ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

この手順の全体的な目標は、比較ゲノムハイブリダイゼーションをアレイ化して、さまざまな遺伝病につながる可能性のあるゲノムの不均衡を特定することです。これは、最初に患者のDNAを蛍光色素で標識することによって達成されます。第2のステップでは、患者、DNAおよび異なる標識参照DNAをアレイにハイブリダイズする。

次に、アレイをスキャンして、各プローブに豊富に存在する患者と参照DNの量を測定します。最後のステップでは、スキャンされた画像が処理され、患者のDNAが参照DNAの最終的な配列よりも多かれ少なかれ材料を持つゲノムの領域が特定されます。比較ゲノムハイブリダイゼーションは、患者が遺伝性症候群を引き起こすコピー数変異を持っているかどうかを判断するために使用されます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、アレイスライドの組み立てが困難であり、ハイブリダイゼーションが容易であるため、非常に重要です。チャンバーからこぼれたものを混合します 標識反応を開始する前に。ヌクレオチドとプライマーのすぐに使える96ウェルプレートを摂氏4度で解凍し、約1時間光から保護します。

解凍後、蓋をしたプレートを室温でさらに30分間平衡化し、このときもDNAサンプルを摂氏60度で15分間平衡化します。サンプルが温まっている間に、リキッドハンドリングロボットを使用して、新しい96ウェルプレートの各ウェルに十分なヌクレアーゼフリーの水を分注します。次に、DNAの準備ができたら、ウェルごとに1マイクログラムのサンプルを96ウェルプレートの水に移します。

次に、20マイクロリットルの平衡化ヌクレオチドとプライマーを希釈したDNAサンプルを含むプレートのそれぞれに移し、プレートをストリップキャップで密封します。次に、10分後に加熱された蓋付きのPCRマシンでDNAを摂氏99度で変性させ、プレートを氷上で5分間スナップ冷却してプライマーを膝に留めます。次に、リキッドハンドリングロボットを使用して、10マイクロリットルのクリーンアウトされたexo DNAポリメラーゼ酵素を各サンプルに加えます。

ピペットでサンプルを混合し、プレートを37°Cで16時間密封してインキュベートします。翌日、ウェルあたり5マイクロリットルのストップバッファーで反応を終了し、その後、取り込まれていないヌクレオチドを除去します。各ウェルの内容物を、事前にラベル付けされた個々の2ミリリットルチューブに移します。

サンプルとDNA精製スピンカラムをスピンカラム処理ロボットにロードし、適切な関連バッファーをロードします。メーカーの指示に従って、スピンカラム処理ロボットは、チューブあたり250マイクロリットルの高塩DNA結合バッファーで標識されたDNAをシリカメンブレンに結合し、その後、不純物はそれぞれ500マイクロリットルの洗浄バッファーを2回洗浄してメンブレンから除去されます。次に、ロボットは15マイクロリットルの低塩溶液緩衝液をメンブレンに追加して、精製された標識DNAサンプルを約12マイクロリットルの容量で回収し、サンプルをハイブリダイズします。

次に、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏65度に予熱し、バッキングスライドとハイブリダイゼーションチャンバーを予温します。ハイブリダイゼーションミックスを調製するために、1.1マイクロリットルのベビーベッド1D NA4.95マイクロリットル、製造業者が供給したブロッキングミックス、および24.75マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを組み合わせる。リキッドハンドリングロボットを使用して、この混合物を新しい96ウェルプレートの各ウェルに割り当て、各チップを事前に濡らして、転写精度を向上させます。

次に、適切な標識の9.35マイクロリットル、3つの標識DNAをピペットで、続いて9.35マイクロリットルの適切な標識、5つのDNA標識をピペットで取り付けます。各ウェルにプレートを密封し、サンプルを1分間4倍にし、プレートを素早く回転させて各ウェルの底に内容物を収集します。標識されたDNAをプレハイブリダイゼーションインキュベーターで十分に変性させます。

最初は摂氏95度で3分間、次に摂氏37度で30分間。次に、摂氏42度の加熱プラットフォームで作業します。バッキングスライドをハイブリダイゼーションチャンバーに配置し、ガスケットの透明部分がハイブリダイゼーションチャンバーの窓付き部分と整列することを確認します。

次に、ハイブリダイゼーションミックスの42マイクロリットルをアレイバッキングスライドの適切な位置の中心にゆっくりとピペットで移します。液体がゴムリング境界に触れないように注意してください。すべての位置が埋まったら、アレイスライドをバッキングスライド上に慎重に下げ、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立てます。

書き込みのあるアレイの側面がバッキングスライドに面していることを確認してから、ハイブリダイゼーションチャンバーのネジを完全に締めて、組み立てたハイブリダイゼーションチャンバーを検査し、ハイブリダイゼーションの漏れがないことを確認します。ゴムリングの境界の外側で混合し、各気泡の高さが約4ミリメートルになるようにします。ハイブリダイゼーションチャンバーが垂直に端に置かれている場合は、ハイブリダイゼーションチャンバーを回転させて確認します。

各位置のすべての気泡が動いています。気泡のいずれかが詰まっている場合は、チャンバーのベンチを鋭く叩きます。次に、ハイブリダイゼーションチャンバーを摂氏65度の回転オーブンに24時間入れます。

翌日、ハイブリダイゼーションチャンバーを洗浄バッファー1に沈め、一対のプラスチック製のフラットエッジ鉗子を使用してスライドをこじ開けます。次に、ガスケットスライドを廃棄し、アレイスライドをラックに置き、新しいバッファー1に沈めます。アレイスライドを約700ミリリットルの洗浄バッファーで1〜5分間洗浄し、ノミとマグネティックスターで激しく攪拌します。

次に、アレイスライドを約700ミリリットルの洗浄バッファーに、2回目の洗浄の終わりにさらに激しく攪拌しながら90秒間2回移動します。アレイをゆっくりと持ち上げて、バッファからスライドさせます。彼らは乾いて現れるはずです。

次に、アレイスライドをスライドプロテクターと一緒にスキャナーのスライドホルダーにロードし、サンプルをスキャンします。アレイの製造元の指示に従って、ハイブリダイズアレイ上の各プローブは、赤と緑の蛍光色素の混合物として視覚化されます。各プローブの赤色と緑色の蛍光シグナルの比率は、スキャナーによって定量化され、関連するソフトウェアによって、ゲノム位置に応じてlog 2の比率としてロットされます。

結果として得られる配列トレースにより、ゲノム的に不均衡であると識別された領域の解釈が可能になります。例えば、ウィリアムズ症候群の小児からのこのトレースでは、7番染色体の近位領域における低コピーリピートによって媒介される再発性微小欠失症候群であり、ゲノムの不均衡は、赤い線でソフトウェアによって同定された。プロップ蛍光対数比はゼロ付近に密集し、ゲノムの正常領域では緑と赤の比率が1対1であることを示しています。

このスキャンで観察されたような散乱アレイトレースは、異常な領域の不正確な呼び出し、またはゲノムの不均衡の特定の失敗をもたらす可能性があり、DNA品質の低さ、光線の存在、大気圏内のオゾンレベルなど、多くの要因によって引き起こされる可能性があります。このビデオを見れば、A CGHによる試験のために患者サンプルを処理する方法と、下流の分析とコピー数多型の検出のための高品質のデータを生成する方法について十分に理解できるはずです。