Name: ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶHIV-1の複製フィットネス測定法。ペアごとの成長競合アッセイを用いて、リアルタイムPCRとクロマトグラムピーク高さでウイルス比を定量し、相対的な複製適応度を算出する信頼性の高い手法です。

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これらの研究は、米国公衆衛生局の助成金P01AI057005、R01AI047734、R01AI111806、およびワシントン大学のエイズ研究センターの機能プロファイリングおよび計算生物学コア（P30 AI027757によって資金提供されました。

<ol><li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+viral+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38(2010).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness%3A+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li>
<li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+%28CTL%29+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C%3A+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463(2010).</li>
<li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes%3A+implications+for+the+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li>
<li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+infection%2Fcompetition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li>
<li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22B+and+C.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li>
<li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li>
<li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q%2FE+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li>
<li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A%2C+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%2C+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA%28Lys%2C+3%29+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
<li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li>
<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
<li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in%5BTitle%5D)+AND+%22Japan.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+conserved-element+vaccines%3A+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li>
<li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li>
<li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction</a> (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
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<li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
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<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li>
<li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065(2013).</li>
<li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li>
<li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。本明細書に示された意見は執筆者のものであり、公式または米国国防総省や軍の部門の見解を表すものとして解釈されるべきではありません。

組換えHIV-1分子クローンと成長競合アッセイの構築：提示プロトコルは、2つの主要な部分から構成されました。二重感染した細胞培養物中で2つのウイルスを区別するためには、競合分子クローンをRT-qPCRのプライマー - プローブアッセイにより、またはサンガー配列決定によって検出することができる配列タグを含むことが重要です。このプロトコルは、HIV-1 NL4-3 VIFの同じ領域を占有し、同じアミノ酸配列をコードするが、6同義突然変異によって異なるVifAとVIFBタグを利用します。これらの変異は影響を与えないことが示されました ウイルス複製のフィットネス20。このプロトコルで使用されるPCRベースのクローニング法は、制限部位に基づくクローニングに比べ、クローニング部位を選択する際に、より柔軟性を提供します。しかし、PCRクローニングの効率は挿入サイズが増加するにつれて減少します。インサートサイズの電流制限は〜5キロバイト34です。 PCRベースのクローニングおよび部位特異mutagenesi用S、高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、追加の変異の可能性を低減するために重要です。生成物の十分な量を得るために必要なPCRサイクルの最小数を使用することも推奨されます。我々の経験では、我々はここで説明するPCRベースのクローニングおよび部位特異的突然変異誘発の工程の後、余分な突然変異を検出しませんでした。それにもかかわらず、PCR産物は、任意の望ましくない変異を確認するために配列決定されるべきです。理想的には、全体のHIVコード領域を再配列決定されるべきです。 少なくとも三つのサンプリング時点は指数増殖期9内で検討されるべきです。ウイルスの増殖速度は、第1の成長競争のための適切な培養期間とサンプリング時間点を決定するために、毎日のサンプリングを使用して確立されなければなりません。ウイルスの増殖速度に影響を与える要因の一つは、感染（MOI）の多重度です。それはより多くのROを得るために示されたように、このプロトコルは、単一菌感染と成長の競争の両方のために0.005の合計MOIを使用しています下のMOI 9よりバスト結果。それにもかかわらず、下側のMOIは、必要に応じてより長い指数増殖期を得るために使用されるが、結果の一貫性を犠牲にすることができます。このプロトコルは、ウイルスの適応度の差が予め概して未知であると仮定すると、50：50の初期感染率を示唆しています。ウイルス複製の動態に有意差を示唆する予備的なデータがある場合しかし、等しくない入力比の使用が適切です。これらのケースでは、70：30の感染率が少なくフィットウイルスが過剰9に配置されている大規模なフィットネス差の検出を可能にすることをお勧めします。 、ウイルスの増殖動態、及びHIV-1サブタイプBを用いた競合アッセイを最適化した成長を行うためのTCID 50を測定するためのプロトコルは、PBMCを単一のドナーからNL4-3 COTB-P24、及びPBMCをHIV-する一貫性の感受性を示しましたin vitroで 1感染。培養期間このプロトコルで提示サンプリング時点は、ヒトPBMCにおいてHIV-1 M群ウイルスを研究するために適切であると思われます。単一のソースからのPBMCを使用することは非常にウイルスの複製は、異なるドナー細胞35に変化させることができるように一貫性のある結果を得ることをお勧めします。あまり望ましくないが、置換が同じプールをすべての実験全体で使用されていることを条件として、複数のドナーからプールされたPBMCを使用することができます。別の方法としては、細胞株の使用です。ここで紹介するプロトコルは、T細胞株CEMx174 23,36で正常に使用しました。しかし、播種した細胞の数は、一貫した細胞増殖を達成するために再最適化することが重要です。それは成長の競争段階で適切なサンプリング時点を決定するために、異なる細胞株において変化する可能性があるようにウイルスの増殖速度はまた、再確立されなければなりません。 適応度を計算するためのウイルスの比を決定するために、2つの異なる方法がprotocに含まれていますOL。最初は、各サンプリング時点でのウイルスcDNAのコピー数を測定するためにRT-定量PCRを使用しています。ウイルス複製適性は、その後のcDNAコピー数に基づいて、ウイルスの比から計算しました。あるいは、ウイルスの割合はVifABタグ部位でのクロマトグラムのピーク高さの比に基づいて決定することができます。二つの方法は、比較結果（ 図4）を得ました。クロマトグラムのピーク高方法が設計された配列タグなしで他のHIV-1株に適用することができます。 RT-qPCRを、ウイルスの変異体を区別するためのプライマーまたはプローブを使用することは最初に慎重に評価されなければならないために（20を参照）。しかしながら、RT-qPCRのは、指数増殖期中に最初の時点からのものなどのウイルスRNAの少量のサンプルについて良好な感度を提供します。ウイルスcDNAの直接測定は、また、RNA抽出およびcDNA合成から生じ得る技術的問題を検出することができます。配列タグとの分子クローンを使用すると、費用対効果の高いソリューションを提供するTRT-qPCRの方法Oのようなプライマーおよびプローブの2つだけのペアが複数のウイルスを研究するために必要とされます。この戦略はまた、シーケンスで、ピークの高さのばらつきの問題を回避するシーケンシングが研究中のすべてのウイルスで同じサイトで行われているように、起因隣接塩基37にクロマトグラム。 RT-qPCRのおよびサンガー配列決定のために生成されたPCR産物は、他の方法での使用は、個々のクローン12,13のバルク配列決定、HTA 4,7,17,19、またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA）38のようなウイルスの比率を決定することができ。

ウイルス複製適性は、与えられた環境で1感染性の子孫を生成するウイルスの能力として定義され、2時間かけて集団レベルでのウイルス変異の有病率を決定する重要な要因です。 in vivoでのように、トレーニングの研究では、in vitroでの様々なそのようなHIV-1などの病原性ヒトウイルス、と現実的ではないですし、ex vivoでの複製フィットネスアッセイは、薬剤耐性および免疫回避突然変異から生じるフィットネス、上位性と進化への影響を研究するために開発されてきましたウイルス集団3-6の。異なるフィットネスアッセイの中で、成長競合アッセイは、in vivo 1,7,8 で起こるように、2つ以上のウイルス変異体は、正確に同じ環境条件下で同じ細胞集団のために競うように、フィットネス差のより感度の高い、有効な対策をもたらすと認識されています。成長競合実験を開始する前に、いくつかのvariabレ感染の異なる多重度（MOI）を用い、ウイルスの入力比、および分析のためのサンプリングのタイミングを含む、決定する必要があります。我々は、ウイルスの増殖速度のと競合実験の結果に、これらのパラメータの影響を研究している、および細胞培養9中のHIV-1のフィットネスの強固な測定のために必要な重要な要素を同定しました。 変数をアッセイに加えて、成長の競合実験においてウイルス変異体を定量するための様々な方法があります。バルク10,11またはクローンの配列決定12,13は、目的の部位（複数可）でのヌクレオチドの頻度に基づいて、競合するウイルスの割合を決定するために使用されてきました。相対的なフィットネスは、時間をかけて、この比率の変化に由来します。 DNAシークエンシングサービスが広く利用可能であるように、この方法が便利です。並列対立遺伝子特異的配列決定（PASS）メソッドは、複数の部位で配列決定および組換え体14の検出を可能に</sup&gt;が、それはまた、特別に開発試薬および検出システムを必要とします。本質的に、これらの方法は、関心領域内のヌクレオチドの差異の数が少ないウイルス株を研究するために開発されました。他の方法は、4,7,17,19ヘテロトラッキングアッセイ（HTA）、配列決定によって競合ウイルスを区別するためにタグとして4,16-18小さなレポーター遺伝子15または同義突然変異を使用するか、または転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を逆転します関係なく、配列類似性の競合株を研究するために適用することができるこれらの全て（RT-qPCRの）15,16,18,20、。追加のステップは、ウイルスゲノムにタグを導入するために必要であり、RT-のqPCRアッセイはまた、特異的な試薬や機器を必要とします。我々は、バルクサンガー配列決定の利回り同等の結果9。 成長競争に続いて、ウイルス複製のフィットネスは、相対フィットネス、またはTとフィットネス比として提示されていますウイルスの変異体をめざし。ウイルスの相対的な適応は、接種物中または2つの競合するウイルス間の正味の成長率の差としての最初の割合によって正規化ウイルス変異体の最終的な割合として定義することができます。我々は、後者の方法は、唯一の指数増殖期内の縦のデータポイントを使用して、最も強力な結果9,20を生じたことを発見しました。 in vitroでのフィットネスアッセイは、生物学的クローン6-8とHIV-1の感染性分子クローンを研究するために主に使用されています。後者は、遺伝子操作に適している、多くの場合、特定の突然変異または関心3-5,21,22の特定の配列から、トレーニングの効果を研究するために使用されます。次のプロトコルは、ウイルスの増殖速度を、配列タグを含むHIV-1ベクターを使用して、新しいフルレングスの感染性HIV-1分子クローンを構築する目的の変異を導入、ウイルスストックを作製し、確立した時点からワークフローを記述します、相対的なフィットネスを成長競合アッセイを実施して計算する（ 図1）。 当社の最適化された手順を使用して、我々は3組換えHIV-1変異体を作成し、それらの複製のフィットネスを決定しました。組換え分子クローンは、第1の合成COTB（センターオブと、pNL4-3のHIV-1 のgag-P24遺伝子領域、HIV-1実験室株NL4-3の全長感染性ゲノムを含むプラスミドを置換することによって構築されましたプロトタイプ株を作成するために、ツリー、サブタイプB） のgag-P24配列 23。単一アミノ酸変化（T186M、T242N、およびI256V）は、次の3つの変異体のクローンを作成するために導入されました。各変異体は、特定の遺伝的背景の各突然変異の適応度への影響を観察するために、プロトタイプのウイルスに対して競合させました。原型ウイルスよりもわずかに有意に低いから複製fsitnessのレベルを変化させることを実証し3の変異体。 T242N突然変異は、以前適度なfitneを有することが報告されましたSSは、本研究で示した結果と同様の24-26、コスト。他の2つの変異の適応コストは以前に報告されていませんでした。

<table><tbody><tr><td>組換えクローン</td><td></td><td></td><td></td>の構築</tr><tr><td>キメラプライマー/変異原性/シーケンシングプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>カスタムDNAオリゴ</td></tr><tr><td>pNL4-3VifAおよびpNL4-3VifBプラスミド</td><td></td><td></td><td>ジェームズ・I・マリンズ博士(jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>ハイフィデリティバッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg;ジェネアンプ&reg;PCR System 9700</td></tr><tr><td>DNA loading dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 ケミカルコンピテンシー Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス ベースパウダー</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>研究製品 インターナショナル</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップ キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree プラスミド Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA トランスフェクション試薬</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.atcc.org/ 0.22 &#956;mフィルタートップチューブ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DulbeccoのModified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime;s修正ダルベッコ&素数;S Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Phytohemagglutinin (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底プレート</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル丸底プレート</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml チューブ (O リング付き</td>) <td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗HIV-1 SF2 p24 抗血清</td><td>NIH エイズ試薬プログラム</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>すべての曝露経路で重度の火傷を引き起こします。個人用保護具を使用してください。化学薬品ドラフトの下でのみ使用してください。すぐに大量の水で少なくとも15分間洗い流してください。</td></tr><tr><td>HIV p24 標準</td><td>AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td><td></td><td>ご注文の詳細については、Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov) までお問い合わせください。 http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td></tr><tr><td>RNA isolation cDNA synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp ウイルス RNA ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>First-strand buffer&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Rnase inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-time qPCR machine</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>タクマン&reg;遺伝子発現マスターミックス</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>ズ 4369016</td><td></td></tr><tr><td>フォワード、リバースプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>プローブ</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td></td><td>ズ カスタムオーダー</td></tr><tr><td>光学96ウェル反応プレート</td><td>ライフサイエンス</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+シーケンシング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ(バイオラーゼ)</td><td>バイオライン</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4バッファー&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシングプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>DNA シーケンシングサービスプロバイダー</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRCウェブツール</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChromatQuan ウェブツール</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitroフィットネスアッセイは、HIV-1などのウイルスに対するウイルス複製の適合性を決定するための不可欠なツールです。ウイルス複製の適応度を推定するために、感染ユニットあたりのウイルス粒子の数、細胞培養の増殖速度、マルチサイクル成長競争アッセイから得られる相対適応度など、さまざまな測定値が使用されています。成長競争アッセイは、ウイルスが同じ増殖条件下で細胞標的をめぐって競合しているため、特に感度の高い適応度の測定を提供します。成長競争アッセイを実施する際には、感染の多様性(MOI)、サンプリング時間、ウイルス検出および適応度の計算方法など、考慮すべきいくつかの実験要因があります。各因子は最終結果に影響を与える可能性があるため、実験計画では慎重に検討する必要があります。ここで紹介するプロトコルには、新しい組換えHIV-1クローンの構築から、成長競争アッセイの実施、実験結果の分析までのステップが含まれています。このプロトコルは、以前に示された実験パラメータ値を利用して、一貫性のある堅牢な結果をもたらします。いくつかのパラメータは、研究対象の細胞タイプとウイルスに応じて調整する必要があるため、代替案について説明します。このプロトコールには、2つの代替ウイルス検出法が含まれており、機器、試薬、専門知識の入手可能性がラボによって異なるため、柔軟性を提供します。

HIV-1のGag-P24における単一アミノ酸変化の適応度への影響を研究するために、我々はHIV-1 COTB-P24遺伝子23,32,33を含むpNL4-3プラスミドに変異を導入するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用していました。ウイルスストックは、293T細胞のトランスフェクションによって生成され、48時間後に回収しました。我々は、リード-ミュンヒ法31により各ウイルスストックの50％組織培養感染量（TCID 50）を推定しました。プロトタイプと変異体ウイルスのTCID 50は 10 4から10 5 IU / mlで（ 図3A）の範囲でした。 組換えウイルスの増殖動態は、0.005のMOIで、単一のドナーからのPBMCに設立されました。 RT-qPCRを、6日間毎日ウイルスcDNAコピー数を測定しました。ウイルスRNAのコピー数の増加の減少勾配によって示されるように、すべての変異体およびプロトタイプウイルスは&lt;（、、2日目と4日目の間に指数関数的にウイルスの増殖を遅く次のように成長しました強い&gt;図3B）。 0日目（接種物に相当）と2日目の間のcDNAコピー数の減少は、細胞へのウイルスの吸収と1日目の洗浄（ステップ5.1.6）によって結合していないビリオンの除去によるものです。指数増殖期では、すべての3つの変異体は、原型ウイルス（ 図3C）よりも遅い成長速度（g）を有していました。 すべての3つの変異体は、0.005の合計MOIで成長競合アッセイで原型ウイルス競いました。二重感染した培養物中のウイルスの増殖速度は、単一菌感染の場合と同様でした。ウイルスの指数増殖期は、2日目と4の間で、ウイルス増殖は、5日目（ 図4A）の周りにプラトーに達しました。 ウイルスの増殖速度の差は経時ウイルス比率の変化に由来しました。ウイルス比はcDNAコピーの参照の数とRT-qPCRのを使用して、変異体ウイルスであり、比較ピーク高さにより計算しましたシーケンス内の2つのウイルス（ 図4B）を区別するヌクレオチド部位でクロマトグラム。ピーク高さおよびウイルスRNAのコピー数の方法を用いて決定成長速度の違いは、同様の結果（ 図4C）を得ました。すべての3つの変異体は、最も低いフィットネス（ 図4C）を有する変異I256Vとプロトタイプのウイルスよりも低い複製のフィットネスを持っていました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> 図1：本論文でのプロトコルのフロー図ウイルスストックのウイルス調製プロトコルの懸念のHIV-1組換えクローンの構築および生成。フィットネスアッセイプロトコルは、ウイルスの増殖速度を確立し、相対的なウイルスの適応度を決定するためのものです。破線は、プロトコルのための代替フローを表します。例えば、突然変異は、HIV-1 NL4-3に直接導入することができ組み換えクローンを作成することなく、分子クローン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> 図2：オーバーラップ伸長PCR（A）を使用して、HIV-1 NL4-3 COTBギャグ-P24組換え分子クローンの構築キメラプライマーを設計します。 5 &#39;プライマーの半分はNL4-3ベクター配列を含み、3&#39;半分は、挿入配列の末端を含みます。 （B）キメラプライマーは、挿入断片、COTBのGag-P24を増幅するために使用されます。 （C）挿入断片は、新しい組換えプラスミドを生成するために第2のPCRのためのプライマーとして使用されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> 図3：PBMCにおけるウイルス増殖特性（A）ログ10 TCID 50 </sUB&gt;ウイルスストックの。 （B）MOI = 0.005で開始monoinfectionsにおけるウイルス増殖動態。パネル（B）に由来する指数増殖期（日2-4）を含む6日間の（C）は、ウイルスの増殖速度、。表示される値は、一つの実験からの3つの複製の平均を表します。エラーバーは95％信頼区間を表します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> 図4：ウイルスの増殖および相対フィットネスの決定（A）二重感染したPBMC培養におけるウイルスの増殖。 T242Nプロトタイプウイルスの（B）比は、RT-qPCRをシークエンシングまたはピーク高さ法を用いて決定しました。 （C）二重感染した培養物中の変異体およびプロトタイプウイルス間ネットウイルス増殖率の差（D）、（A）に示すようにd値は、fを計算しました（B）に示したウイルスの割合データをROM。表示される値は、一つの実験からの3つの複製の平均を表します。エラーバーは95％信頼区間を表します。

ほぼ同質遺伝子のウイルス間の成長競争は、相対的な複製適応度を決定するための高感度な測定を提供します。ここで説明するプロトコルには、組換えHIV-1クローンの構築、ウイルスの増殖と増殖の競合、および高感度で一貫性のある結果を得るために最適化された分析方法が含まれます。

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

本手順の全体的な目的は、目的のHIV-1株の相対的な複製適応度を決定することです。これは、まず目的のHIV-1全長配列を含むウイルス分子クローンまたはDNAプラスミドを構築することによって達成されます。第2のステップでは、DNAトランスフェクションにより、各分子クローンのウイルスストックを作製します。次に、単一感染させた細胞培養物の経時的なサンプリングにより、各HIV-1株の増殖速度論および指数増殖期を確定させます。最終ステップとして、細胞培養物におけるペアごとの増殖競合または二重感染を行います。最終的に、逆転写、定量リアルタイムPCR、およびサンガーDNAシーケンシングから得られたDNA配列クロマトグラムのピーク高を用いてウイルス比を決定し、それに基づいて相対的なウイルス複製適応度を算出します。パラモノ感染や2時点デュアル感染などの既存の方法と比較して、本手法の主な利点は、2つのウイルス株間の複製適応度の差をより感度高く、かつ堅牢に測定できる点にあります。本論文で提示するプロトコルには、HIV-1組換えクローンの構築、部位特異的変異導入による目的の変異の導入、ウイルスストックの作製、ならびにウイルス増殖キネティクスの確立および相対的なウイルス適応度の決定のための適応度アッセイの実施が含まれます。本ビデオでは、増殖競合および2つの異なる手法について実演します。フィットネスを算出するためのウイルス比を決定するには、その他のすべての手順についてプロトコルの本文を参照してください。増殖競合アッセイの準備として、48ウェル平底プレートの1ウェルあたり合計500 µLの容量で、3×10⁵個のPHA刺激末梢血単核細胞（PBMC）を播種します。接種まで、プレートを37 °C、5% CO2雰囲気下で保持してください。次に、各ウイルスにつき6,000 IUを含む3 mLの接種液を調製します。一般的な実験では複数の変異体がテストされますが、本デモンストレーションでは、プロトタイプウイルスに対して1種類の変異体のみをテストします。感染価が非常に高いウイルスストックを使用する場合、段階希釈が必要になることがあるため、ウイルス接種液の適切な調製はこの手順において極めて重要なステップとなります。各ウイルス接種液1.5 millilitersを滅菌チューブに移し、二重感染用接種液を作成します。48ウェルプレートの各ウェルにあるPHA刺激PBMCに、二重接種液を500 µLずつ加えます。最終的な培養液量は1ウェルあたり1 mLとなります。RNA抽出用として、二重接種液を2枚の96ウェルプレートに1ウェルあたり200 µLずつ分注します。そのうち1枚はバックアップとして保存してください。接種した細胞を37 °C、5% CO2雰囲気下で16〜24時間インキュベートします。接種から16〜24時間後、培養物を洗浄し、培養上清を750 µL除去して廃棄した後、新鮮な完全Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（cIMDM）を750 µL加えます。プレートをプラスチックラップで包み、10分間遠心分離します。300 gで遠心した後、上清を750 µL除去して捨てます。新鮮なcIMDMを750 µL加えます。プレートを37 °C、5% CO2雰囲気下でインキュベートします。サンプリング時間は、ウイルスの対数増殖期に少なくとも3つの時点が含まれるように選択してください。サンプルを回収するには、培養上清 500 µL を 1.8 mL 遠心チューブに移し、3000 g で 1 分間遠心分離します。細胞除去後の上清 200 µL を、RNA 抽出用に 2 枚の 96 ウェルサンプルプレートに移します。この際、1 枚をバックアップとして保存してください。上清は RNA 抽出まで -80 °C で保存します。各培養物に500 µLの新鮮なcIMDMを加え、次回のサンプリング時間までプレートをインキュベーターに戻します。続いて、サンプルからRNAを単離し、cDNA合成を行います。ウイルス比を決定するための2つの方法を実演します。1つ目は逆転写定量リアルタイムPCR（RT-qPCR）を用い、2つ目はクロマトグラムのピーク高を用います。qPCRでは、プラスミドpNL4-3VifAを各段階で10倍に希釈し、3 × 10⁶ copies/µLから30 copies/µLまでの標準連続希釈系列を3連（triplicate）で調製します。その後、96ウェルqPCR反応プレートを準備します。各プレートには、少なくとも1つの陰性対照、3連の標準希釈系列、および各cDNAサンプルの2連（デュプリケート）を含める必要があります。陰性対照、標準希釈系列、およびcDNAサンプルのうち1つの2連でのシグナル検出には、vFIAプライマープローブを使用します。cDNAサンプルのもう一方の2連には、vIFBプライマープローブを使用します。各qPCR反応につき、12.5 µLのqPCRマスターミックス、0.2 µMのqPCRプローブ、フォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ0.8 µM、および1 µLのcDNAを使用します。標準希釈系列については、cDNAの代わりにpNL4-3VifAの連続希釈液を添加し、陰性対照については、cDNAの代わりに水またはバッファーを使用します。PCRサイクリングパラメータは、qPCR装置のメーカーが提供する操作説明書に従って設定してください。標準希釈系列から得られた増幅データを用いて、標準曲線を算出します。cDNAサンプルの増幅データを標準曲線と比較し、コピー数を決定します。ウイルス増殖率の計算式またはGRCウェブツールを用いて、相対的なウイルスフィットネスを算出してください。RT-qPCRステップで得られたcDNAコピー数を、指定された形式で入力します。「calculate（計算）」を選択すると、競合する2つのウイルス間の純増殖率の差が出力されます。クロマトグラムのピーク高を用いてウイルス比を決定するには、VIF forwardプライマーおよびVIF reverseプライマーを用いて、VIFAB配列タグを含むHIV-1 Vif断片をPCR増幅します。各PCR反応には、1 µLのcDNA、1X NH₄バッファー、1.5 mMのMgCl₂、0.2 mMのdNTPs、2.5 UのTaqポリメラーゼ、および各プライマーを0.45 µM使用してください。最終容量が50 µLとなるように水を加えます。PCRのサイクル条件を、94 °Cで1分、55 °Cで1分、70 °Cで1分の3サイクルに設定し、続いて94 °Cで15秒、58 °Cで30秒、70 °Cで1分の34サイクル、最後に4 °Cで保持するように設定します。その後、市販のキットを用いてPCR産物を精製し、精製したPCR産物をDNAシーケンシングサービスプロバイダーに提出してサンガーシーケンシングを行います。シーケンシングサービスから提供された平均リードクオリティスコアを確認します。平均塩基コール精度が85%未満である場合は、PCR増幅、PCR産物の精製、およびサンガーシーケンシングをやり直してください。Chromat quantitativeウェブツールを使用して、各時点におけるウイルス比を算出します。必要な入力データは、リーダー配列と.ab1形式のシーケンスクロマトグラムファイルです。本ツールは、指定された部位におけるピーク強度を測定します。ピーク強度の比は、2つのウイルスの比に相当します。GRCウェブツールを使用して、相対的なウイルスフィットネスを算出してください。入力データは、指定された形式で表示されているChromat定量ウェブツールを用いて取得したシーケンスクロマトグラムのピーク高さです。GRCウェブツールは、競合する2つのウイルス株間の純増殖率の差を算出します。プロトタイプおよび3つのHIV変異ウイルスを構築し、PBMCにおけるそれらの増殖特性を評価しました。TCID 50は10⁴から10⁵ IU/mLの範囲でした。すべてのウイルスは2日目から4日目にかけて指数関数的に増殖しました。指数増殖期において、3つの変異株すべてがプロトタイプウイルスよりも低い増殖率を示しました。合計MOI 0.005での増殖競合アッセイにおいて、各変異株をプロトタイプウイルスと競合させたところ、二重感染培養におけるウイルスの増殖キネティクスは単独感染の場合と同様でした。ウイルスの指数増殖期は2日から4日の間であり、ウイルスの増殖は5日目あたりでプラトーに達しました。ウイルスの増殖速度の差は、経時的なウイルス比の変化から導出されました。ウイルス比は、RT-qPCRを用いて参照ウイルスおよび変異ウイルスのcDNAコピー数を算出する方法と、2種類のウイルスを区別できるヌクレオチド部位におけるシーケンスクロマトグラムのピーク高を比較する方法に基づいて算出され、プロトタイプに対してT242-N変異体が比較されました。この例では、2つの方法を用いて決定された増殖速度の差は、同様の結果を示しました。3つの変異体すべてにおいて、プロトタイプウイルスよりも複製適応度が低く、特にI256-V変異体で最も低い適応度を示しました。このビデオを視聴することで、HIV-1の相対的な複製適応度を決定するためのペアワイズ増殖競合アッセイの実施方法について、十分に理解できるはずです。

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

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An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

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HIV-1感染T細胞における小胞体ストレスとアンフォールドタンパク質応答の測定とHIV-1複製におけるその役割の解析

学ぶHIV-1の複製フィットネス測定法。ペアごとの成長競合アッセイを用いて、リアルタイムPCRとクロマトグラムピーク高さでウイルス比を定量し、相対的な複製適応度を算出する信頼性の高い手法です。

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

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