DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

この手順の全体的な目標は、自動ミキサー装置を使用してマイクロアレイ実験を行うことです。これは、まずバイオアナライザーでRNAサンプルの品質を分析し、その後、RNAの増幅と標識を行うことで達成されます。RNAサンプルはマイクロアレイにハイブリダイズされます。

最後に、ハイブリダイズされたマイクロアレイを洗浄し、スキャンします。最終的には、二色蛍光マイクロアレイ画像の解析を通じて、RNA転写産物の差次的発現を示す結果が得られます。マイクロアレイハイブリダイゼーションのステップは特殊な機器のために習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。

品質管理分析は、書面による手順の指示に従って、2、100バイオアナライザー機器とチッププライミングステーションの準備から始まります。次に、ゲルマトリックスを550マイクロリットルをピペッティングして、RNA 6, 000ナノキット遠心分離機を備えたスピンフィルターにろ過します。室温で10分間、1, 500 RCFでフィルター。

次に、ろ過したゲルを65マイクロリットルのアリコートに分注し、摂氏4度で最大1か月間保存できます。染料濃縮物を10秒間ボルテックスし、65マイクロリットルのアリコートに1マイクロリットルを追加します。混合物をボルテックスした後、ろ過されたゲルで、室温で10分間、13, 000 RCFで遠心分離

まず、プライミングステーションにチップを配置します。このデモンストレーションでは、RNA 6, 000ナノチップスが使用されています。9マイクロリットルのゲル染料混合物を、黒の背景に白いGでマークされたウェルに入れます。

ピペットの先端をウェルの一番下に配置した状態。シリンジプランジャーを1ミリリットルに置き、プライミングステーションを閉じます。プランジャーをゆっくりと、しかし着実に押し下げて、クリップに固定します。

30秒後、クリップを放し、プランジャーが数秒間上昇するのを待ちます。プランジャーが停止したら、プランジャーを1ミリリットルの位置に戻し、プライミングステーションを開きます。ゲルダイの9マイクロリットルをロードします。

2つのウェルをそれぞれ混合します。Mark G.次に、マーカーの5マイクロリットルをはしごウェルと12のサンプルウェルのそれぞれにペットで入れます。次に、ラダーウェル内の変性ラダーの1マイクロリットルと、サンプルウェルへの各変性サンプルの1マイクロリットル。

最後に、未使用の各サンプルにマーカーを1マイクロリットル追加します。よくロードされたら、2、400 RPMで1分間チップをボルテックスします。2, 100エキスパートソフトウェアを起動した後、チップを配置し、蓋を閉めます。

正しいポートが選択されていることを確認し、サンプルをロードしてから5分以内にアッセイを実行して、蒸発を防ぎます。RNA増幅および標識を行う方法は、文書化されたプロトコルに記載されています。標識したら、CRNAを精製して未取り込まれのヌクレオチドを除去します コーゲンと簡単なミニカラムを使用して、標識されたCRNAをNanoDrop 2000スペクトル光度計で定量できます。

マイクロアレイ測定モードでは、サンプル濃度、収量、および特定の活性を記録します。マイクロアレイハイブリダイゼーションのためには、マイクロアレイハイブリダイゼーションの少なくとも2時間前に、少なくとも825ナノグラムの収率および少なくとも8μグラム当たりの比活性を達成する必要がある。ハイブリダイゼーションステーションの電源を入れ、摂氏65度に設定します。

このプロトコルは、書かれたプロトコルに記載されているように行われたCRNAフラグメンテーションに続くRocheの機敏なゲンハイブリダイゼーションシステムおよび4つのミキサーチャンバを備えたAgilentの4×40 4Kアレイの使用について説明し、ハイブリダイゼーションチャンバを調製する。アセンブリ分解ツールのバーコード側にマイクロアレイスライドを配置します。まず、A4ミキサーを開き、アレイとアセンブリ分解ツールを保持している接着剤を露出させて、動きを防ぎます。

A 4ミキサーを遠端からスライドに置きます。ツールに正しく位置合わせされていることを確認し、ミキサーをアレイに沿って接着します。ミキサーの端からスライドプルして、スライドミキサーアセンブリを取り外します。

ブレイリングツールを使用して、接着ガスケット全体を押し、スライドにしっかりと接着されていることを確認します。接着剤とスライドの間に挟まれた小さな気泡が、暗い背景に対して見ることができます。ブレイイングツールでこれらの気泡を取り除くには、さらに時間をかけてください。

これで、配列をロードする準備が整いました。容積式パーペットを使用して、100マイクロリットルのハイブリダイゼーションサンプルをロードします。先端を舷窓の内側にしっかりと押し込み、アレイ領域に空気が閉じ込められないようにゆっくりとスムーズにディスペンスします。

サンプルがアレイ全体を覆い、液体がベントポートから出始めたら、ピペットをすばやく取り外し、プランジャーのみをリリースします。先端がスライドから離れたら、チャンバー自体からサンプルを引き出さないように注意しながら、両方のポートで余分な液体を軽くたたきます。次に、ピンセットを使用して舷窓をステッカーで覆います。

スライドをハイブリダイゼーションステーションに置き、ブラダーホールがOリングの上に正しく配置されていることを確認します。これにより、ハイブリダイゼーション中の適切な混合が保証されます。スライドカバーとステーションの蓋を閉じます。

ステーションをミキシングモードBに設定し、アレイを摂氏65度で17時間ハイブリダイズします。完成したら、フィラーガラス皿にAとラベル付けされ、洗浄バッファー1で、皿はアセンブリ分解ツールを保持するのに十分な大きさで、ある程度の操作を可能にする必要があります。プラスチックは化合物を浸出させ、アレイのバックグラウンドが高くなる傾向があるため、すべての洗浄はガラス器具で行う必要があります。

スライドラックと攪拌棒をステンディン皿に入れます。Bとラベル付けされた、ラックを覆うウォッシュバッファー1を皿に充填し、室温で皿を攪拌プレートに置きます。また、Cとラベル付けされた空の染色皿に攪拌子を追加し、攪拌プレートに置きます。

アレイをハイブリダイゼーションステーションから取り外し、アセンブリ分解ツールに配置します。アセンブリ分解ツールとスライドを反対側から片手で持ちながら、アセンブリ全体を皿に沈めます。アレイ領域を傷つけないように注意しながら、Aフォーミキサーを慎重に剥がします。

スライドをラックと染色皿にすばやく置きます B.SCI 5染料はオゾンに敏感であるため、空気への曝露を最小限に抑える必要があります。中速で攪拌しながら、消去物を1分間洗浄します。染色皿Cに予熱洗浄緩衝液2を充填します。

スライドを移し、1分間洗います。非常にゆっくりと洗浄した後、スライドラックを染色皿Cから取り外して、スライドに残る液滴を最小限に抑えます。スライドを2分間回転させて乾かします。

次に、スライドを50ミリリットルの円錐管に入れ、分子デバイスからの遺伝子ピック4、000 Bスキャナーを使用してすぐにアルゴンガススキャンを充填し、示されている信号損失を回避します。以下は、ヒトの脳から単離された4つのRNAサンプルの例です。腫瘍組織サンプルの品質は、RNA 6, 000チップ上の2, 100バイオアナライザーを使用して評価されました。

実線と開いた矢印は、それぞれ 18 s 種と 28 種の S-R-R-N-A 種の位置を示しています。RNAインテグリティナンバーまたはRINは、RNA品質の良好な品質の合計の定量的測定値です。RNAサンプルは、2つの主要なリボソームRNA種に対応する品質管理のためにバイオアナライザーで分析すると、2つの主要なピークのみを生成する必要があります。

一部の RNA 分解は、最初のリボソーム RNA ピークの前に塗抹標本として現れ、28 S-R-R-N-A のピークが著しく低下すると、ピークが著しく低下します。低品質のRNAは、短い保持時間で広範なピークまたは一連のピークを示します。一方、2つのリボソームRNAのピークは非常に低い強度であるか、まったく識別できません。

良質のアレイは、比較的低いPMT値で高い信号を生成する必要があります。ほとんどの転写産物は、実験サンプルと参照サンプルに同様のレベルで存在すると予想されます。遺伝子発現の大規模な広範囲にわたる変化は、おそらく生物学的な意味を欠くでしょう。

したがって、ほとんどの配列は緑や赤ではなく黄色に見える必要があります。また、良好な品質の信号は、配列イメージの散布図に見られるように、信号ヒストグラムが完全にオーバーラップするダイナミック レンジ内にある必要があります。このビデオを見れば、自動ハイブリダイゼーション装置を使用したマイクロアレイ実験の方法について十分に理解できるはずです。