アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

このアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーションプロトコルの全体的な目標は、マメ科植物Medicago truncatulaの高速中性子衝撃誘発変異体のコピー数変異を迅速に同定することです。この方法は、マメ科植物生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、マメ科植物の結節発生の調節に関与する低部位の病原体の同定を容易にすることなどです。

この手法の主な利点は、マメ科植物Medicago truncatulaの中性子衝撃変異体における欠失変異などのコピー数変異を検出する際に最も評判が高く、感度が高いことです。この手順を実演するのは、私自身と、Genetic LabのホストドクターフェローであるHongcheng Wang氏で、単一植物から採取した若葉組織1グラムを液体窒素で素早く凍結します。

次に、乳鉢と乳棒を使用し、凍結した葉の組織を液体窒素内で微粉末に粉砕します。DNA単離キットを使用して、微粉末から野生型および変異型ゲノムDNAサンプルを抽出します。500マイクロリットルの遠心分離チューブを使用して、野生型および変異型ゲノムDNA各1マイクログラムを二重蒸留水で希釈し、最終容量を20マイクロリットルにします。

次に、5マイクロリットルのランダムプライマーを遠心分離チューブに加えます。チューブをすばやくボルテックスし、すばやくスピンダウンした後、サーモサイクラーに10分間入れて、DNAサンプルを摂氏98度で変性させます。10分後、サーモサイクラーからチューブを取り外し、すぐに氷水に5分間置きます。

次に、2つの標識混合物を調製し、25マイクロリットルの標識混合物を野生型と変異型DNAチューブにそれぞれ1つと2つとして加えます。DNAと標識を3回ピペットで混合し、チューブを短時間回転させます。紡糸後、サーモサイクラーでチューブを摂氏37度で2時間インキュベートし、次に摂氏65度で20分間インキュベートして、exo Klenow酵素を不活性化します。

次に、430マイクロリットルのOne X TEバッファーを加え、各チューブの内容物を混合します。次に、チューブを短時間回転させ、チューブ内の溶液を2ミリリットルの収集チューブを備えた精製カラムに移します。精製カラムを 14, 000 回 G で 10 分間遠心分離し、流れを廃棄します。

各カラムに480マイクロリットルのOne X TEバッファーを追加し、再びGの14, 000倍で10分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。野生型および変異体標識DNAのそれぞれをカラムの底部から新しい遠心分離チューブに移します。

ピペットで標識された各DNAの容量を測定した後、One X TE Bufferで最終容量を80マイクロリットルに調整し、分光光度計で標識されたDNAの濃度を測定します。次に、等量の変異型DNAと野生型DNAを混合して、マイクロアレイチップ上でプローブをハイブリダイズし、比較ハイブリダイゼーションを行います。最終容量を 160 マイクロリットルにするには、One X TE Buffer を使用します。

次に、ハイブリダイゼーション溶液を調製し、3回ピペットで3つの薬剤を混合DNAとよく混合します。チューブを短時間回転させた後、サーモサイクラーで摂氏98度で10分間、摂氏37度で20分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションの4時間前にハイブリダイゼーションオーブンを予熱するために、温度を摂氏67度に設定することを忘れないでください。

次に、ガスケットスライドをハイブリダイゼーションチャンバーの基部に置き、サーモサイクラーで摂氏37度で20分間インキュベートした後、490マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液をその上にロードします。ハイブリダイゼーションチャンバーを形成するには、ガスケットスライドをMedicago truncatula genome micro array chipで覆い、次にハイブリダイゼーションチャンバーを覆い、クランプでしっかりと締めます。組み立てたハイブリダイゼーションチャンバーをハイブリダイゼーションオーブンで摂氏67度で40〜48時間インキュベー

その間、室温に保たれた250ミリリットルのウォッシングバッファーワンで2つのスライドウォッシングディッシュを準備します。次に、37°Cに保たれたWashing Buffer Twoでスライド式洗濯皿を1つ作ります。次に、70ミリリットルのアセトニトリルを含むスライド洗浄ジャーを1つ準備し、70ミリリットルの安定化および延伸溶液を含む別のスライド洗浄ジャーを準備します。

両方のスライド洗浄ジャーを室温のドラフトに入れます。インキュベーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーをハイブリダイゼーションオーブンから取り出し、チャンバークランプを緩めてカバーを開きます。次に、ガスケットスライドのマイクロアレイチップを取り外し、Wash Buffer Oneでスライド洗浄皿に置きます。

マイクロアレイチップをカバースライドから分離します。次に、マイクロアレイチップをWash Buffer Oneで2番目のスライド洗浄皿に移します。攪拌子を使用して、室温でマグネチック攪拌板上で溶液を5分間穏やかに攪拌します。

マイクロアレイチップをあらかじめ温めたWashing Buffer Twoでスライド洗浄皿に置き、攪拌棒で攪拌して37°Cで溶液を1分間洗浄します。マイクロアレイチップを取り外し、ヒュームフード内のアセトニトリル入りスライド洗浄ジャーに入れて30秒間洗浄します。マイクロアレイチップを安定化乾燥溶液でスライド洗浄ジャーに移し、再度30秒間洗浄します。

チップを慎重に取り除き、ドラフト内で1分間乾燥させます。スキャナーを使用して、2マイクロメートルの解像度でマイクロアレイチップをスキャンします。シグナルマッピングソフトウェアをインターフェースとして使用し、8つの染色体にわたる変異型シグナルと野生型シグナルの正規化されたlog2の比率の分布を解析しました。

推定削除の場合、対数 2 の比率がマイナス 2 ポイント 5 標準偏差以下と見なされます。ソフトウェアのセグメンテーション分析では、グラフに示されている4番染色体上の推定22キロベースの欠失領域が示されています。マイクロアレイプローブに挟まれた欠失境界の分析では、平均正規化されたlog 2比が減少していることが示されています。

グラフには、欠失領域を包含するson遺伝子を含む他の6つの注釈付き遺伝子も示されています。Son遺伝子は、Metecago truncatulaの結節を制御する役割を担っています。次に、欠失境界を確認するために行われたPCR増幅は、FN6191変異体から増幅された1点5キロベースの産物を示していますが、野生型ではありません。

DNAシーケンシングは、黒矢印で示されているFN6191変異体の欠失接合を示すために行われました。また、欠失境界の位置を確認するためのシーケンシングも行われました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば72時間で完了することができます。

高品質のデータを取得するには、手順を実行する部屋のオゾン濃度を低く保つことを忘れないでください。この手順に続いて、すべてのゲノムシーケンシングのポリメラーゼ連鎖反応などの他の手段を実行して、ゲノムのサイズやコピー数の変動などの追加の質問に答えることができます。この技術のイベントと検証は、研究者が突然変異体やGarden P.Dondonなどの挿入突然変異誘発に適さない植物種の天然変異体に誘導するコピー数変異を調査する道を開きました。

目の直腸を装着する、エージェントとの直接の接触を避ける、注意して作業するなどの予防措置が絶対に不可欠です。