ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

この手順の全体的な目標は、関心のあるHIV1株の相対的な複製適合性を決定することです。これは、最初に、目的の完全長HIV1配列を含むウイルス分子クローンまたはDNAプラスミドを構築することによって達成されます。第2のステップは、DNAトランスフェクションによって各分子クローンのウイルスストックを生成することです。

次に、各HIV One株の成長速度と指数関数的な成長段階を、モノ感染細胞培養の縦断的サンプリングによって確立します。最後のステップは、細胞培養でペアワイズ成長競争または二重感染を行うことです。最終的には、サンガーDNAシーケンシングから得られた逆転写、定量的リアルタイムPCR、およびDNA配列クロマトグラムピーク高さを使用してウイルス比率を決定し、その後、相対的なウイルス複製適合性を計算するために使用されます。

この手法の主な利点は、パラミノール感染やDU感染などの既存の方法と比較して、2つのウイルス株間の複製フィネットの違いをより高感度で確実に測定できることです。この論文で提示されたプロトコルには、HIV One組換えクローンの構築、部位特異的突然変異誘発による目的の突然変異の導入、ウイルスストックの作成、およびウイルス増殖動態を確立し、相対的なウイルス適応度を決定するための適応度アッセイの実施が含まれます。このビデオでは、成長競争と2つの異なる方法を示します。

適応度を計算するためのウイルス比を決定するには、成長競争アッセイシードを3回10〜5番目のPHA刺激末梢血単核細胞またはP BMCsを48ウェル平底プレートのウェルあたり500マイクロリットルで3回調製するための他のすべての手順のプロトコルテキストを参照してください。接種まで、プレートを摂氏37度に5%の二酸化炭素雰囲気に保ちます。次に、各ウイルスについて6, 000IUを含む3ミリリットルの接種材料を準備します。

一般的な実験では、複数の変異体がテストされますが、このデモンストレーションの目的で、プロトタイプウイルスに対してテストされる変異体は1つだけです。ミョウバン中のウイルスの適切な調製は、この手順の重要なステップです。非常に高い感染力を持つタイトルのウイルス茎で段階希釈が必要な場合があります 転送、各ウイルス接種の1.5ミリリットルを滅菌チューブに送って、二重感染接種物を作成します。

PHA刺激pbmcにデュアル接種物の500マイクロリットルを追加します。48ウェルプレートの各ウェルに。最終的な培養量は、ウェル分量あたり1ミリリットル、デュアル接種のウェルあたり200マイクロリットル、296ウェルプレートです。

RNA単離のために、バックアップとして1つのプレートを保存します。接種した細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気で16〜24時間インキュベートします。接種後16〜24時間で培養物を洗浄し、750マイクロリットルの培養上清を除去して廃棄し、750マイクロリットルの新鮮な完全なスカーフ、修正ドコス培地またはC-I-M-D-Mを追加します。

プレートをラップで包み、10分間回転させます。300 gで、上清の750マイクロリットルを取除いて廃棄し、新鮮なC-I-M-D-Mの750マイクロリットルを加えて、5%二酸化炭素の雰囲気で摂氏37度でプレートをインキュベートします。サンプリング時間は、ウイルスの指数関数的増殖フェーズ内の少なくとも 3 つの時点を含むように選択する必要があります。

サンプルを採取するには、500マイクロリットルの培養上清を1.8ミリリットルの遠心分離管に移し、1分間回転させます。3000Gで、200マイクロリットルの無細胞上清を2 96に移します。RNA単離のためのサンプルプレートは、再び、バックアップとして1つのプレートを保存し、RNA単離までマイナス80°Cでスーパーナタンを保存します。

各培養物に500マイクロリットルの新鮮なC-I-M-D-Mを加え、次のサンプリング時間までプレートをインキュベーターに戻します。その後、サンプルからRNAを単離し、続いてCDNA合成を行います。ウイルス比を決定するための2つの方法が実証されます。

1つ目は逆転写、定量的リアルタイムPCR、またはR-T-Q-P-C-Rを使用し、2つ目はクロマトグラムピークハイトを使用します。QPCRの場合、プラスミドPNLの3倍3VIFAの3倍で、各ステップで10倍からマイクロリットルあたり6コピー、マイクロリットルあたり30コピーまでの3倍で希釈する標準的な段階希釈シリーズを準備します。96ウェルQPCR反応プレートをセットアップ。

各プレートには、少なくとも 1 つのネガティブコントロール、標準希釈シリーズを 3 倍にしたもの、および各 CD NA サンプルの複製が含まれている必要があります。A-V-I-F-Aプライマープローブを使用して、標準希釈シリーズのネガティブコントロールのシグナルを検出し、CDNAサンプルの1つの複製でシグナルを検出します。各QPCR反応には、VIFBプライマープローブとCDNAサンプルの他の複製を使用し、12.5マイクロリットルのQPCRマスターミックスを使用します。

フォワードプライマーとリバースプライマーのそれぞれ0.8マイクロモルと、標準希釈シリーズ用のCD NAの1マイクロリットル、ネガティブコントロール用のCDNAの代わりにPNL 4 3 VIFAの段階希釈を追加し、CDNAの代わりに水またはバッファーを使用し、QP qPCR Rマシンを操作するための製造元の指示に従ってPCRサイクリングパラメータを設定します。標準希釈系列の増幅データを使用して標準曲線を計算します。

CD NAサンプルの増幅データを標準曲線と比較し、コピー数を決定します。ウイルス成長率計算またはGRCウェブツールを使用して、相対的なウイルス適応度インプットを計算します。RT qPCR Rステップから取得した指定の形式のCDNAコピー数。

[calculate]を選択すると、競合する 2 つのウイルス間の正味成長率の差が出力され、クロマトグラムのピーク高さを使用してウイルス比が決定されます。PCR増幅し、VIFフォワードプライマーおよびVIFリバースプライマーを使用して、VIF AB配列タグを含むHIV One VIFフラグメントを増幅します。各PCR反応には、1マイクロリットルのCDNA、1つのXNH 4バッファー、1.5ミリモルのM gcl、2つの0.2ミリモルのDTP、2.5UのTACポリメラーゼ、および各プライマーの0.45マイクロモルを使用します。

最終容量の50マイクロリットルに水を追加します。PCRサイクリングパラメータを摂氏94度で1分間3サイクルに設定します。55°Cで1分間、70°Cで1分間、続いて94°Cで15秒間34サイクル

30秒、70°Cで1分間。そして最後に、摂氏4度のホールド。その後、市販のキットを使用してPCR産物を精製し、精製したPCR産物をDNAシーケンシングサービスプロバイダーに提出してサンガーシーケンシングを行います。

シーケンシングサービスが提供する平均読み取り品質スコアを確認します。平均ベースコール精度が85%未満の場合は、PCR増幅、PCR産物の精製、およびサンガーシーケンシングを繰り返します。Chromat quantitative web ツールを使用して、各時点でのウイルス比を計算します。

必要な入力は、リーダーシーケンスとシーケンスクロマトグラムファイルです。ABでは1つの形式。このツールは、指定された部位でのピーク強度を測定します。

ピーク強度の比は、2つのウイルスの比に対応します。GRC Webツールを使用して、相対的なウイルス適応度を計算します。入力は、Chromat 定量ウェブツールを使用して指定された形式で取得したシーケンスクロマトグラムのピーク高さです。

GRC Webツールが競合する2つのウイルス株間の正味成長率の差を計算することを示し、プロトタイプと3つのHIV変異ウイルスが構築され、pbmcでのそれらの成長が特徴付けられました。TCID 50は、ミリリットルあたり10から4番目、10から5番目のIUの範囲でした。すべてのウイルスは、2日目から4日目にかけて指数関数的に増加しました。

指数関数的成長段階では、3つの変異体すべてがプロトタイプウイルスよりも成長速度が遅かった。各変異体は、総MOI0.005で成長競争アッセイでプロトタイプウイルスと競合し、二重感染培養におけるウイルス増殖動態はモノ感染のそれと同様であった。ウイルスの指数関数的な成長段階は2日目から4日目の間であり、ウイルスの成長は5日目頃にプラトーに達しました。

ウイルスの増殖速度の差は、ウイルス比の経時的な変化から導き出されました。ウイルス比は、リファレンスウイルスと変異ウイルスのCDNAコピー数に基づいてR-T-Q-P-C-Rを用いて計算し、ヌクレオチド部位のシーケンスクロマトグラムのピーク高さを比較することにより、2つのウイルスを区別することにより、T 2 42 N変異体をプロトタイプと比較した。この例では、2つの方法を使用して決定された成長率の差は、同様の結果をもたらしました。

3つの変異体はすべて、プロトタイプウイルスよりも複製適応度が低く、I 2 56 V変異体は適応度が最も低かった。このビデオを見た後、HIVの相対的な複製適合性を判断するためにPWIの成長競争エッセイを実行する方法をよく理解しているはずです。1。