Name: ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ アレイCGHによるゲノムコピー数変異の検出法。蛍光標記した患者DNAと参照DNAをアレイにハイブリダイゼーションし、スキャンしてゲノム不均衡を特定します。遺伝性疾患の診断精度向上に貢献する強力な遺伝子診断ツールです。

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1.標識反応<ol><li> 96ウェルプレートおよび使用の準備-20℃で保存し、製造業者が推奨する濃度において、プレアリコートシアニン3及び5標識dUTPs、非標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを使用する前に。このプロトコルは、各ウェルにdUTPを10.5μlの未標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを標識し、適切のアリコート10.5μlのの目的のために。 </li><li>光から保護し、約1時間、4℃でヌクレオチドおよびプライマーのすぐに使用できる96ウェルプレートを解凍する。 </li><li>解凍後は、光から保護し、少なくとも30分間室温でこのプレートを平衡化する。 </li><li>少なくとも15分間、60℃でDNAサンプルを平衡化する。 </li><li>液体ハンドリングロボットを用いて、96ウェルプレートの各ウェルにヌクレアーゼフリー水を分配する。 注記：水の体積は、各入力DNA試料の濃度に依存し、そして/μlの最終濃度50ngをもたらすのに十分であるべきである。 </li><li>液体漢の使い方dlingロボット、96ウェルプレートのウェルにピペット1μgのDNAは、（1.5を参照）20μlに全量を。 注記：結果データの品質が損なわれる可能性があるが、DNAの小さい量を使用することができる（貴重なサンプルのために、400ngのまでインプットDNA量を使用することができる）。 </li><li>液体ハンドリングロボットを用いて、希釈したDNAのプレートの各ウェルに平衡化ヌクレオチドおよびプライマーの20μlのを転送する。 </li><li> （気密シールは非常に重要です）ストリップキャップで96ウェルプレートをシール。 </li><li>加熱された蓋をPCR機で10分間、99℃でDNAを変性させ、その後アニールするプライマーを氷上で5分間クールスナップ。 </li><li>液体処理ロボットを用いて、徹底的にそれぞれのDNAとピペットミックスにクレノウエキソDNAポリメラーゼ酵素の10μlを添加する。 注：総容積は50μlである必要があります。 </li><li> 96ウェルプレートを密封し、16時間37℃でインキュベートする。 注：4時間の短いインキュベーションしかし十分ですO / Nでcubationはより便利にすることができます。 </li><li>液体ハンドリングロボットを用いて、各ウェルに停止緩衝液の5μlを添加する。 NOTE：ラベリング反応に使用される試薬の概要を表1に示す。 </li></ol>取り込まれなかったヌクレオチドの2の除去<ol><li>シリカメンブレンベースのスピンカラムと専用のスピンカラム処理ロボットを使用して、取り込まれていないヌクレオチドを​​除去（スピンカラムは、手動で処理されてもよい）。製造元の指示に従ってください。 <ol><li> 2ミリリットルチューブに、各ウェルの内容を転送。よくIDをこれらを事前にラベルを付けます。 注：このステップでは、液体ハンドリングロボットを用いて手動で、または好適に行うことができる。 </li><li>スピンカラム処理ロボットを使用している場合は、2ミリリットルチューブ、DNA精製スピンカラムおよび関連するバッファを備えたロボットをロードします。 </li><li>シリカに標識されたDNAを結合するために標識反応を250μlの高塩、DNA結合緩衝液（バッファPB）を追加膜。 </li><li> 500μlの洗浄バッファー（PEをバッファリング）で2回膜を洗浄することにより不純物を除去する。 </li><li> 〜12μLの容量において、精製、標識DNAを回収するために、膜に15μlの低塩の溶出緩衝液を（EBをバッファリング）を追加します。 </li></ol></li></ol> 3. Hybをペアの組み合わせ<ol><li>シアニン3と5標識DNAの適切なペアを組み合わせて、COT-1 DNA、メーカー提供の阻止ミックスと液体処理ロボットを使用して、製造業者が提供するハイブリダイゼーション緩衝液。 注：共有のCNVが問題でない場合、彼らは非常にあるように、これらのHYBペアは、 例えば、私たちは日常的にそのような頭蓋骨癒合症の患者VS腎形成不全患者などの表現型不一致のサンプルを、ペア（サンプルおよび参照、またはサンプル対サンプルであってもよい）同じ臨床的に有意なCNVを運ぶ可能性は低い。参照DNAを使用している場合は、市販のDNA供給が推奨され、それがサンプルと一緒に処理されるべきである。 <ol><li>液体処理ROを使用して、ボット、COT-1 DNA（3333 ngの/μl）を追加し、製造業者が提供する各ウェルに1.1μlのCOT-1 DNA、4.95μlの遮断ミックス24.75を含むように96ウェルプレートの各ウェルに混合し、ハイブリダイゼーションをブロッキング緩衝液μlのハイブリダイゼーション緩衝液。 </li><li>各ウェルに適切なシアニン3標識DNAの9.35を添加する。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。 </li><li>各ウェルに適切なシアニン5標識DNAの9.35を添加する。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。 </li><li> 1分間、96ウェルプレートボルテックスをシール。各ウェルの底に内容物を収集するために96ウェルプレートをスピン。 </li></ol></li></ol> 4.ハイブリダイゼーション<ol><li> 65℃のハイブリダイゼーションオーブンを予熱し、1バッキングスライドと各アレイスライドの1つのハイブリダイゼーションチャンバーをprewarm。 <ol><li>アレイに適用される前に、プレハイブリダイゼーションインキュベーションで標識されたDNAを変性さ。 24時間、回転オーブンでハイブリダイゼーションを実行します。 </li><li> 30分間、70℃で96ウェルプレートをインキュベートした後、少なくとも5分間37℃で残す。 </li><li> 42℃で加熱されたプラットフォーム上での作業、使用する前に、ハイブリダイゼーションチャンバ内に各バックアップのスライドをロードします。ガスケットスライドの透明部分は、ハイブリダイゼーションチャンバーの「窓」の部分と整列していることを確認してください。 </li><li>ピペットで先に調製したハイブリダイゼーション混合物の42μlをスライドバッキングアレイ上の適切な位置に（セクション3を参照）。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。ピペットでゆっくり確認しながら各位置の中心、上に液体がゴムリングの境界に触れていません。 </li><li>バッキングスライド上のすべての位置が満たされると、慎重に上のアレイスライドを下げ、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立てる。それへの書き込みを持つ配列の側はバッキングスライドに直面していることを確認してください。完全にハイブリダイゼーションチャンバーのネジを締めてください。 </li><li>組み立てられたハイブリダイゼーションチャンバーを点検。 Eハイブリダイゼーションチャンバーが垂直方向の端部に載置されたときにゴムリングの境界外のハイブリダイゼーション混合物の漏れ、各気泡がないことをnsureは、高さが約4 mmである。ハイブリダイゼーションチャンバーを回転させた位置で立ち往生し、動いていないに気泡がないことを確認してください。これらのいずれかがある場合は、室のベンチに鋭いタップを与える。すべての気泡が移動していることを確認してください。 </li><li> 24時間、65℃で回転オーブンにハイブリダイゼーションチャンバーを配置します。オーブンロータがバランスしていることを確認します。必要に応じて他の空室を使用しています。 </li></ol></li></ol> 5.洗浄およびスキャンスライド<ol><li>過剰標識DNAを除去した後、各プローブの蛍光を測定するためにスキャンするために、配列を洗ってください。 <ol><li>オーブン逆アセンブルの外にハイブリダイゼーションチャンバーを取る。アレイおよびガスケットスライドが一緒に立ち往生するでしょう。洗浄バッファー1でこれらを沈めると離れて、それらをてこのようにプラスチック、フラットエッジのピンセットを使用しています。 </li><li>ディガスケットスライドをSCARD、バッファ1に沈めラックに配列スライドを配置します。 </li><li>激しく撹拌し、5分間、新鮮な洗浄バッファー1の〜700ミリリットルの配列のスライドを洗う（ノミと磁気攪拌機を使用します）。 </li><li> 〜700ミリリットルの洗浄バッファー2への配列のスライドを移し、激しく撹拌し、90秒間洗浄します。静かに洗浄バッファー2から配列スライドを持ち上げ、彼らはドライ出現する必要があります。 </li><li>スライドプロテクタを使用して、スキャナのスライドホルダーに配列スライドをロードします。アレイスキャナーにスライドをロードし、アレイの製造元の指示に従ってスキャンします。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

アレイCGHは、三倍体としてバランスのとれた再構成または倍数性異常を検出しません。さらに、低レベルのモザイク不均衡が検出されないことがある。しかし、アレイCGHは、多くの細胞遺伝学研究室で置き換えたG-バンド染色体分析よりCNVを検出するためのより高い解像度を有する。したがって、ゲノムワイドなCNV検出のための現在のゴールドスタンダードです。これは、将来的には、次世代配列決定技術に置き換えることができるが、現在、それらのコストおよび技術的な複雑さは、これはまだ臨床使用に適していないことを意味するCNVの検出のために読み取る短い使用に関連する。 ここに記載されているプロトコルは、当社の臨床サービス実験室での日常的な使用である。 96サンプルずつの2ランは、液体処理ロボットや専用のシリカ膜スピンカラム処理ロボットを用いて毎週処理されます。自動化が非常に一貫性を改善し、品質を維持することをお勧めします。血液から抽出したDNA、唾液、出生前のサンプル（ 例えば、絨毛膜絨毛または羊水）または組織サンプルは、日常場合、このプロトコルで使用することができる。 <p cl...

これは、欠失または染色体セグメントの余分なコピーが知的障害、異形症とcongentical奇形を引き起こすことを長年にわたって知られており、いくつかのケースでは、遺伝的症候群1を引き起こしてきた。しかし、これらの変化のゲノムワイド検出のため2000年代半ばまで、利用可能な唯一の技術は、不均衡の地域や性質に応じて、5-10Mb周りの解像度を持つG-バンド染色体分析、で、そのことはできません材料が同じバンドパターンと異なる染色体から地域によって置き換えられている異常な染色体を検出する。そのようなin situハイブリダイゼーションと多重ライゲーション特異的プローブ増幅における蛍光として補助的な細胞遺伝学的技術が疑われる特定の症候不均衡例では、特定の遺伝子座の尋問のために利用されてきたが、それは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）の導入までではなかった日常の臨床診断の中にコピー数変異体（のCNV）のゲノムワイド検出が（通常は120キロバイト程度）を大幅に増加した解像度で可能になったervice 2-5。一部の地域では正常な集団6-7で普及しているための調査研究と並んで臨床サービス作業は、他のCNVながら、以前に検出できない、そのような自閉症やてんかん8-11などneurodisabilitiesと関連している、のCNVことが示されている。 この論文に記載されているプロトコルは、当社の英国国民保健サービス（NHS）の臨床診断検査室で使用されている。我々はこの状態が資金提供サービスでコストを最小限に抑える新たなハイブリダイゼーション戦略、バッチテストやロボットを使用しています。 以下に詳述するプロトコールに先立って、高品質のDNAを、適当な出発物質、一般的に、血液、培養細胞又は組織サンプルから抽出されるべきである。 280吸光度比（bにすべき：分光光度計は濃度を測定するために使用することができ、260をチェックし（&gt; 50 ngの/μlのあるべき）E 1.8から2.0）。ゲル電気泳動は、DNAが有意な劣化なしに高分子量であることを確認するために使用することができる。 このプロトコルは、自動液体処理ロボットを使用して実行ごとに96個のサンプルを標識しているより高いスループット実験室用に設計されています。しかし、自動化することなく、低いスループット·ラボに適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>CGHマイクロアレイ 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr>アレイ<tr><td>CGH洗浄バッファー</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>アレイCGHハイブリダイゼーションバッファー</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>アレイCGHラベリングキット</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイcgh）

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGHは、Gバンド核型解析に取って代わりました。このホワイトペーパーでは、臨床診断サービスラボでのテクノロジーとその応用について説明します。患者のサンプル(血液、唾液、またはその他の組織タイプ)から抽出されたDNAは、蛍光色素(シアニン5またはシアニン3)で標識されます。参照DNAサンプルは、反対の蛍光色素で標識されます。その後、標識されたDNAを混合してハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し、ゲノム全体の遺伝子座から~60,000のオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイに適用する前に、取り込まれていないヌクレオチドを除去するクリーンアップステップが続き、臨床的に重要な領域でプローブ密度が高くなります。ハイブリダイゼーション後、アレイを洗浄し、スキャンして得られた画像を分析して、各プローブの赤と緑の蛍光を測定します。ソフトウェアは、各プローブ測定の品質を評価し、赤色と緑色の蛍光の比率を計算し、潜在的なコピー数バリアントを検出するために使用されます。

ハイブリダイズしたアレイ上の各プローブは、赤と緑の蛍光色素の混合物として可視化される（ 図1参照）。各プローブのための緑色蛍光信号に赤の比率は、スキャナによっ​​て定量化され、関連するソフトウェアは、それらのゲノム位置に応じてLOG2比としてこれらをプロットし、プリセットの境界の外に落下する領域を特定します。結果の配列トレースは、ゲノムのアンバランスとして同定された領域の解釈を可能にする。例えば、ウィリアムズ症候群、染色体7の近位領域内の低コピー反復配列によって媒介される定期的な微小欠失症候群の子供からのトレースは、 図2に示されている。この不均衡は、ソフトウェアによって識別され、赤線で示した。 ゲノムの正常な領域に対して1：1の緑/赤の割合を示す、 図2に示すように、蛍光対数比は、0の周りに密接にクラスタ化する必要があり、プローブ。散在配列トレースはresulあり<html>不正確な異常部位の通話、またはゲノム不均衡を同定するための失敗トン（ 図3</strong...

ゲノムコピー数変異の検出のためのアレイCGHは、Gバンド核型分析に取って代わった。本論文では、技術や診断サービスの研究室への応用について説明します。

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

本手順の全体的な目的は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて、多種多様な遺伝性疾患の原因となるゲノム内の不均衡を特定することです。まず、患者のDNAを蛍光色素で標識します。次に、この患者DNAと、異なる色素で標識したリファレンスDNAをアレイにハイブリダイズさせることで、目的を達成します。次に、アレイをスキャンして、各プローブに結合している患者およびリファレンスのDNA量を測定します。最終ステップでは、スキャンされた画像を処理し、患者のDNAがリファレンスDNAよりも物質的に多い、または少ないゲノム領域を特定します。比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて、患者が遺伝性疾患の原因となるコピー数変異を有しているかどうかを判定します。アレイスライドの組み立ては困難であり、ハイブリダイゼーション時にチャンバーから液が漏れやすいため、本手法を視覚的に提示することが不可欠です。ラベル化反応を開始する前に、ヌクレオチドおよびプライマーが入った既製の96ウェルプレートを、4°Cで遮光した状態で約1時間解凍してください。解凍後、蓋をしたプレートを室温でさらに30分間静置して温度を等しくし、同時にDNAサンプルも60 °Cで15分間静置して温度を等しくします。サンプルの加温中に、液体分注ロボットを用いて、新しい96ウェルプレートの各ウェルに十分な量のヌクレアーゼフリー水を分注します。その後、DNAの準備が整い次第、1ウェルあたり1 µgのサンプルを水が入った96ウェルプレートに転送します。次に、平衡化ヌクレオチドおよびプライマー20 µLを、希釈したDNAサンプルが入ったプレートの各ウェルに移し、ストリップキャップで密閉します。続いて、加熱蓋付きのPCR装置を用いてDNAを99 °Cで10分間変性させ、その後、プレートを氷上で5分間急速冷却（スナップクール）してプライマーをアニーリングさせます。その後、液体分注ロボットを使用して、各サンプルにCleanOut Exo DNAポリメラーゼ酵素を10 µL添加します。ピペットでサンプルを混合し、プレートを密封して37 °Cで16時間インキュベートします。翌日、ウェルあたり5 µLのストップバッファーを加えて反応を停止させます。その後、未反応のヌクレオチドを除去します。各ウェルの内容物を、あらかじめラベルを貼った個別の2 mLチューブに移します。サンプル、DNA精製用スピンカラム、および適切な関連バッファーを、スピンカラム処理ロボットにセットします。製造元の指示に従い、スピンカラム処理ロボットが、1チューブあたり250 µLの高塩濃度DNA結合バッファーを用いて、標識DNAをシリカメンブレンに結合させます。その後、500 µLの洗浄バッファーで2回洗浄し、メンブレンから不純物を除去します。次に、ロボットが15 µLの低塩濃度溶出バッファーをメンブレンに添加し、精製された標識DNAサンプルを約12 µLの容量で回収して、サンプルのハイブリダイゼーションを行います。次に、ハイブリダイゼーションオーブンを65 °Cに予熱し、バッキングスライドとハイブリダイゼーションチャンバーを予熱します。ハイブリダイゼーションミックスを調製するには、1.1 µLのcot 1D NA、4.95 µLのメーカー提供のブロッキングミックス、および24.75 µLのハイブリダイゼーションバッファーを混合します。液体ハンドリングロボットを用いて、このミックスを新しい96ウェルプレートの各ウェルに分注します。その際、分注精度の向上させるため、各チップをあらかじめ濡らしておきます。次に、適切なサイン3標識DNAを9.35 µLピペッティングし、続いて適切なサイン5標識DNAを9.35 µL加えます。各ウェルに対してプレートを封止し、サンプルを1分間混合した後、プレートを軽く遠心して各ウェルの底に内容物を集めます。その後、ハイブリダイゼーション前インキュベーター内で標識DNAを変性させます。まず95 °Cで3分間、続いて37 °Cで30分間加熱します。その後、42 °Cに加熱されたプラットフォーム上で作業を行います。あらかじめ湿らせたチップを使用し、ガスケットの透明部分がハイブリダイゼーションチャンバーのウィンドウ部分に合うようにして、バッキングスライドをハイブリダイゼーションチャンバーに配置します。次に、ハイブリダイゼーションミックス 42 µL を、アレイバッキングスライドの適切な位置の中央にゆっくりとピペットで分注します。このとき、液体がゴムリングの境界に触れないように注意してください。すべての位置への分注が完了したら、アレイスライドをバッキングスライドの上に慎重に下ろし、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立てます。アレイの文字が書かれている面がバッキングスライド側に向くように注意して、ハイブリダイゼーションチャンバーのネジを完全に締め、組み立てられたハイブリダイゼーションチャンバーを点検し、ハイブリダイゼーション液の漏れがないことを確認します。ゴムリングの境界の外側で混合し、各気泡の高さが約4 mmであることを確認してください。ハイブリダイゼーションチャンバーを垂直に立て、回転させてこれを確認します。各位置の気泡がすべて移動していることを確認してください。気泡が停滞している場合は、チャンバーをベンチに軽く叩いてください。その後、ハイブリダイゼーションチャンバーを65 °Cに設定した回転オーブンに入れ、24時間静置します。翌日、ハイブリダイゼーションチャンバーを洗浄バッファー1に浸し、プラスチック製の平先ピンセットを使用してスライドを切り離します。次に、ガスケットスライドを廃棄し、アレイスライドを新鮮なバッファー1に浸したラックに入れます。約700 mLの洗浄バッファーでアレイスライドを1〜5分間洗浄し、その際、磁気撹拌子を用いて激しく撹拌します。次に、アレイスライドを約700 millilitersの洗浄バッファーに移し、90秒間ずつ2回洗浄します。2回目の洗浄の最後には、より激しく撹拌してください。アレイスライドをバッファーからゆっくりと引き上げます。スライドは乾燥した状態で取り出されるはずです。次に、アレイスライドをスライドプロテクターとともにスキャナーのスライドホルダーにセットし、サンプルをスキャンします。アレイ製造元の説明書に従い、ハイブリダイズさせたアレイ上の各プローブは、赤色と緑色のフルオロクロムの混合物として可視化されます。各プローブの赤色対緑色の蛍光シグナルの比率はスキャナーによって定量化され、関連ソフトウェアによってゲノム上の位置に基づいたlog2比としてプロットされます。得られたアレイトレースにより、ゲノム不均衡として同定された領域の解釈が可能になります。例えば、7番染色体近位領域の低コピーリピートによって引き起こされる反復性の微小欠失症候群であるウィリアムズ症候群の小児から得られたこのトレースでは、ソフトウェアによってゲノム不均衡が赤線で示されています。正常なゲノム領域では、蛍光ログ比は0付近に密集し、緑と赤の比率が1対1であることを示します。このスキャンで観察されるような散在したアレイ・トレースは、異常領域の不正確な判定やゲノム不均衡の特定不能を招く可能性があり、その原因としては、DNA品質の不良、放射線の存在、大気中のオゾン濃度など、多くの要因が考えられます。このビデオを視聴することで、aCGH検査に向けて患者サンプルをどのように処理し、ダウンストリーム解析およびコピー数多型（CNV）の検出に適した高品質なデータを取得するかについて、十分に理解することができます。

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チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

ここでは、消化管癌におけるDNAメチル化のゲノム全体解析の手順について説明する。この手順は、遺伝子のメチル化パターンと胃腸癌の発がんに寄与する因子との関係を調査する研究と関連するものである。...

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。...

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

このプロトコルは、非小細胞肺がん(NSCLC)ホルマリン固定パラフィン包埋組織における標的化可能なゲノム変化を検出するための、自動化されたISO15189認定の次世代シーケンシングワークフローを記述しています。...

次世代シーケンシングを用いた非小細胞肺がんにおける標的変化の検出

学ぶ アレイCGHによるゲノムコピー数変異の検出法。蛍光標記した患者DNAと参照DNAをアレイにハイブリダイゼーションし、スキャンしてゲノム不均衡を特定します。遺伝性疾患の診断精度向上に貢献する強力な遺伝子診断ツールです。

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

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