ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

本手順の全体的な目的は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて、多種多様な遺伝性疾患の原因となるゲノム内の不均衡を特定することです。まず、患者のDNAを蛍光色素で標識します。次に、この患者DNAと、異なる色素で標識したリファレンスDNAをアレイにハイブリダイズさせることで、目的を達成します。

次に、アレイをスキャンして、各プローブに結合している患者およびリファレンスのDNA量を測定します。最終ステップでは、スキャンされた画像を処理し、患者のDNAがリファレンスDNAよりも物質的に多い、または少ないゲノム領域を特定します。比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて、患者が遺伝性疾患の原因となるコピー数変異を有しているかどうかを判定します。

アレイスライドの組み立ては困難であり、ハイブリダイゼーション時にチャンバーから液が漏れやすいため、本手法を視覚的に提示することが不可欠です。ラベル化反応を開始する前に、ヌクレオチドおよびプライマーが入った既製の96ウェルプレートを、4°Cで遮光した状態で約1時間解凍してください。

解凍後、蓋をしたプレートを室温でさらに30分間静置して温度を等しくし、同時にDNAサンプルも60 °Cで15分間静置して温度を等しくします。サンプルの加温中に、液体分注ロボットを用いて、新しい96ウェルプレートの各ウェルに十分な量のヌクレアーゼフリー水を分注します。その後、DNAの準備が整い次第、1ウェルあたり1 µgのサンプルを水が入った96ウェルプレートに転送します。

次に、平衡化ヌクレオチドおよびプライマー20 µLを、希釈したDNAサンプルが入ったプレートの各ウェルに移し、ストリップキャップで密閉します。続いて、加熱蓋付きのPCR装置を用いてDNAを99 °Cで10分間変性させ、その後、プレートを氷上で5分間急速冷却（スナップクール）してプライマーをアニーリングさせます。その後、液体分注ロボットを使用して、各サンプルにCleanOut Exo DNAポリメラーゼ酵素を10 µL添加します。

ピペットでサンプルを混合し、プレートを密封して37 °Cで16時間インキュベートします。翌日、ウェルあたり5 µLのストップバッファーを加えて反応を停止させます。その後、未反応のヌクレオチドを除去します。各ウェルの内容物を、あらかじめラベルを貼った個別の2 mLチューブに移します。

サンプル、DNA精製用スピンカラム、および適切な関連バッファーを、スピンカラム処理ロボットにセットします。製造元の指示に従い、スピンカラム処理ロボットが、1チューブあたり250 µLの高塩濃度DNA結合バッファーを用いて、標識DNAをシリカメンブレンに結合させます。その後、500 µLの洗浄バッファーで2回洗浄し、メンブレンから不純物を除去します。次に、ロボットが15 µLの低塩濃度溶出バッファーをメンブレンに添加し、精製された標識DNAサンプルを約12 µLの容量で回収して、サンプルのハイブリダイゼーションを行います。

次に、ハイブリダイゼーションオーブンを65 °Cに予熱し、バッキングスライドとハイブリダイゼーションチャンバーを予熱します。ハイブリダイゼーションミックスを調製するには、1.1 µLのcot 1D NA、4.95 µLのメーカー提供のブロッキングミックス、および24.75 µLのハイブリダイゼーションバッファーを混合します。液体ハンドリングロボットを用いて、このミックスを新しい96ウェルプレートの各ウェルに分注します。その際、分注精度の向上させるため、各チップをあらかじめ濡らしておきます。

次に、適切なサイン3標識DNAを9.35 µLピペッティングし、続いて適切なサイン5標識DNAを9.35 µL加えます。各ウェルに対してプレートを封止し、サンプルを1分間混合した後、プレートを軽く遠心して各ウェルの底に内容物を集めます。その後、ハイブリダイゼーション前インキュベーター内で標識DNAを変性させます。

まず95 °Cで3分間、続いて37 °Cで30分間加熱します。その後、42 °Cに加熱されたプラットフォーム上で作業を行います。あらかじめ湿らせたチップを使用し、ガスケットの透明部分がハイブリダイゼーションチャンバーのウィンドウ部分に合うようにして、バッキングスライドをハイブリダイゼーションチャンバーに配置します。

次に、ハイブリダイゼーションミックス 42 µL を、アレイバッキングスライドの適切な位置の中央にゆっくりとピペットで分注します。このとき、液体がゴムリングの境界に触れないように注意してください。すべての位置への分注が完了したら、アレイスライドをバッキングスライドの上に慎重に下ろし、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立てます。

アレイの文字が書かれている面がバッキングスライド側に向くように注意して、ハイブリダイゼーションチャンバーのネジを完全に締め、組み立てられたハイブリダイゼーションチャンバーを点検し、ハイブリダイゼーション液の漏れがないことを確認します。ゴムリングの境界の外側で混合し、各気泡の高さが約4 mmであることを確認してください。ハイブリダイゼーションチャンバーを垂直に立て、回転させてこれを確認します。

各位置の気泡がすべて移動していることを確認してください。気泡が停滞している場合は、チャンバーをベンチに軽く叩いてください。その後、ハイブリダイゼーションチャンバーを65 °Cに設定した回転オーブンに入れ、24時間静置します。

翌日、ハイブリダイゼーションチャンバーを洗浄バッファー1に浸し、プラスチック製の平先ピンセットを使用してスライドを切り離します。次に、ガスケットスライドを廃棄し、アレイスライドを新鮮なバッファー1に浸したラックに入れます。約700 mLの洗浄バッファーでアレイスライドを1〜5分間洗浄し、その際、磁気撹拌子を用いて激しく撹拌します。

次に、アレイスライドを約700 millilitersの洗浄バッファーに移し、90秒間ずつ2回洗浄します。2回目の洗浄の最後には、より激しく撹拌してください。アレイスライドをバッファーからゆっくりと引き上げます。スライドは乾燥した状態で取り出されるはずです。

次に、アレイスライドをスライドプロテクターとともにスキャナーのスライドホルダーにセットし、サンプルをスキャンします。アレイ製造元の説明書に従い、ハイブリダイズさせたアレイ上の各プローブは、赤色と緑色のフルオロクロムの混合物として可視化されます。各プローブの赤色対緑色の蛍光シグナルの比率はスキャナーによって定量化され、関連ソフトウェアによってゲノム上の位置に基づいたlog2比としてプロットされます。

得られたアレイトレースにより、ゲノム不均衡として同定された領域の解釈が可能になります。例えば、7番染色体近位領域の低コピーリピートによって引き起こされる反復性の微小欠失症候群であるウィリアムズ症候群の小児から得られたこのトレースでは、ソフトウェアによってゲノム不均衡が赤線で示されています。正常なゲノム領域では、蛍光ログ比は0付近に密集し、緑と赤の比率が1対1であることを示します。

このスキャンで観察されるような散在したアレイ・トレースは、異常領域の不正確な判定やゲノム不均衡の特定不能を招く可能性があり、その原因としては、DNA品質の不良、放射線の存在、大気中のオゾン濃度など、多くの要因が考えられます。このビデオを視聴することで、aCGH検査に向けて患者サンプルをどのように処理し、ダウンストリーム解析およびコピー数多型（CNV）の検出に適した高品質なデータを取得するかについて、十分に理解することができます。