Name: アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶアレイ・ベース比較ゲノムハイブリダイゼーション法を用いて、Medicago truncatulaの高速中性子誘導変異体におけるコピー数変化を効率的に検出する方法です。マメ科植物の結節形成に関わる遺伝的メカニズムの解明に貢献します。

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この作品が資金を提供一部助成金 NSF 植物ゲノム研究 (IOS 1127155) から。

注: 図 1 アレイ CGH のプロトコルの 5 つの手順を示しています。彼らは、: 1) 工場用資材の準備2) 高品質 DNA サンプルの分離3) ラベリングと DNA サンプルの精製4) ハイブリダイゼーション、洗浄、および全ゲノム配列のスキャン・ 5) CGH データ分析。M. 糸状菌 ゲノム タイリング アレイには、50,000 以上の遺伝子または遺伝子ゲノム (材料の表 を参照) モデルをターゲット 971,041 のユニークなオリゴ プローブの合計が含まれています。ユニークなプローブの間隔は約すべて 150 塩基対 (bp) exonic 地域で 261 m. 糸状菌 ゲノムのイントロン領域で bp。
 1 です植物材料の準備 <ol><li>Scarify 野生型 (WT;。M. 分子 cv Jemalong A17) と 8 分の濃硫酸と FN6191 突然変異種 (材料の表 を参照してください)。削除し、液体廃棄物容器に硫酸を破棄します</li>。
	<li>リンスの脱イオン水をオートクレーブで種 3 回</li>。
	<li>表面消毒種子で 10 分間 20% の漂白剤の解決策</li>
	<li>リンスの脱イオン水をオートクレーブで種 3 回</li>。
	<li>3 日間の 4 ° C でストアの種子。春後、転送し、成長室 16 h と 8 h で 1 週間明暗サイクルと 150 Με/m 2/s 光強度の埋土種子を発芽します</li>。
	<li>1 ガロン ポット苗を移植し、16/8 h/明暗サイクル、Με/m 2/s 光の強度は、3 〜 4 週間のために 150 が付いている温室のそれらを育てます。DNA の隔離のための植物の若い葉のサンプルを収集します</li>。
</ol> 2。高品質の DNA サンプルの分離 <ol><li>単一の植物から若い葉組織の 1 グラムを取るし、すぐに液体窒素で凍結します</li>。
	<li>微粉すりこぎで液体窒素で冷凍葉組織を挽く</li>。
	<li>DNA の隔離とゲノム DNA を隔離キット (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>オートクレーブ二重脱イオン H 2 O の 50 μ L の DNA サンプル (ddH 2 O) または TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.0) × 1 を精製再懸濁します</li>。
	<li>分光光度計で測定 DNA 濃度 (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>評価 260 nm/280 nm と DNA のサンプルの 260 nm/230 nm 比 。
	注: 高品質の DNA サンプルは、260 nm/280 nm 比を持つ必要があります &#8805; 1.8 と 260 nm/230 nm 比 &#8805; 2.0</li>。
	<li>をさらに 1% の agarose のゲルを実行しているによって DNA のサンプルを評価します 。
	注: 高品質の DNA のサンプルは高分子量があるはずし、RNA によって汚染されていない必要があります。理想的には、DNA のサンプルの最終的な集中は ~ 150 ng/μ L をする必要があります</li>。
</ol> 3。DNA の分類と浄化 <ol><li>ddH 2 O 500 μ L 遠心管中の 20 μ L の最終巻にゲノム DNA の希釈 1 μ g のサンプルします</li>。
	<li>任意プライマーの追加 5 μ L (材料の表 を参照) をチューブ</li>。
	<li>渦管を簡単に入れて、孵化し、98 ° C で 10 分間で DNA を変性たちと</li>
	<li>たちからチューブを取り出して 5 分間寒さに氷水ですぐにそれを置く</li>
	<li>の表 1 に示すようにミックス準備 2 ラベルします</li>。
	<li>ラベル参照 DNA と DNA のサンプル 1 と 2 のミックスの追加 25 μ L 管、それぞれします</li>。
	<li>3 回のピペッティングによるラベルのミックスと DNA をミックスし、チューブを簡単にスピンします</li>。
	<li>Exo Klenow 酵素を不活化する 20 分の 65 ° C 2 h の 37 ° C で、その後をインキュベートするたちにチューブを入れ (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>X 各管に TE バッファー 1 の追加 430 μ L.</li>
	<li>内容をミックスし、チューブを簡単にスピンします</li>。
	<li>転送 2 mL コレクションと精製カラムに挿入するチューブでソリューション チューブ (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>遠心分離機 14,000 x g で 10 分間で浄化列</li>
	<li>ソリューションを通じてパスを破棄します</li>。
	<li>X 各列に TE バッファー追加 480 μ 1.</li>
	<li>遠心分離機 14,000 x g で 10 分間で再び列</li>
	<li>パススルー ソリューションを破棄します</li>。
	<li>新しい遠心管に列の下部のままラベル付きの DNA サンプルを転送します</li>。
	<li>TE バッファー x 1 80 μ L ピペットを使用して分類された DNA のサンプルの体積を測定し、最終巻</li>。
	<li>分光光度計を使用して分類された DNA のサンプルの濃度の測定 (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>ラベル サンプル DNA の等量混合し DNA を参照および TE バッファー x 1 160 μ L に最終巻をもたらすします</li>。
	<li>交配バッファー、人間のベッド 1 DNA の 50 μ L、50 μ L の 10 × aCGH ブロッキング エージェント x 2 の 256 を追加 μ L (材料の表 を参照してください) 3 回のピペッティングでよく混ぜると</li>。
	<li>スピン チューブを簡単にし 98 ° C で 10 分間インキュベートするたちに入れて</li>
	<li>20 分の 37 ° C でチューブを孵化させなさい</li>
</ol> 4。ハイブリダイゼーション、洗浄、ゲノム配列の走査 <ol><li>事前交配開始前に 67 ° C 少なくとも 4 h にハイブリダイゼーション オーブンを温めます</li>。
	<li>ハイブリダイゼーション チャンバのベースの上にガスケット スライドを配置します</li>。
	<li>ガスケット スライドにステップ 3.23 からハイブリダイゼーション液の負荷 490 μ L.</li>
	<li>交配チャンバーを形成する 人工分子 ゲノム マイクロ アレイ チップを搭載したガスケット スライドをカバーします</li>。
	<li>交配チャンバー カバーを履くし、チャンバーをクランプで締め</li>。
	<li>ハイブリダイゼーション オーブンに組み立てられた交配チャンバーを入れ, 40-48 のための 67 ° C で</li>
	<li>お皿を洗う準備 3 スライド: 室温でおいた 2 つの 250 ml の洗浄液と洗浄液 II で 1 つは 37 で保たれた ° C</li>
	<li>瓶を洗う準備 2 スライド: アセトニ トリル 70 mL と 70 mL 安定化と乾燥ソリューション; 室温で発煙のフードに留めておきなさい (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>オーブンから交配チャンバーを外し、チャンバーのクランプを外し、カバーします</li>。
	<li>マイクロ アレイ チップとガスケット洗浄バッファーでスライド洗濯料理私にスライドさせ、カバーのスライドからチップを別々 に移動します</li>。
	<li>移動マイクロ アレイ チップの 2 番目のスライド洗濯洗浄バッファー皿私とゆっくり 5 分間室温での磁気撹拌プレートに攪拌棒でソリューションを循環</li>
	<li>転送マイクロ アレイ チップ 3 スライドに予め温めておいた洗浄バッファー II が付いている皿を洗浄して電磁攪拌板 1 分の 37 ° C 時の攪拌棒で軽く洗って</li>
	<li>アセトニ トリル発煙のフード付きの瓶を洗うスライドにマイクロ アレイ チップを転送し、洗って 30 s.</li>
	<li>安定化と jar を洗濯と乾燥ソリューション スライドにマイクロ アレイ チップを転送し、洗って 30 s.</li>
	<li>チップをゆっくりし、1 分のためにそれを乾燥</li>
	<li>は、スキャナーを使用してマイクロ アレイ チップをスキャン (参照、材料表 は) 下 2 μ m 解像度。複数の画像や全体スライド スキャン保存パラメーターを設定します。チャンネル 1 と 2 の向上を 100% に設定し、自動利得をキャンセルします</li>。
</ol> 5。CGH 分析 <ol><li>エキス Cy3 および Cy5 の蛍光スキャン ソフトウェアを使用してアレイ上の各プローブ強度 (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>DNA のサンプルとリファレンスの DNA コピー数変化 (CNVs) を検出するソフトウェアの使用セグメンテーション分析。セグメント平均ログ 2/サンプル ・ リファレンス比 ± 2.5 標準偏差のしきい値を使用して CNVs を決定します</li>。
	<li>信号のマッピング ソフトウェアを使用して全ゲノム間でログ 2/サンプル ・ リファレンス比の分布を検査 (材料の表 を参照してください).</li>
</ol>

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<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

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アレイ ・ ベース CGH プラットフォームの検出と高速中性子照射 (FNB) の特性を開発した- M. 分子品種 Jemalong A17 の突然変異体の誘発。アレイ CGH 法遺伝子変異の検出の使用を示すためには、aCGH S. 法 Sm1021を接種したときに野生型植物と対照をなしてハイパー根粒形成表現型を表わした FN6191 変異体の解析を行った。セグメント化の分析のため、セグメントはセグメント内プローブは上限しきい値上またはその指定された配列比較の下限しきい値以下ログ2の比率を意味するのなら重要なと判断されました。各比較のしきい値の上限は、すべてのデータ ポイントの 95 パーセンタイル値のログ2比値であることに決定されました。各比較の下限は、すべてデータ ポイント24の 5 パーセンタイルのログ2比値であることに決定されました。
我々 の分析を示した 2.5 平均正規化 log2比率は平均より大きい...

マメ科植物 (マメ科)、大豆 (ダイズ) やアルファルファ (アルファルファ) など多くの経済的に重要な種の顕花植物の 3 番目に大きい家族です。マメ科植物は根粒が大気中の窒素をアンモニア用にホスト植物によって減少を開発する根粒菌の総称で、土壌窒素固定細菌と対話できます。など、マメ科作物の栽培は窒素肥料の少しの入力を必要とし、持続可能な農業に貢献。葉と種子と高たんぱく、優秀な牧草と穀物マメ科作物を生成します。ただし、栽培されているマメ科草種は一般的にマメ科特有のプロセスが面倒で重要な役割を果たす遺伝子の機能解析を行う複雑なゲノム構造を持ちます。ウマゴヤシ分子採用されているマメ科植物の研究のためのモデル種として主な理由は (1) がある比較的小さい半数体ゲノムのサイズ (~ 550 Mbp); 二倍体ゲノム(遺伝子機能研究のため 2) 植物を安定して変換できます。(3) はアルファルファ (M. サティバ)、牧草、女王とトランスレーショナル研究の他の多くの経済的に重要な穀物に密接に関連。最近、ゲノム Jemalong A17 M. 分子cv のリリース1,2をされています。ゲノムの注釈は、50,000 以上の予測遺伝子やゲノムの遺伝子モデルがあることを示しています。M. 分子の遺伝子のほとんどの機能を決定するには、ゲノムはやりがいのある仕事です。遺伝子の機能解析を容易にするために以上 150,000 M1行の範囲の突然変異体の包括的なコレクションによって生成された高速中性子照射 (FNB) 突然変異誘発M. 分子cv Jemalong A173 、4。シロイヌナズナ5,6イネ (イネ)7トマト (ナスを含む多くの植物種の突然変異体の生成に高速中性子、高エネルギー イオン化変異原が使用されていますlycopersicum)、大豆 (ツルマメ;ミヤコグサ大麦 (オオムギ)、 G. 最大)8,910.FNB 変異から派生した突然変異の大部分は、メガ塩基対9,11に数塩基対からサイズの範囲を DNA 削除原因です。多くの表現型に関連する遺伝子が正常にされている識別し、特徴付けられる4,12,13,14,15,16,17,18,19. 以前は、地図ベースのアプローチは時間がかかるし、分子レベルで特徴付けられる突然変異体の数を制限に頼って FNB 変異体から根本的な遺伝子の分子クローニングします。最近では、トラン スクリプト ベースのメソッドを含むいくつかの無料のアプローチ、ゲノム DNA コピー数変化検出、配列する全ゲノムの配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) をタイル採用されている容易にするために、動物や植物20,21,22,23,24,25を含む多様な生物の欠失変異株の解析 26,27,28,29,30,31。
FNB M. 分子、全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 突然変異体の解析を容易にするには、プラットフォームを開発し、検証されています。動物システムで報告は、CGH アレイ ・ ベース プラットフォームはコピー数変化 (CNVs) M. 分子FNB 変異体のゲノム全体レベルでの検出をことができます。さらに、PCR で病変が確認でき、罫線削除は、シーケンスによって識別できます。全体的にみて、アレイ CGH プラットフォーム、 M. 分子FNB 変異体の病変を識別するに効率的かつ効果的なツールです。ここでは、アレイ CGH プロシージャおよび削除ボーダー M. 分子FNB 変異株の PCR 解析を示します。
次のプロトコルは、コピー数の全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 解析を行うに興味がある人のため実験手順、試薬、装置および分析ツールに関する情報を提供します。植物の変化。例として、ウマゴヤシ分子FN6191 変異体は、削除領域および突然変異体の表現型に関連する候補遺伝子を識別するために使用されました。M. 分子FN6191 変異体は、もともと由来の高速中性子照射誘起削除変異コレクション32 (材料の表を参照)、土と接種後のハイパー根粒形成表現型の展示細菌、 Sihorhizobium 分類Sm1021、野生型植物とは対照的。

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatulaゲノムアレイ、1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (変異体)</td><td>自社内</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (参考)</td><td>社内</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plantミニキット</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag DNA ラベリングキット</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>ランダムプライマー</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>MJ 研究</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Stabilization and Drying Solution</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Chamber gasket slides</td><td>Agilent</td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ aCGH/ChIP-on-chip 洗浄バッファー 1 および 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションチャンバー、ステンレス</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>精製カラム</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>レーザースキャナー</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>RocheNimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>Signal Map 1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>SignalMap1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

アレイ ・ ベース比較 genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

変異体は、遺伝子機能研究のための非常に貴重な遺伝資源です。突然変異体のコレクションを生成するため、T-DNA やトランスポゾンなどの生物、メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学物質や電離放射線などの物理など、変異原物質の 3 つのタイプを利用できます。突然変異の観察の種類使用変異原によって異なります。電離放射線誘発突然変異の突然変異には、削除、複製、または再配置が含まれます。T DNA やトランスポゾンを用いた突然変異誘発は変換に影響を受けやすい種に限られているが、化学的または物理的な突然変異は種の広い範囲に適用できます。しかし、伝統的に化学的または物理的な突然変異から派生した突然変異の特性は、マップベースの複製のアプローチ、集中的な時間のかかる労働をあるに依存します。ここでは、効率的に検出し、コピー数変化 (CNVs) 変異株由来の高速中性子照射 (FNB) 突然変異を特徴付ける高密度のゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (aCGH) プラットフォームを適用できることを示すウマゴヤシ分子、マメ科草種。全ゲノム シーケンス解析は、50,000 以上の遺伝子または遺伝子M. 分子モデルがあることを示しています。M. 分子の存在、FNB 誘発突然変異体でゲノムにおける遺伝子機能研究のための非常に貴重な遺伝資源を表す以上 150,000 の M1 線から派生されます。ここで説明した aCGH プラットフォームは、 M. 分子で FNB 誘発突然変異体を特徴付けるための効率的なツールです。

図 2は、全ゲノムを渡る WT 信号対変異体の正規化 log2比の分布を示しています。CGH のデータの分析はおおよそ明らかになった全体サンヘンプ遺伝子33と他のいくつかを含む, 染色体 4 22 kb 削除注釈遺伝子の FN6191 変異体 (図 2、図 3)。候補削除された領域は、-2.5 (補足表 1) 未満の平均正規化 log2比アレイ上 73 の連続したプローブで覆われていた。削除のボーダーの検査は、この突然変異体における推定の削除は座標 22,313,168 と 22,334,934 染色体 4 (図 3) の間に位置するプローブが並ぶことを提案しました。削除の境界線を確認、PCR ...

このプロトコルは、コピー数変化の全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 解析を行うに興味を持っている研究者の実験の手順と分析ツール、機器、試薬に関する情報を提供します。植物。

アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

このアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーションプロトコルの全体的な目標は、マメ科植物Medicago truncatulaの高速中性子衝撃誘発変異体のコピー数変異を迅速に同定することです。この方法は、マメ科植物生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、マメ科植物の結節発生の調節に関与する低部位の病原体の同定を容易にすることなどです。この手法の主な利点は、マメ科植物Medicago truncatulaの中性子衝撃変異体における欠失変異などのコピー数変異を検出する際に最も評判が高く、感度が高いことです。この手順を実演するのは、私自身と、Genetic LabのホストドクターフェローであるHongcheng Wang氏で、単一植物から採取した若葉組織1グラムを液体窒素で素早く凍結します。次に、乳鉢と乳棒を使用し、凍結した葉の組織を液体窒素内で微粉末に粉砕します。DNA単離キットを使用して、微粉末から野生型および変異型ゲノムDNAサンプルを抽出します。500マイクロリットルの遠心分離チューブを使用して、野生型および変異型ゲノムDNA各1マイクログラムを二重蒸留水で希釈し、最終容量を20マイクロリットルにします。次に、5マイクロリットルのランダムプライマーを遠心分離チューブに加えます。チューブをすばやくボルテックスし、すばやくスピンダウンした後、サーモサイクラーに10分間入れて、DNAサンプルを摂氏98度で変性させます。10分後、サーモサイクラーからチューブを取り外し、すぐに氷水に5分間置きます。次に、2つの標識混合物を調製し、25マイクロリットルの標識混合物を野生型と変異型DNAチューブにそれぞれ1つと2つとして加えます。DNAと標識を3回ピペットで混合し、チューブを短時間回転させます。紡糸後、サーモサイクラーでチューブを摂氏37度で2時間インキュベートし、次に摂氏65度で20分間インキュベートして、exo Klenow酵素を不活性化します。次に、430マイクロリットルのOne X TEバッファーを加え、各チューブの内容物を混合します。次に、チューブを短時間回転させ、チューブ内の溶液を2ミリリットルの収集チューブを備えた精製カラムに移します。精製カラムを 14, 000 回 G で 10 分間遠心分離し、流れを廃棄します。各カラムに480マイクロリットルのOne X TEバッファーを追加し、再びGの14, 000倍で10分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。野生型および変異体標識DNAのそれぞれをカラムの底部から新しい遠心分離チューブに移します。ピペットで標識された各DNAの容量を測定した後、One X TE Bufferで最終容量を80マイクロリットルに調整し、分光光度計で標識されたDNAの濃度を測定します。次に、等量の変異型DN

an-array-based-comparative-genomic-hybridization-platform-for

Research

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Genetics

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学ぶアレイ・ベース比較ゲノムハイブリダイゼーション法を用いて、Medicago truncatulaの高速中性子誘導変異体におけるコピー数変化を効率的に検出する方法です。マメ科植物の結節形成に関わる遺伝的メカニズムの解明に貢献します。

アレイ・ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

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