出します。次に、A PCRクリーンルームに移動して、ウイルス集団の適切なサンプリングを確保するために、R-T-P-C-Rをセットアップします。

このワンステップ反応では、各逆転写反応を三重に行うように計画します。ウイルスRNAを使用してCDNAを合成し、SQV three F1およびCO 6 0 2プライム修復でHIVV 3領域を特異的に増幅します。反応成分に基づいています。

リピーターピペットを使用して増幅するサンプル数に十分なストックミックス溶液を作成します PCRプレートの各ウェルに36マイクロリットルのサンプルミックスを追加します。次に、マルチチャンネルピペットに切り替えて、マイクロリットルのRNAサンプル抽出物を指定された各ウェルに形質転換します。追加するたびにヒントを変更するように注意してください。

移管が完了したら、ウェルをPCRストリップキャップで覆います。次に、HIVV 3領域のワンステップR-T-P-C-RにプログラムされたサーモサイクラーにPCRプレートを置きます。ネステッドPCRには、SQV three F twoおよびCD four Rプライマーリペアを使用します。

PCRクリーンルームで増幅するサンプル数に必要な試薬の量を計算します。ネストされたPCRミックスを生成し、リピーターピペットを使用して、クリーンなPCRプレートのウェルあたり19マイクロリットルを分注します。R-T-P-C-Rが完成したら、ポストアンプルームに移動します。

8チャンネルマルチチャンネルピペットを使用して、1マイクロリットルのR-T-P-C-RテンプレートをネスティングされたPCRミックスに移します。追加するたびにヒントを変更します。ウェルをPCRストリップキャップで覆い、プレートをサーモサイクラーに移して増幅します。

温度が摂氏25度に戻ったら、サーモサイクラーからプレートを取り外します。V-3領域が正常に増幅されたことを確認するために、まずゲル電気泳動による生成物の分析を行います。サイバーセーフゲル染色剤を塗布した1.6%AROSゲルを調製します。

10マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用。8マイクロリットルのPCRサンプルをそれぞれのウェルに移します。また、DNAラダーを1列につき少なくとも1つのウェルにロードします。

ゲルを約100ボルトで10分間泳がせます。紫外線蛍光でバンドを可視化し、写真撮影で画像を記録します。すべてのトリプリケート増幅が成功したサンプルをメモします。

必要に応じて、製品の増幅が3回未満のサンプルに対してR-T-P-C-Rを繰り返します。増幅されたウイルス CDNA サンプルは、V 3 0 2 F および S QV 3 R one プライマーを使用して DNA シーケンシング反応によってさらに検証されます。ビッグディ試薬を冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。

実行するサンプルの数に必要な試薬を計算して準備します。5マイクロリットルのシーケンシング反応ミックスをマルチチャンネルピペットを使用して適切なプレートウェルに分注します。プレートをキムワイプで覆い、脇に置きます。

その間、残りのPCR産物に180マイクロリットルの滅菌水を加えることにより、増幅されたPCR産物の1〜15希釈を調製します。希釈したサンプルの1マイクロリットルを適切なプレートの底にピペットで移します。ウェルは、サンプルの移送が完了すると、常にサンプル間でチップを交換します。

プレートをストリップキャップで密封し、1秒間渦巻きます。プレートを遠心分離するには、速度を140 5Gに設定します。スピン速度が140 5Gに達したら、スピンを停止します。

プレートをサーモサイクラーに入れて、反応を進行させます。各ウェルで、4マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと40マイクロリットルの冷却95%エタノールでDNAを沈殿させ、キャップを再シールします。プレートを10秒間皮質にし、プレートを軽くたたいて気泡を取り除きます。

プレートを摂氏マイナス20度に30分から2時間置きます。2000 Gで20分間遠心分離することによりDNAを回収します。ストリップキャップを取り外して廃棄します。

プレートを廃棄物容器の上にひっくり返し、スーパーナチンをデカントします。残っているスーパーナチンを取り除きます。逆さにしたプレートをペーパータオルで吸い取ります。

ペーパータオルを2枚折りたたんでプレートを挟みます。プレートを下向きにして遠心分離機に置き、140 5Gで回転させます。140 5Gに達したときにスピンを停止します。

次に、155マイクロリットルの95%エタノールとデカントで洗浄します。その後、遠心分離を繰り返します。プレートを2〜5分間放置して、最後のエタノールを蒸発させます。

DNAサンプルを変性させるには、マルチチャンネルピペットを使用して、10マイクロリットルの高希釈剤をメイド用のウェルをプレート上のすべてのウェル(空のウェルを含む)に分配します。プレートをセプチマで密封し、摂氏90度のサーモサイクラーに2分間置きます。最後に、サンプルプレートをシーケンシングプレートとシーケンサーに入れます。

データ分析への許容可能なルートの1つは、ソフトウェアリコールを使用して、人間の介入なしに自動ベースコールを実行することです。Recallは、無料のカスタムベースの通話ソフトウェアで、ログインし、参照オプションを使用してアップロードするサンプルファイルを選択します。生のシーケンシングデータファイルを見つけて、最大20メガバイトをアップロードします。

次に、参照シーケンスをV 3に設定します。[データの処理] をクリックします。ページの右側にある結果のフォルダーを選択して、サンプルのリストを表示します。

赤色のものは失敗しています。緑色のものは通過しました。特定のサンプルと表示ボタンをクリックすると、シーケンスを確認し、ページの右側にある指示に従ってシーケンスをナビゲートし、ファイルをzipフォルダにダウンロードできます。

ウイルスの親和性は、geno-pheno co-receptor アルゴリズムを使用した集団ベースのシーケンシングによって生成された配列から推測できます。重要な設定のドロップダウンメニューから、やる気を起こさせる2%および5.75%FPRの臨床データの分析に基づいて最適化されたを選択します。次に、分析用のシーケンスをアップロードするか貼り付けるかを選択します。

FASTAファイルも使用できます。CCR 5つのアンタゴニストに対する応答性のgeno Tono FPRA予測因子を得るために他の進行を追加しないでください。生成されたG two Pレポートは、アミノ酸中のV 3ループ配列を提供し、ウイルスを使用した非R 5に関連する突然変異からの関連する位置を示します。

レポートの下部には、偽陽性率が示され、CCR 5 アンタゴニストに対する応答の観点から解釈されます。このレポートはPDFファイルとしてダウンロードできます。サンプルからの3つの配列のいずれかが非R5であると推論された場合、患者は期待されるようにCCR 5アンタゴニストに反応する可能性は低いです RTP CRのゲル電気泳動 HIVの1V3ループは、すべての臨床サンプルが製品を生成するわけではないことを示しています。

増幅されたサンプルから生成された配列は、リコールによって読み取られたクロマトグラムで視覚化できます。混合の少ないクリーンなシーケンスが期待されます。時折、シーケンスが乱雑で、正確なベース割り当てに適していないことがあります。

一部の患者は、ここに示すように、ウイルスを使用して非CCR 5を持っていると特定される場合があります。これらの患者は、CCR 5 拮抗薬による治療に反応する可能性は低いです。しかし、大多数の患者は、G two P解析レポートの下部にある緑色のボックスで示されているように、ウイルスを使用してCCR 5で構成されるウイルス集団を持っていることがわかっています。

したがって、一度習得すると、このテクニックは最初から最後まで約4日で実行できます。それは抽出から分析までです。このビデオを見れば、ゲノムフェノバイオインフォマティクスアルゴリズムと組み合わせた集団ベースのシーケンシング法を使用してウイルスの親和性を予測する方法についてよく理解できるはずです。

よし、これで完了です。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。