全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

次の短いプレゼンテーションは、27 Kサブメガベースティングアレイのハイブリダイゼーションプロトコルを示すビデオです。このアレイまたはスマートアレイは、1枚のスライドに印刷された26, 946個の個別に配列決定されたバッククローンで構成されています。それらは、18 x 54ミリメートルの領域に印刷されたスライドあたり合計54、000の要素に対して重複して発見されます。

得られたデータは、バイオインフォマティクスによるデータ解釈を必要とせずに、高密度オリゴアレイに匹敵します。バッククローンのような大型インサートアレイを使用する大きな利点の1つは、わずか100ナノグラムのサンプルDNAを増幅せずに使用できることです。これにより、血液凍結組織からのDNA、選別細胞、FFPE材料など、さまざまなサンプルの分析が可能になります。

スマートアレイは、臨床現場で有用であることが証明されています。BC Cancer Agencyでは、複数の患者サンプル分析を平均的な週労働時間に簡単に対応できます。細胞遺伝学用。

アレイCGHで使用されるステップのほとんどは、従来のCGHや魚と似ています。確立されたラボへのプロトコルの迅速な導入を可能にします。DNAの品質は、アレイの結果に最も大きな影響を与えるものです。

CGHハイブリダイゼーション、低品質、または汚染されたDNAは、製品へのPSIの取り込みに悪影響を及ぼし、データに薄暗い画像やノイズが発生します。NanoDrop分光光度計は、ハイブリダイゼーション前にDNAの品質を評価するための優れたツールです。DNAセットを定量するには、核酸を測定するNanoDropとDNA 50ブランクを測定するモード、再懸濁したサンプルと同じ溶液の1.5マイクロリットルのNanoDropを使用します。

この場合はウォータートリスです。EDTAは、PS Dの組み込みに潜在的な悪影響を及ぼすことが示されています。キムワイプでブランクワイプを取り外し、サンプル測定値の1.5マイクロリットルを追加し、サンプル濃度を記録します。

NanoDropの2つの60対2の80の読み取りは、1.8の比率が最適なDNA品質の優れた指標です。ダブルレシオ法は、2 60 over two 80 と two 60 over two 30 で、サンプルの純度をさらに優れた方法で測定できます。NanoDropは、波長に対する吸光度を表す曲線を表示します。

ピークのない滑らかな曲線は、高品質のDNAワイプと水とキムワイプでNanoDropを洗浄し、サンプルが限られている場合は、サンプルを台座からピペットで取り外していることを示しています。このプロトコルは、100 〜 400ナノグラムのサンプルに最適化されています。良質なDNAの目標量は200ナノグラムです DNAを標識するためには、以下の試薬と機器が必要です。

バッファー:SCI 3 SCI 5 ランダム ER、DNTP 10 回、混合参照 DNA 滅菌水、0.2 マイクロリットル、滅菌 PCR チューブ、氷、ヒートブロック、摂氏 100 度、摂氏 45 度、インキュベーター。参照DNA用の反応チューブと反応チューブを1本セットします。サンプルDNAについては、それぞれsci-fiとscii threeで標識されます。

研究では、オゾン分解に対してより耐性があるため、サンプルDNAにCY 3を使用することを好みます。DNA水と運河バッファーをサンプルに組み合わせ、参照DNAについて繰り返します。私たちの研究室では、10倍のバッファとランダムなOptimusを組み合わせます。

5時間溶液を作成するには、滅菌水を総容量17マイクロリットルに加えます。チューブをヒートブロックに移し、摂氏100度で5分間変性させます。すぐに氷に移します。

DNTPミックスの10倍の4マイクロリットルを追加します。横目を追加します。2マイクロリットルのSCI 3標識DCTPをサンプルDNAに加えます。

DNA に DCTP とラベル付けされた scifi を 2 マイクロリットル追加します。2.5マイクロリットルの運河を加えて混ぜます。溶液は、手で混合することも、ボルテックスにすることもできます。

溶液をチューブの底まで短時間回転させ、卓上型遠心分離機でクイックパルスで下ろします。オーブンに移し、37度で一晩インキュベートします。一晩のハイブリダイゼーション時間は、ラベリングプロセスに悪影響を与えることなく、14〜24時間の間で調整できます。

MicroCon YM 30カラムを使用するラボのスケジュールに適合させるには、1D NAを捕捉した100マイクロリットルをカラムに加えます。ピペットの先端を引っ掛けた状態でメンブレンに触れないように注意してください。DNAのバッチ間のばらつきは、主要なディストリビューターから購入した場合でも発生することが知られています。

大きなバッチは、使用前に購入してテストすることをお勧めします。これで、サンプルハイブリダイゼーションごとに 2 本のチューブがあり、1 本は青色、もう 1 本は赤色になります。各サンプルのチューブを組み合わせ、ピペッティングで混合します。

次に、溶液全体をMicroConメンブレンに移します。付属のMicroConチューブにカラムを入れ、13, 000 Gで10分間回転させます。MicroConカラムはサイズ排除カラムであり、組み込まれた副次的色素でDNAをトラップし、組み込まれていない色素をメンブレンを通して洗浄します。

残留の未取り込まれたヌクレオチドまたはサイドを洗浄するには、200マイクロリットルの滅菌蒸留水をメンブレンに加えます。.13, 000 Gで再び10分間回転させます。チューブを廃棄し、45マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液をMicroCon濃縮器カラムの上部に加えます。

私たちが使用するハイブリダイゼーションソリューションは、ロシュサイエンティフィックのDig Easyです。5マイクロリットルの共有ニシン精子も溶液に追加することができます。従来、これはスライド表面への非競合的結合をブロックするために使用されていました。新しい結合物質の出現により、このステップの排除が可能になりました。

ただし、ハイブリダイゼーション溶液の粘度を上げるために添加されることがあります。MicroConカラムを反転させ、新しい標識チューブに入れます。チューブを3000Gで3分間回転させます。

溶液は新しいチューブの底に溜まります。1.5マイクロリットルの溶液は、SDインコーポレーションの定量化に使用されます。NanoDrop To microarray analysisを空白に設定します。

1.5マイクロリットルのディグを備えたNanoDrop。簡単なハイブリダイゼーションバッファー。NanoDropでブランクを測定します。

読み取り値は 0 である必要があります。キムワイプでブランクワイプを取り外し、サンプルメジャーの1.5マイクロリットルを追加し、サンプルの組み込みを記録します。NanoDropは、S3とsci-fi染料の両方のマイクロリットル濃度あたりのPICAモルを提供します。

マイクロリットルあたり3オーレは、Fluor fourが少なすぎると考えるべきです 続行するために、NanoDropは波長に対する吸光度のグラフを表示します。2つのピークが見えるように、サイドアイごとに1つずつ、NanoDropを水とキムワイプで拭いて清掃します。カバーをスライドウォーマーまたはヒートブロックにスリップして置き、摂氏45度に予温してハイブリダイゼーション温度を維持します。

42マイクロリットルのプローブ溶液を22mm×60mmのカバースリップに置きます。溶液に気泡がないことを確認してください。頑固な泡を取り除く簡単な方法は、新しいカバースリップを取り、鋭い角で泡をポップすることです。

スライドをカバースリップとプローブ溶液に合わせます。スライドの一方の端を下げて、ハイブリダイゼーション溶液との接触を可能にします。カバースリップが表面張力でスライドに取り付けられるまで、一方の端を下げ続けます。

スライドを反転させます。スライドをハイブリダイゼーションカセットに入れ、摂氏45度に予温し、湿度を制御するために下部の溝に10マイクロリットルの水を追加します。このステップは、掘削が低温で結晶化し、スライドに背景を残すため、練習する必要があります。

これは、溶液がスライド上にある場合、液体の非常に薄い層であるため、特に重要です。この時点で、カセットを密封し、摂氏45度で36〜40時間インキュベートします。ハイブリダイゼーションカセットからのスライドの除去は重要です。

掘ると、室温で簡単に結晶化します。スライドをすぐに浸し、カバースリップを洗浄液に取り除きます。すべての洗浄液は事前に作られている必要があり、pHが7つの非中性pHはサイドアイを劣化させる可能性があります。

洗浄液を摂氏45度に予温します。ハイブリダイゼーションチャンバーを開く前に、約60ミリリットルの洗浄液をコープランドジャーに加えます。チャンバーを開きます。

ピンセットでスライドを取り外し、スライドを洗浄液に加えます。カバースリップを取り付けたまま、10〜20秒待ってからピンセットでカバースリップを取り出します。滑り台から落ちるはずでした。

これは、掘削容易なバッファーが結晶化するのを防ぎ、カバースリップを機械的に除去することによりスライドの潜在的な引っかき傷を減らすため、重要なステップです。スライドを洗浄液で3回洗浄します。攪拌しながら各1分。

スライドを3回すすぎます。最後の洗浄後に見える洗浄液にSDSからの残留気泡があってはなりません。遠心分離する準備ができるまで、スライドを洗浄液に入れたままにします。

50ミリリットルのファルコンチューブに700Gで1分間遠心分離します。使用する前に、ファルコンチューブが乾いていることを確認してください。信号強度は時間の経過とともに減少するため、すぐにスライドをスキャンしてください。

周囲のオゾンレベルに応じて、すべてのスキャナーは異なりますが、従うべき共通のガイドラインがいくつかあります。スライドイメージング用。スキャンプロセスでは、周囲のオゾンレベルが重要です。

SFダイはオゾンに敏感で、長時間のスキャンで急速に劣化します。オゾンの5ppmがS5に影響を与えることが示されています。これは、晴れた日の軽い交通汚染に相当します。

オゾンメーターは、周囲のオゾンレベルを記録するために推奨されます。チャネルS3とSCI 5ごとに個別のイメージが作成されます。スキャナーの露光、時間、励起、入力、またはキャプチャ感度を変更することで、チャネルのバランスをとることができます。

これで、これらの画像を分析できるようになりました。